Name: שיטה משופרת לבידוד אתרי מגע מיטוכונדריאליים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-16T14:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: חקור אתרי מגע מיטוכונדריאליים המאפשרים תקשורת בין ממברנות המיטוכונדריה. גלה את תפקיד CQD1 ביצירת אתרי מגע חדשים ובייבור ליפידים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

M.E.H. מודה ל- Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), פרויקט מספר 413985647, לתמיכה כספית. המחברים מודים לד"ר מיכאל קיבלר, אוניברסיטת לודוויג-מקסימיליאן, מינכן, על תמיכתו הנדיבה והנרחבת. אנו אסירי תודה לוולטר נויפרט על תרומתו המדעית, הדיונים המועילים וההשראה המתמשכת שלו. J.F. מודה לבית הספר למוסמכים במדעי החיים במינכן (LSM) על התמיכה.

1. מאגרים ופתרונות מלאי
<ol><li>הכינו תמיסת 1 M 3-morpholinopropane-1-sulfonic acid (MOPS) במים שעברו דה-יוניזציה, pH 7.4. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C.</li>
	<li>הכן 500 mM ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) במים deionized, pH 8.0. יש לאחסן בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>הכינו סורביטול 2.4 מ 'במים נטולי יונים. יש לאחסן בטמפרטורת החדר לאחר האוטוקלאבינג.</li>
	<li>מכינים סוכרוז 2.5 מ 'במים deionized. יש לאחסן בטמפרטורת החדר לאחר האוטוקלאבינג.</li>
	<li>הכינו 200 mM פנילמתיל-סולפוניל פלואוריד (PMSF) באיזופרופנול. יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C. אזהרה: PMSF רעיל בבליעה וגורם לכוויות חמורות בעור ולנזק לעיניים. אין לנשום את האבק, וללבוש כפפות מגן ומשקפי מגן.</li>
	<li>הכינו 72% חומצה טריכלורואצטית (TCA) במים שעברו דה-יוניזציה. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C. אזהרה: TCA עלול לגרום לגירוי נשימתי, כוויות עור חמורות ונזק לעיניים. אין לנשום את האבק, וללבוש כפפות מגן ומשקפי מגן.</li>
	<li>הכן את מאגר SM: 20 mM MOPS ו 0.6 M סורביטול, pH 7.4.</li>
	<li>הכינו את מאגר הנפיחות: 20 mM MOPS, 0.5 mM EDTA, 1 mM PMSF וקוקטייל מעכב פרוטאז, pH 7.4.</li>
	<li>הכינו את מאגרי הסוכרוז ההדרגתיים: 0.8 M, 0.96 M, 1.02 M, 1.13 M ו-1.3 M סוכרוז ב-20 mM MOPS, ו-0.5 mM EDTA, pH 7.4. הערה: ניתן לאחסן את כל המאגרים ב- 4 °C; עם זאת, מומלץ לאחסן את המאגרים המכילים סוכרוז ב -20 מעלות צלזיוס כדי למנוע צמיחה פטרייתית. יש להוסיף את מעכבי הפרוטאז טריים לפני השימוש.</li>
</ol>2. יצירת שלפוחיות הגשה
<ol><li>בודדו את המיטוכונדריה של שמרים גולמיים טריים על פי פרוטוקולים 34,35 שנקבעו. הערה: עבור ניסוי זה, מיטוכונדריה בודדו מ Saccharomyces cerevisiae. אין צורך ביצירת מיטוכונדריה טהורה הדרגתית נטולת אברונים אחרים.</li>
	<li>השהה מחדש 10 מ"ג של מיטוכונדריה מבודדת טרייה במאגר SM של 1.6 מ"ל (4°C) על-ידי פיפטינג (איור 2, שלב 1).</li>
	<li>מעבירים את המתלה המיטוכונדריאלי לצלוחית Erlenmeyer מקוררת מראש בנפח 100 מ"ל.</li>
	<li>להוסיף לאט 16 מ"ל של חיץ נפיחות באמצעות פיפטה זכוכית 20 מ"ל. יש למרוח ערבוב עדין קבוע על קרח במהלך התוספת. טיפול אוסמוטי זה גורם לספיגת מים לחלל המטריצה. הנפיחות של הקרום הפנימי של המיטוכונדריה תשבש את הקרום החיצוני. אולם שני הקרומים יישארו בקשר באתרי הקשר9 (איור 2, שלב 2).</li>
	<li>יש לדגור על הדגימות תוך ערבוב עדין מתמיד במשך 30 דקות על קרח.</li>
	<li>הוסיפו באיטיות 5 מ"ל של תמיסת סוכרוז 2.5 מ"ל באמצעות פיפטת זכוכית 5 מ"ל כדי להעלות את ריכוז הסוכרוז בדגימות לכ-0.55 מ'. טיפול אוסמוטי זה גורם לשטף מים מהמטריצה36. התכווצות הקרום הפנימי נועדה למקסם את מרחקו לשברים השיוריים של הקרום החיצוני. זה מקטין את ההסתברות ליצור בועיות היברידיות מלאכותיות של קרומים פנימיים וחיצוניים באמצעות סוניקציה (איור 2, שלב 3).</li>
	<li>יש לדגור על הדגימות תוך ערבוב עדין במשך 15 דקות על קרח.</li>
	<li>העבירו את המיטוכונדריה לסוניקציה כדי ליצור בועיות קרום כניעה (איור 2, שלב 4).<ol><li>מעבירים את התרחיף המיטוכונדריאלי לתא רוזטה מקורר מראש.</li>
		<li>הפעילו את המתלה המיטוכונדריאלי באמפליטודה של 10% למשך 30 שניות תוך קירור תא הרוזטה באמבט קרח.</li>
		<li>הניחו את המתלה למשך 30 שניות באמבט קרח.</li>
		<li>חזור על שלב 2.8.2 ושלב 2.8.3 שלוש פעמים נוספות. הערה: תנאי הסוניקציה ישתנו בהתאם לסוניק שבו נעשה שימוש. אופטימיזציה יהיה צורך עבור מכונות בודדות. סוניקציה קשה מדי תוביל להיווצרות מלאכותית של שלפוחיות המורכבות מממברנות פנימיות וחיצוניות של המיטוכונדריה.</li>
	</ol></li>
</ol>3. הפרדת שלפוחיות submitochondrial
<ol><li>יש להפריד את השלפוחיות שנוצרו מהמיטוכונדריה הנותרת על ידי צנטריפוגה בטמפרטורה של 20,000 x גרם למשך 20 דקות ב-4°C. המיטוכונדריה השלמים ייפלטו ואילו השלפוחיות יישארו בסופרנטנט.</li>
	<li>רכזים את תערובת השלפוחית.<ol><li>מעבירים את הסופרנאטנט לצינורות אולטרה-צנטריפוגה טריים.</li>
		<li>טען כרית של 0.3 מ"ל של תמיסת סוכרוז 2.5 מ 'בתחתית הצינור באמצעות מזרק 1 מ"ל מצויד צינורית 0.8 מ"מ x 120 מ"מ.</li>
		<li>צנטריפוגה ב 118,000 x גרם במשך 100 דקות ב 4 ° C. הערה: כאן, רוטור דלי מתנדנד עם רדיוס מרבי של 153.1 מ"מ שימש. תנאי הצנטריפוגה תלויים מאוד ברוטור ויהיה צורך להתאים אותם כאשר נעשה שימוש ברוטור אחר.</li>
	</ol></li>
	<li>השלפוחיות יופיעו כדיסק בחלק העליון של כרית הסוכרוז לאחר הצנטריפוגה. השליכו כ-90% מהסופרנטנט. כעת, קצרו את הבועיות המרוכזות על ידי השעייתן מחדש במאגר שנותר כולל סוכרוז באורך 2.5 מ' על ידי פיפטציה מעלה ומטה. מעבירים את המתלה להומוגנייזר Dounce קר כקרח.</li>
	<li>הומוגניזציה של ההשעיה עם לפחות 10 שבץ באמצעות קדר polytetrafluoroethylene .</li>
	<li>מכינים את שיפוע הסוכרוז.<ol><li>עבור שיפוע מדרגות של 11 מ"ל עם חמישה שלבים (1.3 מ', 1.13 מ', 1.02 מ', 0.96 מ' וסוכרוז 0.8 מ' ב-20 מ"מ MOPS ו-0.5 מ"מ EDTA, pH 7.4), בכל שכבה יש 2.2 מ"ל של תמיסת סוכרוז. הערה: מומלץ להשתמש ברפרקטומטר כדי למדוד ולהתאים את ריכוזי הסוכרוז; עם זאת, זה לא חיוני. החל 10 μL של המאגר על הרפרקטומטר, וזהה את מדדי השבירה המתאימים. חישוב ריכוז הסוכרוז הוא כדלקמן: <img alt="משוואת ריכוז סוכרוז במולריות; תרשים לניתוח מדידת מקדם שבירה." src="/files/ftp_upload/65444/65444eq01v2.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 1"> 1.3333 מייצג את מדד השבירה של המים. 0.048403 הוא מדד המרה ספציפי לסוכרוז המתקבל מקנה מידה ליניארי של שבירה מולרית לריכוז סוכרוז בתמיסות מימיות 37.</li>
		<li>הוסף את ריכוז הסוכרוז הגבוה ביותר לצינור הצנטריפוגה, ושים את הצינור ב -20 מעלות צלזיוס. המתינו עד שהשכבה תוקפא לחלוטין לפני החלת השכבה הבאה. המשיכו בהתאם עד להוספת השכבה האחרונה, ואחסנו את מעברי הצבע ב -20 מעלות צלזיוס. הערה: זכור להעביר את מעברי הצבע הקפואים ל- 4 ° C בעת תחילת הניסוי כדי לאפשר למעברי הצבע להפשיר. זה ייקח בערך 3 שעות. עבור הצנטריפוגה כאן, רוטור דלי מתנדנד עם קיבולת של 13.2 מ"ל שימש. כאשר משתמשים ברוטור אחר, יש להתאים את נפחי מדרגות השיפוע בהתאם.</li>
	</ol></li>
	<li>למדוד את ריכוז הסוכרוז של הדגימות באמצעות רפרקטומטר. אם אין גישה לרפרקטומטר, אפשר לחילופין להניח שריכוז הסוכרוז הוא 2 מ'. ריכוז סוכרוז משוער זה יהיה הבסיס לשלב הבא.</li>
	<li>כוונן את ריכוז הסוכרוז ל 0.6 M על ידי תוספת של כמות מתאימה של 20 mM MOPS, 0.5 mM EDTA, 1 mM PMSF וקוקטייל מעכב פרוטאז, pH 7.4. אם ריכוז הסוכרוז מוערך כ-2 מ' במקום להימדד, מומלץ לבדוק האם הריכוז נמוך מספיק לאחר ההתאמה. החל aliquot קטן של הדגימה (כ 50 μL) על גבי 200 μL של 0.8 M סוכרוז במבחנה. הדגימה חייבת להישאר על גבי סוכרוז 0.8 M.</li>
	<li>טען את הדגימות (כ -1 מ"ל) על גבי שיפוע הסוכרוז (שמור 10% להתייחסות מאוחרת יותר). צנרת זהירה חשובה כדי למנוע הפרעה של שיפוע (איור 2, שלב 5).</li>
	<li>להפריד את שלפוחיות על ידי צנטריפוגה ב 200,000 x גרם ו 4 ° C במשך 12 שעות. במידת האפשר, כוונו את הצנטריפוגה להאטה ולהאטה כדי למנוע הפרעה של השיפוע (איור 2, שלב 6). הערה: כאן, רוטור דלי מתנדנד עם רדיוס מרבי של 153.1 מ"מ שימש. תנאי הצנטריפוגה תלויים מאוד ברוטור ויהיה צורך להתאים אותם כאשר נעשה שימוש ברוטור אחר.</li>
	<li>קצרו את השיפוע מלמעלה למטה בשברים של 700 מיקרוליטר באמצעות פיפטה של 1 מ"ל. התוצאה תהיה 17 שברים, מה שמאפשר רזולוציה מספקת.</li>
</ol>4. ניתוח שלפוחיות submitochondrial
<ol><li>רכז את החלבונים על ידי חשיפת כל שבר לשני משקעי TCA38 המבוצעים ברצף כדי להכין את דגימות SDS-PAGE.<ol><li>הוסף 200 μL של 72% TCA לשברים בודדים, וערבב עד התמיסה הומוגנית. לדגור על השברים במשך 30 דקות על קרח, ולזרוק את החלבונים המושקעים על ידי צנטריפוגה ב 20,000 x גרם ו 4 ° C במשך 20 דקות. השליכו את הסופרנטנט, הוסיפו 500 מיקרוליטר של תמיסת TCA 28%, ערבבו היטב וחזרו על שלב הצנטריפוגה.</li>
		<li>שטפו את הכדוריות עם 1 מ"ל אצטון (-20°C), וצנטריפוגה למשך 10 דקות בטמפרטורה של 20,000 x גרם ו-4°C. השליכו את הסופרנטנט, ותנו לכדוריות להתייבש. השהה מחדש את הכדוריות ב 60 μL של מאגר דגימת SDS, ודגר על הדגימות במשך 5 דקות ב 95 ° C. הערה: כמות גדולה של סוכרוז תישאר, במיוחד בשברים בעלי צפיפות גבוהה, לאחר משקעי TCA הראשונים. זה יוסר באמצעות משקעים TCA נוספים.</li>
	</ol></li>
	<li>נתח 20 μL של כל שבר על ידי SDS-PAGE39 ו immunoblotting40,41,42,43.</li>
</ol>

בידוד אתרי מגע מיטוכונדריאליים

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

תת-שבירה מיטוכונדריאלית היא ניסוי מסובך עם מספר שלבים מורכבים ביותר. לכן, כיוונו לשפר עוד יותר, ובמידה מסוימת, לפשט את השיטה המבוססת שלנו32. כאן, האתגרים היו הדרישה לציוד מסובך ומיוחד מאוד, שהם לעתים קרובות מבנים בודדים, ואת צריכת הזמן והאנרגיה העצומה. לשם כך ניסינו להסיר את המשאבות והקונסטרוקציות הבודדות ששימשו ליציקה ולקציר של השיפוע הליניארי ושינינו לשיפוע מדרגה. חשוב לציין שהבנו שלפחות כאשר מכינים אותו כפי שמתואר כאן, השיפוע הופך ליניארי במהלך הצנטריפוגה, מה שהופך אותו לתחליף תקף. שיטה זו (i) ...

מיטוכונדריה מבצעים מגוון תפקידים שונים באיקריוטים, כאשר הידוע ביותר הוא ייצור ATP באמצעות זרחן חמצוני. פונקציות אחרות כוללות ייצור של אשכולות ברזל-גופרית, סינתזת שומנים, ובאיקריוטים גבוהים יותר, איתות Ca2+, והשראת אפופטוזיס 1,2,3,4. פונקציות אלה קשורות באופן בלתי נפרד Ultrastructure מורכב שלהם.
מבנה העל המיטוכונדריאלי תואר לראשונה במיקרוסקופ אלקטרונים5. הוכח כי מיטוכונדריה הם אברונים מורכבים למדי המורכבים משני קרומים: הקרום החיצוני של המיטוכונדריה והקרום הפנימי של המיטוכונדריה. לפיכך, שני תאים מימיים נוצרים על ידי ממברנות אלה: החלל intermembrane ואת המטריצה. ניתן לחלק עוד יותר את הקרום הפנימי של המיטוכונדריה לחלקים שונים. קרום הגבול הפנימי נשאר בסמיכות לקרום החיצוני, והקריסטה יוצרת פלישות. מה שנקרא צמתי קריסטה מחברים בין קרום הגבול הפנימי לבין הקריסטה (איור 1). יתר על כן, מיקרוגרפים אלקטרוניים של מיטוכונדריה מכווצים אוסמוטית מגלים כי קיימים אתרים שבהם קרומי המיטוכונדריה מחוברים באופן הדוק 6,7. אתרי המגע האלה כביכול נוצרים על-ידי קומפלקסים חלבוניים המשתרעים על פני שני הממברנות (איור 1). נהוג לחשוב כי אתרי אינטראקציה אלה חיוניים לקיום התא בשל חשיבותם לוויסות הדינמיקה והתורשה של המיטוכונדריה, כמו גם להעברת מטבוליטים ואותות בין הציטוזול למטריצה8.
קומפלקס MICOS בקרום הפנימי של המיטוכונדריה הוא כנראה המאופיין ביותר והמורכב הרב-תכליתי ביותר ליצירת אתרי מגע. MICOS תואר בשמרים בשנת 2011, והוא מורכב משש תת-יחידות 9,10,1 1: Mic60, Mic27, Mic26, Mic19, Mic12 ו-Mic10. אלה יוצרים קומפלקס של כ 1.5 MDa אשר מתמקם לצמתיםcrista 9,10,11. המחיקה של אחת מתת-יחידות הליבה, Mic10 או Mic60, מובילה להיעדרו של קומפלקס 9,11, כלומר שתי תת-יחידות אלה חיוניות ליציבות של MICOS. באופן מעניין, MICOS יוצר לא רק אתר מגע אחד אלא גם אתרי מגע מרובים עם חלבונים וקומפלקסים שונים של הממברנה החיצונית של המיטוכונדריה: קומפלקס TOM 11,12, קומפלקס TOB/SAM 9,12,13,14,15,16, קומפלקס Fzo1-Ugo19,Por1 10, OM4510 ומירו 17. זה מצביע מאוד על כך שקומפלקס MICOS מעורב בתהליכים מיטוכונדריאליים שונים, כגון ייבוא חלבונים, מטבוליזם של פוספוליפידים ויצירת אולטרה-מבנה מיטוכונדריאלי18. הפונקציה האחרונה היא ככל הנראה הפונקציה העיקרית של MICOS, שכן היעדר קומפלקס MICOS המושרה באמצעות מחיקה של MIC10 או MIC60 מוביל לאולטרה-מבנה מיטוכונדריאלי חריג שחסר כמעט לחלוטין קריסטה סדירה. במקום זאת, שלפוחיות קרום פנימיות ללא חיבור לקרום הגבול הפנימי מצטברות19, 20. חשוב לציין, MICOS נשמר בצורה ובתפקוד משמרים לבני אדם21. הקשר של מוטציות בתת-יחידות MICOS עם מחלות אנושיות קשות מדגיש גם את חשיבותו לאיקריוטים גבוהים יותר22,23. למרות ש-MICOS הוא רב-תכליתי ביותר, חייבים להתקיים אתרי קשר נוספים (בהתבסס על התצפיות שלנו שלא פורסמו). ואכן, זוהו מספר אתרי מגע אחרים, למשל, מכונות האיחוי המיטוכונדריאלי Mgm1-Ugo1/Fzo1 24,25,26 או Mdm31-Por1, המעורבות בביוסינתזה של קרדיוליפין פוספוליפיד 27 ספציפי למיטוכונדריה. לאחרונה, שיפרנו את השיטה שהובילה אותנו לזיהוי MICOS לזיהוי Cqd1 כחלק מאתר קשר חדשני שנוצר עם קומפלקס הממברנה החיצונית Por1-Om1428. באופן מעניין, נראה כי אתר מגע זה מעורב גם בתהליכים מרובים כגון הומאוסטזיס של קרום המיטוכונדריה, מטבוליזם של פוספוליפידים והתפלגות קואנזים Q28,29.
כאן, השתמשנו בווריאציה של השבר שתואר קודם לכן של מיטוכונדריה 9,30,31,32,33. טיפול אוסמוטי במיטוכונדריה מוביל לשיבוש הקרום החיצוני של המיטוכונדריה ולהתכווצות חלל המטריצה, מה שמשאיר את שני הקרומים רק בסמיכות באתרי מגע. זה מאפשר יצירת שלפוחיות המורכבות אך ורק מהקרום החיצוני של המיטוכונדריה או מהקרום הפנימי של המיטוכונדריה או באתרי מגע של שני הממברנות באמצעות סוניקציה קלה. בשל היחס בין חלבון לשומנים בקרום הפנימי של המיטוכונדריה, שלפוחיות הקרום הפנימי של המיטוכונדריה מציגות צפיפות גבוהה יותר בהשוואה לשלפוחיות הקרום החיצוני של המיטוכונדריה. ההבדל בצפיפות יכול לשמש להפרדת שלפוחיות הממברנה באמצעות צנטריפוגה הדרגתית צפיפות ציפה סוכרוז. לפיכך, שלפוחיות הקרום החיצוני של המיטוכונדריה מצטברות בריכוזי סוכרוז נמוכים, בעוד שלפוחיות הקרום הפנימי של המיטוכונדריה מועשרות בריכוזי סוכרוז גבוהים. השלפוחיות שמכילות אתרי מגע מתרכזות בריכוזי סוכרוז בינוניים (איור 2). הפרוטוקול הבא מתאר בפירוט שיטה משופרת זו, הדורשת פחות ציוד, זמן ואנרגיה מיוחדים בהשוואה לשיטה32 שהוקמה בעבר, ומספק כלי שימושי לזיהוי חלבונים אפשריים באתר המגע.

<table><tbody><tr><td>13.2 מ"ל, צינור פתוח דק דופן אולטרה-ברור, 14 x 89 מ"מ</td><td>Beckman Instruments, גרמניה</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל, צינור פוליקרבונט פתוח עם קיר עבה, 29 x 104 מ"מ</td><td>Beckman Instruments, גרמניה</td><td>363647</td><td></td></tr><tr><td>A-25.50 רוטור זווית קבועה- אלומיניום, 8 x 50 מ"ל, 25,000 סל"ד, 75,600 x גרם</td><td>Beckman Instruments, גרמניה</td><td>363055</td><td></td></tr><tr><td>Abbe רפרקטומטר</td><td>Zeiss, גרמניה</td><td></td><td>הופסקה, ניתן להשתמש בכל רפרקטומטר Abbe</td></tr><tr><td>accu-jet pro Pipet Controller</td><td>Brandtech, ארה"ב</td><td>BR26320</td><td>הופסק, כל בקר פיפט יספיק</td></tr><tr><td>1000 מ"ל</td><td>DWK Life Science, גרמניה</td><td>C118.1</td><td></td></tr><tr><td>ברנסון&nbsp; סוניפייר דיגיטלי W-250 D</td><td>ברנסון אולטרסאונד, ארה"ב</td><td>FIS15-338-125</td><td></td></tr><tr><td>ברנסון אולטרסאונד 3 מ"מ TAPERED MICROTIP</td><td>ברנסון אולטרסאונד, ארה"ב</td><td>101-148-062</td><td></td></tr><tr><td>ברנסון אולטרסאונד 200 ו-400 וואט: תא קירור רוזטה</td><td>ברנסון אולטרסאונד, ארה"ב</td><td>15-338-70</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה אוונטי JXN-26</td><td>בקמן אינסטרומנטס, גרמניה</td><td>B37912</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge Optima XPN-100 ultra</td><td>Beckman Instruments, גרמניה</td><td>8043-30-0031</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete Proteaseinhibtor-Cocktail</td><td>Roche, Switzerland</td><td>11697498001</td><td></td></tr><tr><td>D-Sorbit</td><td>Roth , גרמניה</td><td>6213</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (חומצה אתילנדיאמין-טטראצטית דיסודיום מלח דיהידרט)</td> <td>Roth , גרמניה</td><td>8043</td><td></td></tr><tr><td>Erlenmeyer flask, 100 mL</td><td>Roth , גרמניה</td><td>X747.1</td><td></td></tr><tr><td>פיפטה מדורגת, ק"ל ב', 25:0, 0.1</td><td>הירשמן, גרמניה</td><td>1180170</td><td></td></tr><tr><td>פיפטה בוגרת, ק"ל ב', 5:0, 0.05</td><td>הירשמן, גרמניה</td><td>1180153</td><td></td></tr><tr><td>אמבטיית קרח</td><td>neoLab, גרמניה</td><td>&nbsp; S12651</td><td></td></tr><tr><td>בוחש מגנטי RCT בסיסי</td><td>IKA-Werke GmbH, גרמניה</td><td>Z645060GB-1EA</td><td></td></tr><tr><td>MOPS (3-(N-Morpholino)propanesulphonic acid)</td> <td>גרבו, גרמניה</td><td>1081</td><td></td></tr><tr><td>MyPipetman Select P1000</td><td>גילסון, ארה"ב</td><td>FP10006S</td><td></td></tr><tr><td>MyPipetman Select P20</td><td>גילסון, ארה"ב</td><td>FP10003S</td><td></td></tr><tr><td>MyPipetman Select P200</td><td>גילסון, ארה"ב</td><td></td><td></td>FP10005S</tr><tr><td>Omnifix 1 מ"ל</td><td>בראון, גרמניה</td><td>4022495251879</td><td></td></tr><tr><td>פנילמתיל-סולפוניל פלואוריד (PMSF)</td><td>סרווה, גרמניה</td><td>32395.03</td><td></td></tr><tr><td>צינורית STERICAN 21 Gx4 4/5 0.8x120 מ"מ</td><td>בראון, גרמניה</td><td>מוט</td> ערבוב 4022495052414<td></td></tr><tr><td>, 15 מ"מ</td><td>VWR, ארה"ב</td><td>442-0366</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>מרק, גרמניה</td><td>S8501</td><td></td></tr><tr><td>SW 41 Ti מתנדנד דלי רוטור</td><td>בקמן אינסטרומנטס, גרמניה</td><td>331362</td><td></td></tr><tr><td>מבחנות</td><td>אפנדורף, גרמניה</td><td>3810X</td><td></td></tr><tr><td>מטחנות רקמות, סוג פוטר-אלבהיים, כלי זכוכית 2 מ"ל</td><td>VWR, ארה"ב</td><td>432-0200</td><td></td></tr><tr><td>מטחנות רקמות, סוג פוטר-אלבהיים, בוכנה 2 מ"ל עם קצה משונן</td><td>VWR, ארה"ב</td><td>432-0212</td><td></td></tr><tr><td>חומצה טריכלורואצטית ( TCA)</td><td>סיגמא אולדריץ', גרמניה</td><td>33731</td><td>הופסק, כל TCA יספיק (CAS: 73-03-9)</td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Roth, גרמניה</td><td>4855</td><td></td></tr></tbody></table>

שיטה משופרת לבידוד אתרי מגע מיטוכונדריאליים

An Improved Method to Isolate Mitochondrial Contact Sites

מיטוכונדריה נמצאים כמעט בכל התאים האיקריוטים ומבצעים תפקידים חיוניים הרבה מעבר לייצור אנרגיה, למשל, סינתזה של צבירי ברזל-גופרית, שומנים או חלבונים, חציצה Ca2+ והשראת אפופטוזיס. כמו כן, תפקוד לקוי של המיטוכונדריה גורם למחלות אנושיות חמורות כמו סרטן, סוכרת וניוון עצבי. כדי לבצע את הפונקציות האלה, המיטוכונדריה צריכים לתקשר עם שאר התא דרך המעטפת שלהם, המורכבת משני קרומים. לכן, שני קרומים אלה צריכים לקיים אינטראקציה כל הזמן. אתרי מגע חלבוניים בין הקרומים הפנימיים והחיצוניים של המיטוכונדריה חיוניים מבחינה זו. עד כה אותרו מספר אתרי קשר. בשיטה המתוארת כאן, משתמשים במיטוכונדריה של Saccharomyces cerevisiae כדי לבודד אתרי מגע, ובכך לזהות מועמדים המתאימים לחלבוני אתר מגע. השתמשנו בשיטה זו כדי לזהות את אתר המגע המיטוכונדריאלי ואת קומפלקס מערכת ארגון הקריסטות (MICOS), אחד הקומפלקסים העיקריים ליצירת אתרי מגע בקרום הפנימי של המיטוכונדריה, אשר נשמר משמרים לבני אדם. לאחרונה, שיפרנו עוד יותר שיטה זו כדי לזהות אתר קשר חדשני המורכב מ- Cqd1 וממתחם Por1-Om14.

קל יחסית להפריד בין הקרומים הפנימיים והחיצוניים של המיטוכונדריה. עם זאת, הדור וההפרדה של שלפוחיות המכילות אתרי מגע הם הרבה יותר קשה. לדעתנו, שני שלבים הם קריטיים וחיוניים: תנאי הסוניקציה והשיפוע שבו נעשה שימוש.
בדרך כלל, מעברי צבע ליניאריים נחשבים כבעלי רזולוציה טובה יותר בהשוואה למעברי צבע של צעדים. עם זאת, הייצור שלהם לשחזור הוא מייגע דורש ציוד מיוחד. לכן, ביססנו שיטה ליצירת שיפוע צעדים עם הבדלים קטנים יחסית בין השלבים הבודדים (ראה שלב 3.5). שיערנו כי שיפוע המדרגות יאוזן בצנטריפוגה, וכתוצאה ...

אתרי מגע מיטוכונדריאליים הם קומפלקסים חלבוניים המקיימים אינטראקציה עם חלבוני הממברנה הפנימית והחיצונית של המיטוכונדריה. אתרים אלה חיוניים לתקשורת בין קרומי המיטוכונדריה, ולכן בין הציטוזול לבין המטריצה המיטוכונדריאלית. במאמר זה אנו מתארים שיטה לזיהוי מועמדים המתאימים לסוג מסוים זה של חלבונים.

Mitochondria are present in virtually all eukaryotic cells and perform essential functions that go far beyond energy production, for instance, the ...

אנו שואפים להבין את הפונקציה המולקולרית של אתרי מגע מיטוכונדריאליים, המאפשרים תקשורת בין שני הקרומים המיטוכונדריאליים. זהו למעשה תנאי מוקדם להבנת הפונקציה של ביוגנזה מיטוכונדריאלית ולכן, כדאיות התא. גילינו אתר מגע חדש בין הקרום הפנימי והחיצוני של המיטוכונדריה שנוצר על ידי Cqd1 ו-Om14-Por1.הנתונים שלנו מצביעים על כך שאתר זה עשוי לסייע ביבוא שומנים כמו חומצה פוספטידית. בהתבסס על זיהוי קומפלקס MICOS, תרמנו להבנה עמוקה יותר של האופן שבו נוצרת ארכיטקטורת קרום מיטוכונדריאלי. זה איפשר לנו לפתח מודל עבודה שמסביר כיצד נוצרות שתי הצורות של cristae מיטוכונדריאלי, lamellar ו tubular cristae.המחקר שלנו נעשה בעבר בשמרים. עם זאת, אנו משוכנעים כי היווצרות של ארכיטקטורה מיטוכונדריאלית נכונה חשובה גם עבור איקריוטים גבוהים יותר. לכן, השלב הבא במחקר שלנו הוא ניתוח התפקיד של רכיבי ארכיטקטורה מיטוכונדריאלית במודלים מורכבים יותר כגון נוירונים ראשוניים.

an-improved-method-to-isolate-mitochondrial-contact-sites

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

שיטה לבידוד מהיר של המיטוכונדריה מביופסיות רקמות יונקים מתוארת. כבד חולדה או תכשירי שרירי שלד היה הומוגני עם Dissociator רקמה מסחרי ומיטוכונדריה היו מבודדת על ידי סינון ההפרש דרך מסנני רשת ניילון. זמן בידוד מיטוכונדריאלי הוא &lt;30 דקות בהשוואה ל60-100 דקות תוך שימוש בשיטות אלטרנטיביות.

בידוד מהיר וטיהור של מיטוכונדריה להשתלה על ידי דיסוציאציה רקמות ודיפרנציאל סינון

שתואר כאן הוא שיטה לאיתור וללכמת חלבוני קרום חיצוני של המיטוכונדריה ידי immunolabeling של מיטוכונדריה מבודדת מרקמת מכרסמים וניתוח על ידי cytometry זרימה. שיטה זו ניתנת להארכה על מנת להעריך היבטים פונקציונליים של אוכלוסיות המיטוכונדריה.

Immunodetection של החלבונים בממברנה חיצוניים על ידי cytometry הזרימה של מיטוכונדריה מבודדת

השוואה של פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית בין דגימות מניבה מידע רב ערך על מצב התא. מתוארים שלבים מפורטים לבידוד מיטוכונדריה והערכת תגובה למעכבים ומנתקים באמצעות פלואורסצנטיות. השיטה והתועלת של פרוטוקול זה מומחשות על ידי שימוש בתרבית תאים ומודל בעלי חיים של מתח תאי.

בידוד וניתוח פונקציונלי של המיטוכונדריה מתאים בתרבית ורקמות עכבר

שיטות לביופסיה של lateralis vastus, הכנת המיטוכונדריה מטוהרת, ופרופיל respirometric מתוארות. השימוש בשרירים קטן נפח עושה בטכניקה זו מתאימה ליישומי מחקר קליניים.

ההכנה וRespirometric הערכה של המיטוכונדריה מבודדת מרקמת שריר שלד מתקבלת על ידי Percutaneous מחט ביופסיה

כאן, אנו מציגים שינוי של שיטה שדווחה בעבר המאפשרת בידוד של מיטוכונדריה איכותית ומטוהרת מכמויות קטנות יותר של שרירי שלד עכבר. הליך זה מביא למיטוכונדריה בצימוד גבוה שנושמים בתפקוד גבוה במהלך מבחני רספירומטירק מבוססי מיקרופלייט.

בידוד של המיטוכונדריה מכמויות מינימליות של שרירי שלד עכבר למדידות תפוקה גבוהה microplate נשימה

כמו המיטוכונדריה הם רק אחוז קטן של תא צמח, הם צריכים טיהור למגוון רחב של מחקרים. המיטוכונדריה ניתן לבודד מתוך מגוון איברי הצמח על ידי המגון, ואחריו דיפרנציאלית וצפיפות צנטריפוגה מעבר צבע כדי לקבל חלק מיטוכונדריאלי נקיים במיוחד.

בידוד, מדידות הנשימה של המיטוכונדריה מ תודרנית לבנה

כאן אנו מציגים פרוטוקול לחלץ, לפתור ולזהות supercomplexes מיטוכונדריאלי אשר ממזער את החשיפה לדטרגנטים וכחול Coomassie. פרוטוקול זה מציע איזון מיטבי בין רזולוציה, ושימור פעילויות אנזימים, תוך צמצום הסיכון לאובדן אינטראקציות חלבון לבנה-חלבון.

אלקטרופורזה היברידית ברורה/כחולה עבור הפרדה וניתוח של שרשרת נשימה מיטוכונדריאלי מערכות-העל

אנו מציגים פרוטוקול דו-שלבי לבידוד מיטוכונדריה באיכות גבוהה התואם לגילוי וכימות חלבונים בקנה מידה של פרוטאום. הפרוטוקול שלנו אינו דורש הנדסה גנטית ולכן מתאים לחקר מיטוכונדריה מכל תא ורקמות ראשוניים.

בידוד דו-שלבי ללא תגים של מיטוכונדריה לשיפור גילוי וכימות חלבונים

פרוטוקול זה מתאר טכניקה לניתוח של סופרקומפלקסים נשימתיים כאשר רק כמויות קטנות של דגימות זמינות.

בידוד מיטוכונדריה לניתוח סופר-קומפלקס מיטוכונדריאלי מדגימות רקמה קטנה ותרביות תאים 

מחקרים ביואנרגטיים ומטבוליים על מיטוכונדריה חשפו את תפקידם הרב-גוני במחלות רבות, אך שיטות הבידוד של אברונים אלה משתנות. השיטה המפורטת כאן מסוגלת לטהר מיטוכונדריה באיכות גבוהה ממקורות רקמה מרובים. האיכות נקבעת על ידי יחסי בקרת נשימה ומדדים אחרים המוערכים עם רספירומטריה ברזולוציה גבוהה.

בידוד מיטוכונדריאלי חזק מרקמת לב מכרסם 

חקור אתרי מגע מיטוכונדריאליים המאפשרים תקשורת בין ממברנות המיטוכונדריה. גלה את תפקיד CQD1 ביצירת אתרי מגע חדשים ובייבור ליפידים.

שיטה משופרת לבידוד אתרי מגע מיטוכונדריאליים

גלה סרטונים נוספים