Name: איתור נוגדנים מסוג כלבת, IgG ו-IgM באמצעות בדיקת נוגדנים פלואורסצנטיים עקיפים של כלבת (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-19T12:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: למדו את שיטת בדיקת הנוגדנים הפלואורסצנטיים העקיפים (IFA) לאיתור נוגדני כלבת מסוג IgG ו-IgM. שיטה זו מאפשרת הערכה מהירה של תגובת החיסון לאחר חשיפה או חיסון.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו אסירי תודה למרכז וודסוורת' של מחלקת הבריאות של מדינת ניו יורק על תמיכתו בפרויקט זה.

הפרוטוקול הבא אושר לשימוש אתי בדגימות אנושיות על ידי מחלקת הבריאות של מדינת ניו יורק מרכז וודסוורת' לפיתוח מבחנים, מספר אישור פרוטוקול #03-019.
1. בטיחות
<ol><li>לבשו ציוד מגן אישי (PPE), לפחות מגן עיניים (משקפיים או מגן פנים), מסכה כירורגית וכפפות ללא לטקס.</li>
	<li>יש לוודא כי אנשי הצוות מחוסנים לכלבת וכי הודגם טיטר של ≥0.5 IU/mL במהלך 6 החודשים האחרונים.</li>
</ol>2. הכנת שקופית אנטיגן
הערה: בצע את כל המניפולציות של וירוסים, CSF וסרום בארון בטיחות ביולוגית (BSC) תוך שימוש באמצעי זהירות אוניברסליים.
<ol><li>הכינו 20 מ"ל של תאי נוירובלסטומה של עכבר או BHK-21 לריכוז של 3.0 x 105 תאים/מ"ל במדיה החיונית המינימלית של Eagle בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי (EGM) ושמרו על קור עד לשימוש.</li>
	<li>הכינו את נגיף CVS-11 על ידי דילול ב-EGM לדילול עובד של 1.0 x 106.5 50% תרבית רקמה במינון זיהומי (TCID50) למיליליטר ושמרו על קור עד שהוא מוכן לשימוש. הערה: TCID50 נקבע על ידי שיטת ריד ומואנץ' שפורסמה בעבר5.</li>
	<li>נקו תא מגלשות לחות ומגלשות מיקרוסקופ מצופות היטב מפוליטטרה-פלואוראתילן (PTFE) עם 70% אתנול ואפשרו להן להתייבש באוויר ב-BSC.</li>
	<li>הוסף מים מזוקקים (dH2O) לרצועות נייר סופג בתא השקופיות כדי להבטיח שהלחות תישאר קבועה לאורך כל ההליך.</li>
	<li>באמצעות עיפרון, תייג כל שקופית לשימוש עם מספר הפריט, התאריך, סוג התא וכל מידע מזהה אחר הדרוש לאחסון, והנח בתא השקופיות. הערה: רוב הסמנים, העטים או התוויות לא יעמדו בשלב קיבוע האצטון העתידי (שלב 2.9).</li>
	<li>החל 50 μL של דילול וירוס על כל באר על שקופיות המיקרוסקופ עם פיפטה חוזרת. לאחר מכן, להחיל 50 μL של דילול תאים על כל באר, נזהר לא לזהם את קצה פיפטה עם הנגיף כבר על הבאר.</li>
	<li>סגור את תא מגלשת הלחות והנח אותו באינקובטור הלח ב 34-36 מעלות צלזיוס. להעריך את זיהום התא לאחר 24 שעות. הערה: בצע את שלבים 2.8-2.12 בשקופית אחת בלבד.</li>
	<li>הסירו את המגלשה מתא הלחות ושאפו בזהירות את הסופרנאטנט. שטפו את המגלשה בצנצנת קופלין מלאה במי מלח חוצצים בפוספט (PBS) למשך 2 דקות, ולאחר מכן הניחו למגלשה להתייבש באוויר.</li>
	<li>מניחים את המגלשה בצנצנת קופלין ומקבעים את המגלשה באצטון קר למשך שעה לפחות במקפיא של -20°C המאושר לחומרים דליקים. יש לבצע את כל הליכי יציקת האצטון וייבוש האוויר במכסה אדים.</li>
	<li>הניחו לאצטון להבהב והחליקו לייבוש. יש למרוח נוגדן פלואורסצנטי ישיר (DFA) מצומד שהוכן על פי הוראות היצרן על בארות המגלשה ולדגור במשך 30 דקות באינקובטור לח של 34-36 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>שטפו את המגלשה בצנצנות קופלין של PBS פעמיים למשך 2 דקות כל אחת. יבשו את המגלשה באוויר.</li>
	<li>הרכיבו מכסה עם 0.05 M Tris, 0.15 M NaCl (pH 9.0) ו-20% גליצרול, וקראו את השקופית באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בהגדלה של 200x כדי להעריך את הזיהום. אם התאים אינם נגועים בכ-50%, חזרו על שלבים 2.7-2.12 למחרת עד להגעה להדבקה הרצויה. הערה: הדבקה בתאים משוערת בהתבסס על הערכה חזותית של היחס בין תאים שליליים לתאים חיוביים לכלבת בשקופית היטב. תאים שליליים מופיעים בצבע אדום, בעוד תאים חיוביים מראים צביעה פלואורסצנטית ירוקה.</li>
	<li>הסר את שאר המגלשות מהאינקובטור ומתא הלחות. שאפו בזהירות את הסופרנאטנט מכל באר, ואז הניחו את המגלשות בצנצנת קופלין עם PBS למשך 1-2 דקות. ייבשו את המגלשות באוויר למשך כ-30 דקות. אחסן את המגלשות בטמפרטורה של -80°C עד שהן מוכנות לשימוש.</li>
</ol>3. הכנת מדגם
<ol><li>הכינו דילול מדגם של סרום המטופל או CSF לבדיקה. הכינו את הצמידות הדרושה לריכוז עבודה תקין מדולל ב-PBS עם 0.05% כחול אוונס. הערה: שמור את המצומד בחושך כדי לשמור על שלמות הפלואורופור לפני היישום</li>
</ol>4. נוהל IFA
<ol><li>הסר את המספר הדרוש של שקופיות אנטיגן מוכנות הדרושות לכל בדיקה ואפשר לשקופיות להפשיר ולהתייבש לחלוטין.</li>
	<li>מניחים את המגלשות בצנצנת קופלין ומקבעים את המגלשות באצטון קר למשך בין שעתיים ללילה במקפיא בטמפרטורה של -20°C המאושר לשימוש בחומרים דליקים. הסר את המגלשות מהאצטון ואפשר להן להתייבש באוויר.</li>
	<li>הניחו את המגלשות בקופסת לחות בתוך ה-BSC עם רצועות סופגות ספוגות dH2O לשמירה על לחות. יש למרוח 50 μL מכל דילול דגימה, דגימת בקרה או PBS על הבאר שנקבעה מראש. הערה: כל שקופית חייבת להכיל מספר מתאים של בארות דגימת מטופלים, בקרה חיובית, בקרה שלילית ובקרת תאי PBS היטב.</li>
	<li>מקם את תא מגלשת הלחות הסגור באינקובטור לח של 37°C, 5% CO2 . דגרו על המגלשות במשך 30 דקות, ואז הוציאו את תא מגלשות הלחות מהאינקובטור והכניסו אותו ל-BSC.</li>
	<li>השתמש בקצה שואף כדי לשאוף בזהירות את supernatant מכל באר, להבטיח לא להפריע monolayer התא. השתמש פיפטה טפטפת סטרילית כדי להחיל טיפה אחת של PBS על כל באר.</li>
	<li>חזרו על השאיפה הזהירה, ואז הניחו כל מגלשה בצנצנת קופלין מלאה ב-PBS ושטפו פעמיים במשך 15 דקות בסך הכל.</li>
	<li>החזירו את המגלשות לקופסת תא הלחות ומרחו 50 מיקרוליטר של נוגדנים אנטי-אנושיים מתאימים מצומדים לכל באר. חזור על שלבים 4.4 עד 4.6.</li>
	<li>אפשרו לשקופיות להתייבש באוויר, הרכיבו משטח כיסוי עם אמצעי הרכבה וקראו את השקופיות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.</li>
</ol>5. ניתוח שקופיות
<ol><li>דגימות כיתה המבוססות על דפוס הצביעה ועוצמת הפלואורסצנטיות בהשוואה לדגימות ביקורת חיוביות עם נוגדנים נגד כלבת שאומתו כגבוהים.</li>
	<li>דרגו את הדגימות בסולם של שלילי, 1+, 2+, 3+ ו-4+, כאשר תוצאה שלילית אינה מראה צביעה פלואורסצנטית ו-4+ מייצגת פלואורסצנטיות בצבע ירוק בהיר עם דפוס צביעה דומה לדגימות ביקורת חיוביות1. הערה: צבע התפוח הירוק חל רק על נוגדנים המסומנים בתווית FITC; הצבע משתנה בהתאם לבחירת הפלואורופור.</li>
	<li>הקצה לדגימות ערך נקודת קצה המיוצג על-ידי גורם הדילול שבו הדגימה מציגה ציון 1-2+. בדוק את הדגימות בגורם דילול גבוה יותר אם לא הגיעו לנקודת הסיום בבדיקה הראשונית.</li>
</ol>

גילוי מהיר ומוקדם של נוגדני כלבת להערכת התגובה החיסונית בחולה

<ol><li>Rupprecht, C. E., Fooks, A. R., Abela-Ridder, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+Techniques+in+Rabies.+Volume+1%5BTitle%5D)+AND+%22World+Health+Organization%22%5BJournal%5D)">Laboratory Techniques in Rabies. Volume 1.</a> World Health Organization. , Geneva. 232-245 (2018).</li>
<li>Moore, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+of+rabies+serology%3A+defining+context+of+interpretation%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Challenges of rabies serology: defining context of interpretation.</a> Viruses. 13 (8), 1516(2021).</li>
<li>Zajac, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+evaluation+of+a+rabies+enzyme-linked+immunosorbent+assay+%28ELISA%29+targeting+IgM+and+IgG+in+human+sera%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Development and evaluation of a rabies enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) targeting IgM and IgG in human sera.</a> Viruses. , 40-49 (2019).</li>
<li>Mills, D. J., Lau, C. L., Mills, C., Furuya-Kanamori, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+persistence+of+antibodies+and+boostability+after+rabies+intradermal+pre-exposure+prophylaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Travel+Medicine%22%5BJournal%5D)">Long-term persistence of antibodies and boostability after rabies intradermal pre-exposure prophylaxis.</a> Journal of Travel Medicine. 29 (2), (2022).</li>
<li>Ramakrishnan, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+50%25+endpoint+titer+using+a+simple+formula%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Determination of 50% endpoint titer using a simple formula.</a> World Journal of Virology. 5 (2), 85-86 (2016).</li>
<li>Rudd, R. J., Appler, K. A., Wong, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+cross-reactions+with+other+viral+encephalitides+in+the+indirect+fluorescent-antibody+test+for+diagnosis+of+rabies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Presence of cross-reactions with other viral encephalitides in the indirect fluorescent-antibody test for diagnosis of rabies.</a> Journal of Clinical Microbiology. 51 (12), 4079-4082 (2013).</li>
<li>Fooks, A. R., Jackson, A. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFooks%2C+AR+%22Rabies%3A+scientific+basis+of+the+disease+and+its+management%22">Rabies: scientific basis of the disease and its management</a>. , Academic Press. (2020).</li>
<li>Paldanius, M., Bloigu, A., Leinonen, M., Saikku, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+Chlamydia+pneumoniae-specific+immunoglobulin+A+%28IgA%29+antibodies+by+the+microimmunofluorescence+%28MIF%29+method%3A+comparison+of+seven+fluorescein-labeled+anti-human+IgA+conjugates+in+an+in-house+MIF+test+using+one+commercial+MIF+and+one+enzyme+immunoassay+kit%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Diagnostic+Laboratory+Immunology%22%5BJournal%5D)">Measurement of Chlamydia pneumoniae-specific immunoglobulin A (IgA) antibodies by the microimmunofluorescence (MIF) method: comparison of seven fluorescein-labeled anti-human IgA conjugates in an in-house MIF test using one commercial MIF and one enzyme immunoassay kit.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 10 (1), 8-12 (2003).</li>
<li>Rodriguez, M. C., Fontana, D., Garay, E., Prieto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+quantification+of+anti-rabies+glycoprotein+antibodies%3A+current+state+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Detection and quantification of anti-rabies glycoprotein antibodies: current state and perspectives.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 105 (18), 6547-6557 (2021).</li>
<li>Katz, I. S. S., Guedes, F., Fernandes, E. R., Dos Ramos Silva, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+aspects+of+rabies%3A+a+literature+review%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Immunological aspects of rabies: a literature review.</a> Archives of Virology. 162 (1), 3251-3268 (2017).</li>
<li>Moore, S. M., Hanlon, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rabies-specific+antibodies%3A+measuring+surrogates+of+protection+against+a+fatal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Rabies-specific antibodies: measuring surrogates of protection against a fatal disease.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 4 (3), 595(2010).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

בדיקת IFA מנצלת קומפלקס נוגדנים אנטיגן, המאפשר אתר תיוג כדי להמחיש נוגדנים ספציפיים לכלבת. תאי נוירובלסטומה או BHK נזרעים על שקופיות מיקרוסקופ מרובות בארות מצופות PTFE ומחוסנים בזן מעבדה של נגיף הכלבת CVS-11. ברגע שהחד-שכבה מתמזגת והתאים מגיעים להדבקה הרצויה של כ-50%, השקופיות מאוחסנות עד שהן מוכנות לשימוש6.
סרום המטופל או CSF מוחל על חד-שכבה של התא הנגוע ומודגר כדי לאפשר לכל נוגדנים ספציפיים לכלבת להיצמד לאנטיגןהנגיף 7. לאחר הליך שטיפה, מוחל נוגדן IgG או IgM אנטי-אנושי המסומן באופן פלואורסצנטי ונקשר לכל נוגדן הקשור לווירוס מיישום הדגימה. לאחר מכן ניתן לדמיין נוגדנים מסומנים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
כאשר מתכוננים לביצוע בדיקה זו, חשוב לקבוע את ההכנה הטובה ביותר של דגימות המטופל, בקרות וצימודים. דגימות ראשוניות של חולים נבדקו בגורם דילול נמוך או לא מדוללות כדי לבדוק נוכחות נוגדנים כלשהי. דגימות מזווגות, או דגימות שנבדקו בעבר, שהראו רמה גבוהה של נוגדנים, דוללו עוד יותר עד לנקודת הסיום. דילולים ראשוניים של דגימות מטופלים לבדיקת IgG הוכנו במדלל IFA זמין מסחרית. דגימות בדיקת IgM הוכנו בתחילה בריאגנט חסימת IgG זמין מסחרית. לאחר מכן הוכנו דילולים סדרתיים עבור שתי הבדיקות ב-PBS.
הבקרות ששימשו לבדיקה התקבלו ממקבלי PrEP ידועים של כלבת או מאנשים ללא היסטוריה של חיסון נגד כלבת. כל דגימות הבקרה נבדקו להימצאות נוגדנים לפני השימוש. בקרת IgG התקבלה ממקבל חיסון כלבת עם נוגדן מנטרל כלבת מבוסס שאושר על ידי FAVN. דגימת הבקרה החיובית IgM התקבלה ממקבל חיסון כלבת כשבועיים לאחר השלמת החיסון.
השימוש בצמידות מתאימה הוא היבט חיוני נוסף בביצוע מבחן IFA. הצמידות המשמשת לכל בדיקה תלויה ביעד איזוטיפ הנוגדנים עבור אותה בדיקה. במקרה זה, נעשה שימוש בנוגדנים אנטי-אנושיים מסוג IgG ונוגדני IgM אנטי-אנושיים הזמינים מסחרית. דילול נוגדנים מצומדים לעבודה נקבע לפני הבדיקה על סמך המלצת היצרן.
ישנם מספר שלבים מרכזיים בהליך שיבטיחו ביצוע מוצלח של בדיקת IFA, אולי החשוב ביותר הוא הכנת שקופיות אנטיגן. הגעה לכ-50% הדבקה מספקת שפע של אתרי קישור לנוגדנים זמינים, תוך יצירת בהירות בעת קריאה ודירוג דגימות. התאים השליליים לכלבת יוצרים רקע מנוגד כדי לדמיין טוב יותר נוגדנים מתויגים. צביעה לא ספציפית יכולה להוות בעיה גם בעת ביצוע צביעה פלואורסצנטית באמצעות מטריצות מדגם מורכבות, כגון סרום. השימוש בריאגנטים לנטרול IgG (למשל, Gullsorb) מסייע לצמצם כתמים לא ספציפיים עקב נוגדנים IgG מפריעים בעת הערכת נוכחות IgM8. הכנה נכונה של חומרים ושילוב ריאגנטים מיוחדים בהליך מסייעים בהפחתת כתמים בעייתיים תוך שמירה על תוצאות איכותיות.
פותחו שיטות בדיקה רבות המתמקדות בזיהוי, כימות וזיהוי נוגדנים לכלבת. כל אחת מהבדיקות הללו מציעה תוצאות שניתן להשתמש בהן בדרכים שונות בהתאם למידע המבוקש. בדיקת כלבת IFA היא כלי רב עוצמה לזיהוי איזוטיפים של נוגדנים ספציפיים לנגיף, והתוצאות יכולות להיות מוכנות תוך פרק זמן קצר יחסית בהשוואה לשיטות בדיקה אחרות, כגון בדיקות RFFIT ו- FAVN.
למרות שבדיקת IFA יכולה לזהות נוגדנים לכלבת בדגימה, היא אינה מספקת כימות סטנדרטי של הנוגדנים. בדיקת IFA מספקת גורם דילול בסרום בו מסתיים גילוי הנוגדנים. לשם השוואה, בדיקות RFFIT ו-FAVN מכמתות את יכולות הנטרול של נוגדנים בדגימה, והתוצאה היא טיטר של יחידות בינלאומיות (IU), המספק תוצאה מפורטת ומתוקננת יותר. תוצאות בדיקת FAVN או בדיקת RFFIT מדגימות נוכחות נוגדנים מנטרלים, אשר נקבעו כנוגדני IgG9. תפקידו של IgM בנטרול הפעילות נתפס כמוגבל בשל מבנהו10. לכן, בדיקות אלה אינן מזהות באופן ספציפי את נוכחותו של IgM.
סוג הבדיקה ותוצאתה יכולים להיות בעייתיים במקצת כאשר מיישמים אותם על בעיה ספציפית. הרעיון של רמת הגנה של נוגדנים מפני הידבקות בנגיף הכלבת אינו משמש עוד להערכת התגובה החיסונית לחיסון נגד כלבת. בעבר, תגובת הגנה הוגדרה כ- ≥0.5 IU. עם זאת, פרסומים עכשוויים מתייחסים בדרך כלל לתגובת הנוגדנים לאחר החיסון כמקובלת (≥0.5 IU) או לא מקובלת (<0.5 IU). כאמור, בדיקת IFA אינה מספקת נוגדנים ביחב"ל ואין להשתמש בה כדי להפיק רמת הגנה מפני כלבת. שימוש בבדיקת IFA בעת הערכת חולה שחלה בכלבת לא תמיד עלול לגרום לנוכחות נוגדנים חיובית עקב שינויים בתגובה החיסונית לאורך המחלה. בשל הקטלניות הקרובה ל-100% של זיהום בכלבת, חשוב לקחת בחשבון את הבדיקה וכמה מידע ניתן להפיק בבטחה מתוצאות אלה11. מסיבות אלה, תמיד עדיף להעריך את כל שיטות בדיקת נוגדני הכלבת ולקבוע מה עובד הכי טוב בתרחיש נתון.

בדיקת נוגדנים פלואורסצנטיים עקיפים לכלבת (IFA) משמשת לאיתור איזוטיפים שונים של נוגדנים ספציפיים לכלבת בסרה או בנוזל השדרה המוחי. זהו אחד מארסנל של בדיקות זמינות למעקב אחר חולה כלבת לפני המוות. זה שימושי במיוחד עבור גילוי מוקדם של נוגדנים כדי להעריך את התגובה החיסונית של המטופל לזיהום כלבת. כאשר נעשה בה שימוש בשילוב עם בדיקות אחרות, היסטוריית מקרים וסטטוס החיסון של המטופל, בדיקת IFA יכולה לסייע בקביעת חשיפה לנגיף הכלבת או חיסון1. מכיוון שבדיקת IFA מודדת IgM ו/או IgG, ערכי הנוגדן הספציפי יכולים להצביע על מסגרת זמן משוערת מחשיפה לאנטיגן1. בדיקה זו עשויה להיות שימושית ביישומים המפורטים או ביישומים אחרים שעדיין לא נחקרו.
ישנן מספר בדיקות סרולוגיות לכלבת זמינות. בדיקת עיכוב מיקוד פלואורסצנטי מהיר (RFFIT), בדיקת נטרול נגיף נוגדנים פלואורסצנטי (FAVN), או שינויים של אלה הן השיטות העיקריות למדידת נוגדנים מנטרלי נגיף הכלבת (RVNAs)1. עם זאת, בדיקות אלה אינן מבדילות נוגדנים IgM ו- IgG. כאשר הבחנה בין איזוטיפ נוגדנים חשובה בניטור התגובה החיסונית של הכלבת, נעשה שימוש בבדיקות כלבת IFA ובדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזים כלבת (ELISA), אך הן אינן מודדות RVNAs. למרות בדיקות IFA ו- ELISA ניתן להשתמש כדי לקבוע את נוכחותם של נוגדנים ספציפיים כלבת בדגימה, ישנם כמה הבדלים באופן שבו הם מבוצעים. בדיקת IFA משתמשת בנגיף חי בתרבית תאים כמצע האנטיגן שלו, בעוד שבדיקת ELISA טיפוסית לגילוי כלבת משתמשת באחד או יותר מהחלבונים הנגיפיים. בסביבת מעבדה שבה ניתן לגדל את נגיף הכלבת, ניתן לבצע את בדיקת IFA בקלות רבה יותר במקום לרכוש או לטפח חלבונים נגיפיים בודדים עבור ELISA. יש לקחת בחשבון את מטרת הבדיקה ואת המידע המתקבל מתוצאות כל בדיקה סרולוגית של כלבת בעת ההחלטה באיזו בחירה2.
IgM הוא הראשון להגיב, גדל עד החלפת בכיתה נצפתה בסביבות היום 28, אז IgG הופך נוגדןבמחזור 3 השולט. לפיכך, IgM צפוי רק לפרק זמן מוגבל לאחר חשיפה לנגיף הכלבת או חיסון. בדיקת הסרום והנוזל השדרתי (CSF) יכולה להצביע אם החשיפה הייתה באמצעות חיסון, שבו נוגדנים ייראו רק בסרה, או מזיהום ויראלי, שעשוי להראות נוגדנים ב- CSF1.
הוכח כי נוגדנים לכלבת נמשכים מספר שנים לאחר טיפול מונע לפני חשיפה (PrEP)4. בדיקת IFA יכולה להיות כלי שימושי להדגים זאת בנקודות זמן שונות לאחר החיסון או החשיפה.

<table><tbody><tr><td>כיסוי זכוכית 25x55 מ"מ מחליק</td><td>כל</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אצטון</td><td>כל</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אנטי אנושי IgG מתויג מצומד</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9512</td><td></td></tr><tr><td>אנטי אנושי IgM מתויג מצומד</td><td>SeraCare</td><td>5230-0286</td><td></td></tr><tr><td>קצה פיפטה שואב</td><td>כל</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BHK-21 תאים</td><td>ATCC</td><td>CCL-10</td><td></td></tr><tr><td>BION IFA מדלל</td><td>MBL BION</td><td>DIL-9993</td><td></td></tr><tr><td>תרבית תאים מים</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>W3500</td><td>EGM</td></tr><tr><td>צנצנות קופלין</td><td>כל</td><td></td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442</td><td>EGM</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם מסנן FITC</td><td>כל</td><td></td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G7893</td><td></td></tr><tr><td>Mountant Gullsorb IgM מגיב אינאקטיבציה</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>23-043-158</td><td>IgG מגיב אינאקטיבציה</td></tr><tr><td>L-גלוטמין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G-7513</td><td>EGM</td></tr><tr><td>מינימום עיט מדיה חיוני &ndash; עם ארל מלחים, L-גלוטמין וחומצות אמינו לא חיוניות, ללא נתרן ביקרבונט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0643</td><td>EGM</td></tr><tr><td>תאי נוירובלסטומה של עכבר</td><td>ATCC</td><td>CCL-131</td><td></td></tr><tr><td>מגלשות זכוכית ציפוי PTFE מרובות בארות</td><td>כל</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>כל</td><td></td><td>pH 7.6&nbsp;</td></tr><tr><td>פניצילין</td><td>Sigma</td><td>P-3032</td><td>EGM</td></tr><tr><td>כלבת ישיר נוגדן פלואורסצנטי מצומד</td><td>Millipore Sigma</td><td>5100, 5500, 6500, RU5100 או RU5500</td><td></td></tr><tr><td>נתרן ביקרבונט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-5761</td><td>EGM</td></tr><tr><td>נתרן כלוריד גבישים</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td> טפטפת <td>סטרילית הרכסה</td></tr><tr><td></td><td>כל</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מלח סטרפטומיצין סולפט</td><td>סיגמא</td><td>S9137</td><td>EGM</td></tr><tr><td>Trizma גבישים מוגדרים מראש pH 9.0</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S9693</td><td></td></tr><tr><td>מרק פוספט טריפטוז</td> רנטנט <td>BD</td><td>260300</td><td>EGM</td></tr><tr><td>תערובת ויטמינים</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>M6895</td><td>EGM</td></tr></tbody></table>

איתור נוגדנים מסוג כלבת, igg ו-igm באמצעות בדיקת נוגדנים פלואורסצנטיים עקיפים של כלבת

Detection of Rabies IgG and IgM Antibodies Using the Rabies Indirect Fluorescent Antibody Test

בדיקת נוגדנים פלואורסצנטיים עקיפים לכלבת (IFA) פותחה כדי לאתר איזוטיפים שונים של נוגדנים ספציפיים לכלבת בסרה או בנוזל השדרה המוחי. בדיקה זו מספקת תוצאות מהירות וניתן להשתמש בה כדי לזהות נוגדנים לכלבת במספר תרחישים שונים. בדיקת IFA לכלבת שימושית במיוחד לגילוי מהיר ומוקדם של נוגדנים להערכת התגובה החיסונית בחולה שחלה בכלבת. למרות ששיטות אחרות לאבחון כלבת לפני המוות מקבלות עדיפות, ניתן להשתמש בבדיקה זו כדי להדגים את החשיפה האחרונה לנגיף הכלבת באמצעות זיהוי נוגדנים. בדיקת IFA אינה מספקת נוגדנים מנטרלי וירוסים (VNA), אך ניתן להעריך את התגובה המונעת לפני חשיפה (PrEP) באמצעות נוכחות נוגדנים חיובית או שלילית. בדיקה זו יכולה לשמש במצבים שונים ויכולה לספק תוצאות למספר מטרות שונות. במחקר זה, השתמשנו במספר דגימות סרום מזווג מאנשים שקיבלו PrEP והדגמנו את נוכחות נוגדני הכלבת שלהם לאורך זמן באמצעות בדיקת IFA.

כל דגימות הסרום נאספו מהמטופלים בערך באותן מסגרות זמן לאחר PrEP. הדגימות נבדקו מחמישה חולים שונים בנקודות הזמן הבאות: שבועיים לאחר החיסון הסופי נגד כלבת, 6 חודשים לאחר סדרת חיסוני הכלבת ו-18 חודשים לאחר סדרת חיסוני הכלבת. כל דגימת סרום דוללה בסדרות ודורגה הן עבור נוכחות IgM והן עבור נוכחות IgG, כמתואר בשלבי פרוטוקול 5.2 ו-5.3. ערך הנוגדנים שהוקצה מייצג את גורם הדילול שבו הדגימה הגיעה לציון נקודת קצה של 1-2+.
התוצאות מהבדיקה בכל נקודת זמן לאחר PrEP מדגימות את היכולת של הבדיקה לזהות רמות משתנות של נוכחות נוגדנים. זמן קצר לאחר החיסון הראשוני, רמות גבוהות של IgM ו-IgG היו נוכחות בדגימות החולים, כפי שניתן לראות באיור 1. אזורים של צביעת תאים פלואורסצנטיים בצבע ירוק בהיר מצביעים על נוכחות נוגדנים חיובית; תאים אדומים הם תאים שליליים לכלבת שבהם שום נוגדן לא יכול להיקשר. כ-6 חודשים לאחר החיסון, רמות נמוכות משמעותית של IgM ו-IgG היו נוכחות בדגימות החולים, אך IgM נשר כמעט לחלוטין. בנקודת הזמן הסופית, 18 חודשים לאחר החיסון, נוגדנים מסוג IgM לא זוהו באף דגימת מטופל, כפי שמודגם באיור 2 שבו לא נצפתה צביעה של תאים פלואורסצנטיים ירוקים. עם זאת, רמות IgG נמשכו ונשארו דומות לרמות שזוהו בנקודת הזמן של 6 חודשים לאחר הירידה הראשונית מנקודת הזמן של שבועיים. התוצאות לזיהוי IgG ו-IgM בדגימות משבועיים לאחר החיסון, 6 חודשים לאחר החיסון ו-18 חודשים לאחר החיסון מפורטות בטבלה 1, טבלה 2 וטבלה 3, בהתאמה. איור 3 מציג את תרשים הזרימה של שלבי הביצוע.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65459/65459fig01.jpg"> איור 1: צביעה חיובית של כלבת IgM IFA. סרום המטופל בדילול 1:8 הדגים דפוס צביעה חיובי זמן קצר לאחר השלמת סדרת חיסוני PrEP. סרגל קנה המידה בתמונה מייצג 100 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65459/65459fig01large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65459/65459fig02.jpg"> איור 2: כלבת IgM IFA צביעה שלילית. סרום המטופל בדילול 1:2 לא הראה כתמים חיוביים כ-18 חודשים לאחר השלמת סדרת חיסוני PrEP. סרגל קנה המידה בתמונה מייצג 100 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65459/65459fig02large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65459/65459fig03.jpg"> איור 3: תרשים זרימה של כלבת IFA. תרשים זרימה המציג את שלבי הביצוע של השלבים העיקריים בהליך IFA כדי לסייע בתצוגה חזותית של תהליכים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65459/65459fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>דגימת מטופל</td>
			<td>IgM</td>
			<td>IgG</td>
		</tr><tr><td>PS1-1</td>
			<td>1:32</td>
			<td>1:512</td>
		</tr><tr><td>PS2-1</td>
			<td>1:8</td>
			<td>1:128</td>
		</tr><tr><td>PS3-1</td>
			<td>1:16</td>
			<td>1:256</td>
		</tr><tr><td>PS4-1</td>
			<td>1:64</td>
			<td>1:512</td>
		</tr><tr><td>PS5-1</td>
			<td>1:16</td>
			<td>1:128</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 1: תוצאות שבועיים לאחר החיסון. תוצאות דגימות המטופלים מדגימות סרום שנאספו כשבועיים לאחר השלמת סדרת חיסוני PrEP.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>דגימת מטופל</td>
			<td>IgM</td>
			<td>IgG</td>
		</tr><tr><td>PS1-2</td>
			<td>1:2</td>
			<td>1:128</td>
		</tr><tr><td>PS2-2</td>
			<td>1:1</td>
			<td>1:128</td>
		</tr><tr><td>PS3-2</td>
			<td>1:1</td>
			<td>1:64</td>
		</tr><tr><td>PS4-2</td>
			<td>1:1</td>
			<td>1:256</td>
		</tr><tr><td>PS5-2</td>
			<td>1:1</td>
			<td>1:32</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 2: תוצאות 6 חודשים לאחר החיסון. תוצאות דגימות המטופלים מדגימות סרום שנאספו כ-6 חודשים לאחר השלמת סדרת חיסוני PrEP.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>דגימת מטופל</td>
			<td>IgM</td>
			<td>IgG</td>
		</tr><tr><td>PS1-3</td>
			<td>לא זוהה</td>
			<td>1:128</td>
		</tr><tr><td>PS2-3</td>
			<td>לא זוהה</td>
			<td>1:128</td>
		</tr><tr><td>PS3-3</td>
			<td>לא זוהה</td>
			<td>1:64</td>
		</tr><tr><td>PS4-3</td>
			<td>לא זוהה</td>
			<td>1:64</td>
		</tr><tr><td>PS5-3</td>
			<td>לא זוהה</td>
			<td>1:32</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 3: תוצאות 18 חודשים לאחר החיסון. תוצאות דגימות המטופלים מדגימות סרום שנאספו כ-18 חודשים לאחר השלמת סדרת חיסוני PrEP.

מטרת כתב היד היא לבחון את השימוש בבדיקת נוגדנים פלואורסצנטיים עקיפים לכלבת לאיתור נוגדנים ספציפיים לכלבת מסוג IgG ו-IgM.

איתור נוגדנים מסוג כלבת, IgG ו-IgM באמצעות בדיקת נוגדנים פלואורסצנטיים עקיפים של כלבת

The rabies indirect fluorescent antibody (IFA) test was developed to detect various rabies-specific antibody isotypes in sera or cerebral spinal fluid. ...

בדיקת IFA מעריכה את תגובת הנוגדנים במהלך הידבקות בכלבת או מעריכה את התגובה החיסונית מחיסונים. ניתן להשתמש בו כדי לבסס נוכחות נוגדנים בדגימה ולהבחין אילו איזוטיפים של נוגדנים קיימים. בדיקות נוגדנים מנטרלים הן תקן הזהב לזיהוי נוגדנים לכלבת כדי להעריך נוגדנים אצל אדם שקיבל טיפול מונע לפני או אחרי החשיפה.למרות שבדיקת IFA עשויה להניב תוצאות שונות מאשר בדיקת נוגדנים מנטרלים, היא עדיין יכולה לספק מידע בעל ערך כאשר משתמשים בה כחלופה. בדרך כלל, בדיקות המודדות נוגדנים מנטרלי כלבת מעריכות את התגובה החיסונית. עם זאת, בדיקות אלה אורכות מספר ימים, ודורשות תרבית וירוסים ותאים חיים.בדיקת IFA מאפשרת הכנה מתקדמת של שקופיות אנטיגן לבדיקה עם תוצאות תוך מספר שעות לעומת ימים. שימוש בבדיקות IFA במקרים של כלבת אנושית עשוי להוביל לתשובות נוספות על האופן שבו המערכת החיסונית של הפרט מגיבה לזיהום כלבת. קיימת שונות רבה בין המקרים, ובדיקה זו יכולה לספק תוצאות בזמן אמת במהלך המחלה.

detection-rabies-igg-igm-antibodies-using-rabies-indirect-fluorescent

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

סרטון זה מדגים צביעה אימונוהיסטוכימית לזיהוי אנטיגן של נגיף הכלבת ברקמת מוח עכבר נגועה. התהליך כולל דה-פרפיניזציה וטיפול באלכוהול, ולאחר מכן טיפול פרוטאוליטי לשיפור נגישות האנטיגן. צביעה אימונוהיסטוכימית מגלה משקעים אדומים, המאשרים את נוכחותם של אנטיגנים כלבת בסעיף הרקמות.

מכתים אימונוהיסטוכימיים לזיהוי אנטיגנים של נגיף הכלבת

מבחן אימונוהיסטוכימיה מהירה ישירה (DRIT) מציע ארגון עולמי לבריאות בעלי חיים וארגון הבריאות העולמי (OIE/מי) המזוהה נגד נוגדן פלורסנט ישירה (DFA) מבחן לאבחון כלבת. בדיקה זו מאפשרת יישומים מבוססי שדה שניתן לבצע בתוך כ 1 שעות על רשמים במוח באמצעות מיקרוסקופ אור.

מעקב משופר כלבת באמצעות מבחן אימונוהיסטוכימיה ישירה מהירה

כאן אנו מתארים בעקיפין כריך מחלה אימונואפלטיוט כדי לקבוע את התוכן החיסוני גליקופרוטאין בחיסון כלבת. מבחן זה משתמש נוגדן מונושבטיים (mAb-D1) לזהות גליקופרוטאין טרימרס. זוהי חלופה למבחן vivo NIH לבצע את העקביות של עוצמת החיסון במהלך הייצור.

בדיקת מחוץ גופית מבחן להערכת כלבת חיסון עוצמת

אנו מציגים פרוטוקול מלאה לאבחון שלאחר המוות של כלבת בעלי חיים תחת תנאי שדה באמצעות מבחן חיסוני מהיר האבחון (RIDT), מן הבדיקה ביופסיה המוח לפרשנות הסופי. אנו גם לתאר יישומים נוספים באמצעות המכשיר לניתוח מולקולרי הגנוזות ויראלי.

שדה הנתיחה לאחר המוות חיסוני מהיר מבחן אבחון עבור הגדרות מוגבלות משאב עם יישומים מולקולריים נוספים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול בדיקת אימונוהיסטוכימיה לגילוי אנטיגן וירוס כלבת כמבחן אבחון חלופי לרקמות קבועות פורמרין.

בדיקת אימונוהיסטוכימיה לגילוי אנטיגן ליסוירוס מרקמות קבועות פורמלין

פרוטוקול זה מציג גישה מבוססת qRT-PCR לקביעת מספר עותק הגן נוקלאופרוטאין (N) של וירוס הכלבת בתוך מבנים אנטומיים שונים במוח שור באמצעות שעתוק במבחנה.

כמויות של וירוס כלבת במבני מוח שור שונים

סינתזה של נוגדנים חד-שבטיים אנושיים היא הצעד הראשון במחקרים שמטרתם לחשוף את המנגנונים הפתופיזיולוגיים של תגובות חיסוניות בתיווך נוגדנים עצמיים. פיתחנו פרוטוקול ליצירת נוגדנים חד-שבטיים רקומביננטיים של אימונוגלובולין G (IgG) מתאי B ממוינים בדם, כולל בידוד תאי B, שיבוט נוגדנים וסינתזה במבחנה.

דור של רקומביננטי אדם IgG נוגדנים חד שבטיים מתאים הממוינים B הונצחו

אנו מציגים פרוטוקול לזיהוי חלקיקי חלבון המכילים אנטיגנים לנוגדני IgM אנושיים ועכברים עם שרשראות קלות ספציפיות של קאפה (Vκ). פרוטוקול זה אינו מוגבל לנוגדנים מסוג IgM אלא חל על כל האיזוטיפים של אימונוגלובולין המכוונים לאנטיגן שלהם עם זיקה גבוהה מספיק במהלך משקעים חיסוניים.

ספציפי כריכת נוגדן עבור קאפה (Vκ) שרשרת המכילה באור אנושי (IgM) נוגדנים: Polysialic החומצה (PSA) מצורפים NCAM כמקרה מבחן

אנו מתארים כאן שיטה ליצירת מיקרו-מערכי אנטיגן הניתנים להתאמה אישית שניתן להשתמש בהם לזיהוי בו-זמני של נוגדנים עצמיים IgG ו-IgM בסרום מבני אדם ועכברים. מערכים אלה מאפשרים זיהוי תפוקה גבוהה וכמותית של נוגדנים כנגד אנטיגנים או אפיטופים מעניינים.

דור שני צבעים Antigen Microarrays לאיתור סימולטני של IgG ו- IgM נוגדנים עצמיים

השיטה על-חרוז תיוג נוגדנים עם מולקולות קטנות מאפשרת סימון של כמות קטנה של נוגדנים ישירות תקשורת תא. שיטה זו תואמת אמין וכימית תיאול, ואת יכולה להתמודד עם דגימות מרובות במקביל, באופן ידני או באמצעות פלטפורמות אוטומטיות.

תיוג נוגדן עם צבעי ניאון באמצעות חלבון מגנטי חלבון G חרוזים

למדו את שיטת בדיקת הנוגדנים הפלואורסצנטיים העקיפים (IFA) לאיתור נוגדני כלבת מסוג IgG ו-IgM. שיטה זו מאפשרת הערכה מהירה של תגובת החיסון לאחר חשיפה או חיסון.

איתור נוגדנים מסוג כלבת, IgG ו-IgM באמצעות בדיקת נוגדנים פלואורסצנטיים עקיפים של כלבת

גלה סרטונים נוספים