Name: עותק יחיד של גן לוקוס כרומטין טיהור ב Saccharomyces cerevisiae (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-11-17T13:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: למדו בידוד כרומטין ספציפי ללוקוס ב-Saccharomyces cerevisiae לחקר אינטראקציות חלבון-דנ"א. שיטה זו מאפשרת עשרות מונים של העשרת הלוקוס הממוקד ללא צלב קושר.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

העבודה במעבדת S.H. נתמכה על ידי DFG באמצעות SFB1064 (מזהה פרויקט 213249687), מועצת המחקר האירופית (ERC Starting Grant 852798 ConflictResolution) והלמהולץ Gesellschaft.

בידוד כרומטין ספציפי ללוקוס מתאי שמרים

<ol><li>Kornberg, R. D., Lorch, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Twenty-five+years+of+the+nucleosome%2C+fundamental+particle+of+the+eukaryote+chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Twenty-five years of the nucleosome, fundamental particle of the eukaryote chromosome.</a> Cell. 98 (3), 285-294 (1999).</li>
<li>Gauchier, M., van Mierlo, G., Vermeulen, M., Déjardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+enrichment+of+specific+chromatin+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Purification and enrichment of specific chromatin loci.</a> Nature Methods. 17 (4), 380-389 (2020).</li>
<li>Korthout, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+the+chromatin+proteome+of+a+single+genomic+locus+by+DNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Decoding the chromatin proteome of a single genomic locus by DNA sequencing.</a> PLoS Biology. 16 (7), e2005542(2018).</li>
<li>Antão, J. M., Mason, J. M., Déjardin, J., Kingston, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+landscape+at+Drosophila+melanogaster+telomere-associated+sequence+repeats%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein landscape at Drosophila melanogaster telomere-associated sequence repeats.</a> Molecular and Cellular Biology. 32 (12), 2170-2182 (2012).</li>
<li>Déjardin, J., Kingston, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+proteins+associated+with+specific+genomic+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Purification of proteins associated with specific genomic loci.</a> Cell. 136 (1), 175-186 (2009).</li>
<li>Ide, S., Dejardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((End-targeting+proteomics+of+isolated+chromatin+segments+of+a+mammalian+ribosomal+RNA+gene+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">End-targeting proteomics of isolated chromatin segments of a mammalian ribosomal RNA gene promoter.</a> Nature Communications. 6, 6674(2015).</li>
<li>Unnikrishnan, A., Gafken, P. R., Tsukiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+changes+in+histone+acetylation+regulate+origins+of+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26amp%3B+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Dynamic changes in histone acetylation regulate origins of DNA replication.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 17 (4), 430(2010).</li>
<li>Buxton, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidating+protein-DNA+interactions+in+human+alphoid+chromatin+via+hybridization+capture+and+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Elucidating protein-DNA interactions in human alphoid chromatin via hybridization capture and mass spectrometry.</a> Journal of Proteome Research. 16 (9), 3433-3442 (2017).</li>
<li>Kennedy-Darling, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+chromatin-associated+proteins+via+sequence-specific+capture+and+mass+spectrometric+protein+identification+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Discovery of chromatin-associated proteins via sequence-specific capture and mass spectrometric protein identification in Saccharomyces cerevisiae.</a> Journal of Proteome Research. 13 (8), 3810-3825 (2014).</li>
<li>Liu, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPRi-based+genome-scale+identification+of+functional+long+noncoding+RNA+loci+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CRISPRi-based genome-scale identification of functional long noncoding RNA loci in human cells.</a> Science. 355, 7111(2017).</li>
<li>Hamperl, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+specific+chromatin+domains+from+single-copy+gene+loci+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Functional+Analysis+of+DNA+and+Chromatin%22%5BJournal%5D)">Purification of specific chromatin domains from single-copy gene loci in Saccharomyces cerevisiae.</a> Functional Analysis of DNA and Chromatin. 1094, 329-341 (2014).</li>
<li>Hamperl, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compositional+and+structural+analysis+of+selected+chromosomal+domains+from+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Compositional and structural analysis of selected chromosomal domains from Saccharomyces cerevisiae.</a> Nucleic Acids Research. 42 (1), 2(2014).</li>
<li>Weiβ, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-copy+locus+proteomics+of+early-+and+late-firing+DNA+replication+origins+identifies+a+role+of+Ask1%2FDASH+complex+in+replication+timing+control%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Single-copy locus proteomics of early- and late-firing DNA replication origins identifies a role of Ask1/DASH complex in replication timing control.</a> Cell Reports. 42 (2), 112045(2023).</li>
<li>Gietz, R. D., Schiestl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+yeast+transformation+using+the+LiAc%2FSS+carrier+DNA%2FPEG+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method.</a> Nature Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li>
<li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets%3A+procedure+and+some+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li>
<li>Western blot membrane stripping for restaining protocol. Abcam. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.abcam.com/protocols/western-blot-membrane-stripping-for-restaining-protocol">https://www.abcam.com/protocols/western-blot-membrane-stripping-for-restaining-protocol</a> (2023).</li>
<li>Vermeulen, M., Déjardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locus-specific+chromatin+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Locus-specific chromatin isolation.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 21 (5), 249-250 (2020).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

זיהוי הגורמים ונוף הכרומטין של אזור גנומי מטרה ספציפי ממשיך להוות אתגר מרכזי במחקר הכרומטין18. פרוטוקול זה מתאר מערכת יעילה לכריתה וטיהור ספציפית של תחומי כרומטין נפרדים מכרומוזומי שמרים. למיטב ידיעתנו, הטוהר והתשואה של טיהור חד-שלבי זה מתגברים על רבות מהמגבלות של שיטות טיהור כרומטין ספציפיות ללוקה, ובכך מאפשרים השגת העשרה גבוהה מאוד של מוקדי המטרה בהשוואה לאזורים גנומיים אחרים שאינם קשורים.
בשל שלב הכריתה הנוסף באמצעות R-רקומבינאז ספציפי לאתר, יתרון נוסף הוא שניתן לקבו...

הארגון הדינמי של גנומים אאוקריוטים לכרומטין דוחס את הדנ"א כך שיתאים לגבולות הגרעין תוך הבטחת דינמיקה מספקת לביטוי גנים ונגישות לגורמים רגולטוריים. בין השאר, רב-תכליתיות זו מתווכת על ידי הנוקלאוזום, היחידה הבסיסית של כרומטין, המורכבת מחלקיק ליבה עם 147 bp של DNA עטוף ~ 1.7 פעמים סביב אוקטמר היסטון1. הנוקלאוזום, הוא מבנה דינמי מאוד ביחס להרכבו, עם גרסאות היסטון רבות ושינויים פוסט-תרגומיים (PTM) על זנבות ההיסטון N ו-C. יתר על כן, כרומטין אאוקריוטי מקיים אינטראקציה עם מספר רב של מרכיבים חיוניים אחרים, כגון גורמי שעתוק, מכונות עיבוד DNA ו- RNA, חלבונים ארכיטקטוניים, אנזימים המעורבים בעיצוב מחדש ושינוי של כרומטין, ומולקולות RNA הקשורות לכרומטין. מכונות חיוניות אלה המעורבות בשעתוק, שכפול ותיקון דורשות גישה לכרומטין, המשמש כמצע הטבעי לתהליכים אלה. כתוצאה מכך, הבנת המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס עסקאות דנ"א אלה מחייבת הגדרה מדויקת של השינויים הקולקטיביים במבנה הכרומטין באזורים הגנומיים הספציפיים שבהם מכונות אלה מתכנסות ומאפשרות תגובות ביולוגיות.
למרות הזיהוי של גורמי כרומטין רבים באמצעות גנטיקה ומחקרי אינטראקציה חלבון-חלבון, ביצוע ניתוחים ישירים, בלתי משוחדים ומקיפים של אינטראקציות כרומטין באתרים גנומיים מסוימים נותר מכשול משמעותי 2,3. בתחילה, ניתן היה לבודד רק אזורים שופעים מאוד של הגנום (כלומר, לוקי חוזר) או פלסמידים מרובי עותקים בכמויות וטוהר מספיקים לזיהוי ספקטרומטרי מסה של החלבונים הקשורים 4,5,6,7. סדרה של גישות חדשות המבוססות על הכלאה ישירה של גשושיות לכידה לדנ"א כרומטיני, ביוטינילציה של קרבה באמצעות מערכת CRISPR-dCas9, או קשירה של חלבוני מתאם ספציפיים לרצף למוקד העניין החלו לפענח את הפרוטאום של אתרים בעלי עותק יחיד מגנומים של שמרים ויונקים 8,9,10. עם זאת, כל השיטות הללו דורשות הצלבת פורמלדהיד כדי לייצב את אינטראקציות החלבון-דנ"א וסוניקציה כדי להמיס את הכרומטין לטיהור לאחר מכן. יחד, שתי המניפולציות שוללות את האפשרות של מחקרים מבניים ופונקציונליים הבאים של הכרומטין המטוהר.
כדי להתגבר על מגבלות אלה, פיתחנו בעבר מתודולוגיה המשתמשת ברקומבינציה ספציפית לאתר כדי לחלץ תחומים כרומוזומליים ממוקדים משמרים11,12. בעיקרו של דבר, האזור הגנומי המעניין מוקף באתרי זיהוי (RS) עבור R-רקומבינאז ספציפי לאתר מ- Zygosaccharomyces rouxi ובו זמנית משלב קבוצה של שלושה אתרי קישור DNA עבור חלבון מדכא השעתוק הפרוקריוטי LexA (LexA) באותו אזור. תאי השמרים מכילים קסטת ביטוי לביטוי סימולטני של R-רקומבינאז וחלבון LexA המאוחה לתג טיהור זיקה טנדם (TAP). לאחר השראת R-רקומבינאז, האנזים מוציא ביעילות את אזור המטרה מהכרומוזום בצורה של תחום כרומטין מעגלי. ניתן לטהר תחום זה באמצעות חלבון מתאם LexA-TAP, הנקשר לאתרי קשירת הדנ"א של LexA, כמו גם לתמיכה באהדה. שיטה זו שימשה לאחרונה לבידוד תחומי כרומטין נפרדים המכילים מקורות שכפול נבחרים של כרומוזום שמרים III13.
אחד היתרונות העיקריים של גישת ex vivo זו הוא שהיא מאפשרת ניתוחים פונקציונליים של החומר המבודד. לדוגמה, תחומי מקור שכפול שטוהרו בשיטה זו יכולים להיות נתונים למבחני שכפול חוץ גופיים כדי להעריך את יעילות ירי המקור במבחנה מתבניות כרומטין מורכבות מקוריות in vivo . בסופו של דבר, האפיון הביוכימי והפונקציונלי של החומר המבודד עשוי לאפשר בנייה מחדש של תהליכים גרעיניים באמצעות חלבונים מטוהרים יחד עם תבנית הכרומטין המקורית. לסיכום, מתודולוגיה זו פותחת אפיק מרתק במחקר הכרומטין, שכן ניתן יהיה לעקוב אחר השינויים הקולקטיביים בהרכב ובמבנה הכרומטין של אזור גנומי מסוים העובר טרנזקציה כרומוזומלית מסוימת.

<table><tbody><tr><td><זני שמרים>חזקים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><חזקים>זן שליטה:</חזק> MATa; ura3&Delta; 0; leu2&דלתא; 0; his3&דלתא; 1; met15&דלתא; 0; bar1::kanMX4; Chr I 212kb::LEU2 pTEF2-LEXA-TAP pGAL1-10 RecR</td><td></td><td></td><td>סעיף 1, ראה הפניות 13 ו-14</td></tr><tr><td>Recombination Strain: MATa; ura3&Delta; 0; leu2&דלתא; 0; his3&דלתא; 1; met15&דלתא; 0; bar1::kanMX4; RS_LEXA_NS-3_ARS316_NS+3_RS; Chr I 212kb::LEU2 pTEF2-LEXA-TAP pGAL1-10 RecR</td><td></td><td></td><td>סעיף 1, ראה הפניה 13 ו-14</td></tr><tr><td><חזק>פלסמיד</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>K238 פלסמיד</td><td></td><td></td><td>סעיף 1, ראה התייחסות 13 אחסון: אחסן ב-20 &deg; C</td></tr><tr><td>K071 ספייק ב-DNA</td><td></td><td></td> פלסמיד <td>סעיף 7.1, ראה התייחסות 13 אחסון: אחסן ב-20 מעלות; C</td></tr><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Carl Roth</td><td>5025.1</td><td>Section 2 אחסון: יש לאחסן בטמפרטורת החדר</td></tr><tr><td>אמוניום אצטט (NH4Ac)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7262</td><td>סעיף 6 ו-7.1 אחסון: יש לאחסן בטמפרטורת החדר</td></tr><tr><td>תמיסת אמוניום (NH4OH) 25%</td> <td>Merck Millipore</td><td>533003</td><td>סעיף 6 אחסון: יש לאחסן בטמפרטורת החדר</td></tr><tr><td>אמוניום גופרתי</td><td>Santa Cruz</td><td>Sc-29085</td><td>Section 2 אחסון: יש לאחסן בטמפרטורת החדר</td></tr><tr><td>Bacto agar</td><td>BD (VWR)</td><td>90000-760</td><td>Section 3 אחסון: יש לאחסן בטמפרטורת החדר</td></tr><tr><td>Bacto peptone</td><td>BD (VWR)</td><td>211820</td><td>Section 3 אחסון: יש לאחסן בטמפרטורת החדר</td></tr><tr><td>&בטא;-מרקפטואתנול</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>07604</td><td>סעיף 7.2 אחסון: יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; </td></tr><tr><td>C ערכת מצע כימילומינסנט</td><td>ThermoFisher</td><td>34580</td><td>סעיף 7.2 אחסון: יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C</td></tr><tr><td>די-נתרן מימן פוספט דודקהידראט</td><td>Merck</td><td>1.06579.1000</td><td>סעיף 2 ו-7.1 אחסון: יש לאחסן בטמפרטורת החדר</td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>ThermoFisher</td><td>15508013</td><td>Section 4 אחסון: יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C</td></tr><tr><td>אתנול</td><td>Merck</td><td>100983</td><td>סעיף 7.1 אחסון: יש לאחסן בטמפרטורת החדר</td></tr><tr><td>חומצה אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>ED סעיף 7.1 אחסון: יש לאחסן בטמפרטורת החדר</td></tr><tr><td>גלקטוז (20% (w/v) מלאי)Sigma</td> <td>Aldrich</td><td>G0625-1KG&nbsp; /&nbsp; 5KG</td><td>יחידה 3 אחסון: יש לאחסן בטמפרטורת החדר ג'ל</td></tr><tr><td> טוען צבע (6x)</td><td>BioLabs</td><td>B7024A</td><td>סעיף 7.1 אחסון: יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; C</td></tr><tr><td>Glusose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>Section אחסון: יש לאחסן בטמפרטורת החדר</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Carl Roth.0079.4</td><td></td> <td>Section 2 אחסון: יש לאחסן בטמפרטורת החדר</td></tr><tr><td>גליקוגן (5 מ"ג/מ"ל)</td><td>Invitrogen</td><td>AM9510</td><td>סעיף 7.1 אחסון: יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; C</td></tr><tr><td>חומצה הידרוכלורית (HCl)</td> <td>PanReac AppliChem</td><td>182109.1211</td><td>סעיף 2, 4 ו-7.1 אחסון: יש לאחסן בטמפרטורת</td></tr><tr><td>החדר מגנזיום אצטט (MgAc)</td><td>Bernd Kraft</td><td>15274.2600/C035</td><td>Section 4 אחסון: יש לאחסן בטמפרטורת</td></tr><tr><td>החדר מגנזיום כלוריד (MgCl2)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8266</td><td>סעיף 6 אחסון: יש לאחסן בטמפרטורת החדר</td></tr> Nu <tr><td>PAGE LDS sample buffer (4x)</td><td>Invitrogen</td><td>2399549</td><td>Section 7.2 אחסון: יש לאחסן בטמפרטורת החדר</td></tr><tr><td>פנול/כלורופורם/איזואמיל אלכוהול (25:24:1 v/v)</td> <td>Invitrogen</td><td>15593-031</td><td>סעיף 7.1 אחסון: יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C</td></tr><tr><td>אשלגן כלורי (KCl)</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td>סעיף 4 אחסון: אחסן בטמפרטורת</td></tr><tr><td>החדר מסומן רדיואקטיבי &alpha;-32P dATP (3,000 Ci/mmol, 10 mCi/mL)</td><td>Hartmann Analytic</td><td>SRP-203</td><td>Section 7.1 אחסון: אחסן ב-4 מעלות; </td></tr><tr><td>מערכת תיוג C RadPrime</td><td>ThermoFisher</td><td>18428-011</td><td>סעיף 7.1 אחסון: אחסן ב-20 מעלות; C</td></tr><tr><td>רפינוז (20% (w/v) מלאי)</td> <td>SERVA</td><td>34140.03</td><td>סעיף 3 אחסון: יש לאחסן בטמפרטורת החדר</td></tr><tr><td>נתרן כלורי (NaCl)</td><td>Merck</td><td>K53710504142</td><td>סעיף 7.1 אחסון: יש לאחסן בטמפרטורת החדר</td></tr><tr><td>נתרן ציטראט (Na3C6H5O7)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71402</td><td>סעיף 7.1 אחסון: יש לאחסן בטמפרטורת החדר</td></tr><tr><td>נתרן הידרוקסיד (NaOH)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5881</td><td>סעיף 7.1 אחסון: יש לאחסן בטמפרטורת החדר</td></tr><tr><td>נתרן n-דודציל סולפט (SDS) (5% מלאי (w/v))Alfa</td> <td>Aesar</td><td>A11183</td><td>סעיף 7.1 אחסון: יש לאחסן בטמפרטורת החדר</td></tr><tr><td>נתרן פוספט מונו-בסיסי</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71496</td><td>סעיף 2 ו-7.1 אחסון: יש לאחסן בטמפרטורת החדר</td></tr><tr><td>נתרן&nbsp; אזיד</td><td>סנטה קרוז&nbsp; ביוטכנולוגיה</td><td>sc-208393</td><td>סעיף 2 אחסון: אחסן ב-20 מעלות; C</td></tr><tr><td>&nbsp; טריאתילאמין</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>90340</td><td>סעיף 2 אחסון: יש לאחסן בטמפרטורת החדר</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Chem Cruz</td><td>SC-3715B</td><td>Section 2 ו-4 אחסון: יש לאחסן בטמפרטורת החדר</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td>Section 2 ו-4 אחסון: יש לאחסן בטמפרטורת החדר</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Bernd Kraft</td><td>18014332</td><td>סעיף 4 אחסון: יש לאחסן בטמפרטורת החדר</td></tr><tr><td>תמצית שמרים</td><td>BD (VWR)</td><td>212720</td><td>סעיף 3 אחסון: יש לאחסן בטמפרטורת</td></tr><tr><td>החדר גורם הזדווגות שמרים אלפא (1 ומיקרו; גרם/מ"ל מלאי )</td><td>&nbsp; Biomol</td><td>Y2016.5</td><td>סעיף 3 אחסון: יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; C</td></tr><tr><td>שמרים סינתטיים נשירה בינונית תוספי תזונה ללא LEUCINE</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y1376</td><td>סעיף 1, ראה התייחסות 14</td></tr><tr><td><חזק>אנזימים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HpaI אנזים הגבלה (5,000 U/mL)</td><td>NEB</td><td>R0105S</td><td>סעיף 7.1 אחסון: יש לאחסן ב-20 מעלות; </td></tr><tr><td>קוקטייל מעכב פרוטאז ופוספטאז C (100x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>78446</td><td>סעיף 4 אחסון: אחסן ב-4 מעלות; C</td></tr><tr><td>פרוטאינאז K (10 מ"ג/מ"ל)</td> <td>SERVA</td><td>33756</td><td>סעיף 7.1 אחסון: יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; C</td></tr><tr><td>RNase A (10 מ"ג/מ"ל)</td><td>&nbsp; ThermoFisher</td><td>EN0531</td><td>סעיף 7.1 אחסון: יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; </td></tr><tr><td>C TEV פרוטאז (10000 U/&micro; L)</td> <td>NEB</td><td>P8112S</td><td>סעיף 5 אחסון: אחסן ב-20 מעלות; C</td></tr><tr><td>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BcMag חרוזים מגנטיים המופעלים על ידי אפוקסי</td><td>Bioclone Inc.</td><td>FC-102</td><td>סעיף 2 אחסון: אחסן ב-4 מעלות; C</td></tr><tr><td>קרח</td><td></td><td></td> יבש <td>קטע 4</td></tr><tr><td>צינורות צנטריפוגה בעלי קשירה נמוכה 2.0 מ"ל</td><td>Eppendorf</td><td>22431102</td><td>סעיף 4</td></tr><tr><td>מיקרוספין&nbsp; עמודות G-25</td><td>Cytiva</td><td>27-5325-01</td><td>סעיף 7.1 אחסון: אחסן בטמפרטורת החדר</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Merck</td><td>P7793</td><td>סעיף 4</td></tr><tr><td>קרום ניילון חיובי</td><td>ביוזול</td><td>11MEMP0001</td><td>סעיף 7.1 אחסון: אחסן בטמפרטורת החדר</td></tr><tr><td>קרום העברת PVDF</td><td>Immobilon-Merck Millipore</td><td>IPVH00010</td><td>סעיף 7.2 אחסון: אחסן בחדר טמפרטורה</td></tr><tr><td>SDS-PAGE ג'ל 4-12% ביס-טריס (15 באר, 1.5 מ"מ)</td><td>Invitrogen</td><td>&nbsp; NP0336BOX</td><td>סעיף 7.2 אחסון: אחסן ב-4 מעלות; </td></tr><tr><td>מזרק C (25 מ"ל) עם התאמת לואר</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>4200-000V0</td><td>סעיף 3</td></tr><tr><td>נייר Whatman (גיליון נייר תאית 3 מ"מ CHR)</td> <td>Cytiva</td><td>3030-917</td><td>סעיף 7.1 אחסון: יש לאחסן בטמפרטורת החדר</td></tr> <tr><td><חזק>נוגדנים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אנטי-LexA, IgG פוליקלונלי של ארנב, נוגדן אזור קשירת DNA</td><td>Merck Millipore</td><td>06-719</td><td>סעיף 7.2 אחסון: אחסן ב-20 מעלות; C</td></tr><tr><td>עז נגד ארנב IgG (H+L), חזרת פרוקסידאז מצומד</td><td>Invitrogen</td><td>G21234</td><td>סעיף 7.2 אחסון: יש לאחסן ב-20 מעלות; </td></tr><tr><td>C נוגדן פרוקסידאז נגד פרוקסידאז (PAP) המיוצר בארנב לזיהוי חלבונים מתויגים TAP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1291-500UL</td><td>סעיף 7.2 אחסון: יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; </td></tr><tr><td>C Rabbit IgG נוגדנים</td><td>Sigma</td><td>I5006-100MG</td><td>סעיף 2 אחסון: יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; </td></tr><tr><td>Cפריימרים (10 ומיקרו; M)</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><חזק>ARS316:</חזק> fwd 5'- CGGCATTATCGTACACAACCT, rev 5'- GTTCTTCGTTGCCTACATTTTCT</td><td></td><td></td><td>סעיף 7.1</td></tr><tr><td><חזק>K071 DNA פלסמיד ספייק-אין: </חזק> fwd: 5'-TTTTCGCTGCTTGTCCTTTT, rev 5'- CATTTTCGTCCTCCCAACAT</td><td></td><td></td><td>סעיף 7.1</td></tr><tr><td><חזק>שבר PCR מ-DNA גנומי של שמרים כתבנית &nbsp; להגברה של ARS316 (לכתם דרומי):</חזק> fwd 5'- AAATTCTGCCCTTGATTCGT&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; rev 5'- TTTGTTTATCTCATCACTAAT</td><td></td><td></td><td>סעיף 7.1</td></tr><tr><td><חזק>PDC1:</חזק> fwd 5'- CATGATCAGATGGGGCTTCA, rev 5'-ACCGGTGGTAGCGACTCTGT</td><td></td><td></td><td>סעיף 7.1</td></tr><tr><td><חזק>ציוד</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מטחנת קפה</td><td>Gastroback</td><td>42601</td><td>סעיף 4</td></tr><tr><td>בקבוק דיואר</td><td>NAL GENE</td><td>4150-2000</td><td>סעיף 3</td></tr><tr><td>מתלה מגנטי DynaMag TM-2</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td>סעיף 4, 5 ו-6</td></tr><tr><td>תנור היברידיזציה</td><td>Hybaid Mini10</td><td>Ri418</td><td>סעיף 2</td></tr><tr><td>מיקרוצנטריפוגה</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td>סעיף 4 ו-7.1</td></tr><tr><td>צולב UV</td><td>Analytikjena</td><td>95-0174-02</td><td>סעיף 7.1</td></tr></tbody></table>

עותק יחיד של גן לוקוס כרומטין טיהור ב saccharomyces cerevisiae

Single-Copy Gene Locus Chromatin Purification in Saccharomyces cerevisiae

היחידה הארגונית הבסיסית של הכרומטין האיקריוטי היא חלקיק הליבה הנוקלאוזומי (NCP), המורכב מדנ"א עטוף ~1.7 פעמים סביב אוקטמר היסטון. כרומטין מוגדר כישות של NCPs וקומפלקסים חלבוניים רבים אחרים, כולל גורמי שעתוק, עיצוב מחדש של כרומטין ושינוי אנזימים. עדיין לא ברור כיצד אינטראקציות חלבון-דנ"א אלה מתוזמרות ברמה של אתרים גנומיים ספציפיים במהלך שלבים שונים של מחזור התא. זה בעיקר בשל המגבלות הטכניות הנוכחיות, אשר מקשות על השגת מדידות מדויקות של אינטראקציות דינמיות כאלה. כאן, אנו מתארים שיטה משופרת המשלבת רקומבינציה ספציפית לאתר עם פרוטוקול טיהור זיקה יעיל בצעד אחד כדי לבודד מוקד גן בעל עניין בעותק יחיד במצב הכרומטין הטבעי שלו. השיטה מאפשרת העשרה איתנה של מוקד המטרה על פני כרומטין, מה שהופך טכניקה זו לאסטרטגיה יעילה לזיהוי וכימות אינטראקציות חלבונים באופן בלתי משוחד ושיטתי, למשל על ידי ספקטרומטריית מסות. בהמשך לניתוחי הרכב כאלה, כרומטין טבעי שטוהר בשיטה זו משקף ככל הנראה את המצב in vivo בנוגע למיקום נוקלאוזומים ושינויים בהיסטון, ולכן ניתן לבצע ניתוחים מבניים וביוכימיים נוספים של כרומטין הנגזר כמעט מכל מוקד גנומי בשמרים.

הטיהור של תחום הכרומטין ARS316 ~ 1.4 kb תווך על ידי חלבון מתאם LexA-TAP המתבטא באופן מכונן . כדי לשמש כבקרה שלילית, ביצענו טיהור באמצעות זן איזוגני המבטא LexA-TAP אך אינו מכיל אתרים משולבים של RS ו-LexA. איור 3 מדגים את תוצאות ניתוח הדנ"א מניסוי טיהור סטנדרטי שבוצע הן על קבוצת הבקרה והן על זן בעל יכולת רקומבינציה המכוון למוקד ARS316. לאחר בידוד DNA והגבלת עיכול אנזימים כדי להפוך את מולקולות הדנ"א המעגליות לליניאריות, בוצע ניתוח qPCR כדי להעריך את יעילות הטיהור של מוקד המטרה ARS316 על פני מוק...

פרוטוקול זה מציג שיטת בידוד כרומטין ספציפית ללוקוס המבוססת על רקומבינציה ספציפית לאתר כדי לטהר מוקד גן בעל עניין של עותק יחיד בהקשר הכרומטין הטבעי שלו משמרים ניצנים, Saccharomyces cerevisiae.

עותק יחיד של גן לוקוס כרומטין טיהור ב Saccharomyces cerevisiae

The basic organizational unit of eukaryotic chromatin is the nucleosome core particle (NCP), which comprises DNA wrapped ~1.7 times around a histone ...

גרעין אאוקריוטי צפוף מאוד עם תהליכים ביולוגיים רבים המתרחשים בו זמנית. מטרת המחקר שלנו היא להבין כיצד כל התהליכים הללו מתואמים בגנום שלנו ללא תאונות משמעותיות שאחרת היו מובילות לחוסר יציבות גנומית ולמחלות אנושיות. פרוטוקול זה מאפשר לנו לטהר מוקד מסוים של הגנום במצבו הטבעי, ומאפשר הן את ההרכב והן את האפיון הפונקציונלי של החומר המבודד, כגון מדידות של אינטראקציות DNA חלבוני.פרוטוקול זה מאפשר רמה עצומה של העשרה של לוקוס ממוקד, המתגבר על מגבלות קיימות רבות של בידוד כרומטין ספציפי ללוקה. החומר לא הוצלב. זה גם מאפשר ניתוחים פונקציונליים רבים במורד הזרם, כגון שעתוק חוץ גופי או שכפול במבחנה.פרוטוקול זה אפשר לנו להוציא ולטהר מקורות שכפול שונים מכרומוזומי שמרים, ואפשר לנו לבצע אנליזה פרוטאומית ולזהות גורמי כרומטין חדשים המקיימים אינטראקציה, ובכך לקדם את תחום המחקר של שכפול DNA. פרוטוקול זה מאפשר מחקרי שכפול במבחנה המשתמשים בחומר המקור המטוהר כדי לבחון מצבי כרומטין, שינויים בהיסטון ולבצע ניתוח מבני על תבניות הנוקלאוזומליות המקוריות מכרומוזומים אנדוגניים, ולקדם את מחקר הכרומטין.

single-copy-gene-locus-chromatin-purification-saccharomyces

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

מאמר זה מציג שיטה רגישה הנקראת Circle-Seq לטיהור DNA מעגלי חוץ-כרומוזומלי (eccDNA). השיטה כוללת טיהור עמודות, הסרת ה-DNA הכרומוזומלי הליניארי שנותר, הגברת מעגל מתגלגל ורצף תפוקה גבוהה. Circle-Seq ישים לסינון בקנה מידה גנומי של eccDNA איקריוטי ולחקר חוסר יציבות הגנום ושונות במספר העתק.

טיהור הגנום כולו של DNA המעגל extrachromosomal מתאי איקריוטיים

אנו מתארים את המחשוף אנדוגני הכרומטית יחד עם רצף תפוקה גבוהה (ChEC-seq), chromatin immunoprecipitation (שבב) שיטה horogonal עבור מיפוי חלבון מחייב אתרים גנום רחב עם חלבונים היתוך microococcal nuclease (MNase).

מיפוי רחב של הגנום של אינטראקציות DNA-חלבון עם CHEC-Seq ב<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עבור כרומטין immunoprecipitation של שינויים היסטוניים ששונה מ שמרים ניצני האפייה. Immunoprecipitated DNA משמש לאחר מכן PCR כמותי לחקור את השפע ואת לוקליזציה של שינויים post-translational היסטון ברחבי הגנום.

Immunoprecipitation כרומטין (ChIP) של היסטון שינויים של האפייה

מערכת CRISPR/Cas12a בשילוב עם מערך crRNA יחיד מאפשר עריכה משולבת יעילה של הגנום S. cerevisiae ס בבית מרובים בו זמנית. זה הפגינו על ידי בניית קרוטנאיד הפקת זנים שמרים אשר משמשים לאחר מכן כדי ליצור פיקסל ארט שמרים.

CRISPR/Cas12a מולטיפלקס עריכת הגנום של סכביקוע cerevisiae ס ויצירת שמרים אמנות פיקסל

הנה פרוטוקול לזיהוי אינטראקציות גנטיות באמצעות מסך מדכא מספר עותק מוגבר ב Saccharomyces cerevisiae. שיטה זו מאפשרת לחוקרים לזהות, לשבט ולבדוק מדכאי מוטנטים שמרים קצרי מועד. אנו בודקים את ההשפעה של הגדלת מספר עותק של SIR2 על תוחלת החיים במוטציה null autophagy.

מסך מדכא לאפיון קישורים גנטיים ויסות תוחלת חיים כרונולוגית ב Saccharomyces cerevisiae

עבודה זו מתארת פרוטוקול לבדיקה גנטית מדכאת מולטי-קופיות בסכיזוזאכרומיצס פומבה. מסך זה משתמש בספריית פלסמידים כלל-גנומית כדי לזהות שיבוטים מדכאים של פנוטיפ אובדן תפקוד הקשור לזן מוטנטי שאילתה. מדכאים גנטיים חדשים של מוטציית האפס ell1 זוהו באמצעות מסך זה.

בדיקה גנטית לזיהוי מדכאי ריבוי עותקים בסכיזוזאכרומיצס פומבה

כתב יד זה מתאר כיצד למסך מוטציות thermostabilizing, לטהר את טרנספורטר הסרוטונין האדם, ליצור נוגדנים זיקה גבוהה, ולגבש במתחם טרנספורטר-נוגדן סרוטונין מאוגד -citalopram S תרופה נגד דיכאון. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם המחקר של מובילי קרום מאתגר אחרים, קולטנים, ותעלות.

Thermostabilization, ביטוי, טיהור, התגבשות של Transporter סרוטונין האדם Bound כדי<em&gt; S</em&gt; -citalopram

כאן, אנו מציגים שיטה להביע ולטהר S100A12 (calgranulin C). אנו מתארים פרוטוקול למדידת פעילות אנטי מיקרוביאלית שלו נגד הפתוגן האנושי H. pylori .

הביטוי, טיהור, פעילות אנטי מיקרוביאלית של S100A12

פרוטוקול חדש עבור הכנת כרומטין של שרירי השלד העכבר למבוגרים הותאם במחקר של הכונה של סיבי השריר על ידי כרומטין immunoprecipitation מוצג.

פרוטוקול משופרת עבור כרומטין Immunoprecipitation של שרירי השלד העכבר

כאן אנו מציגים שיטה לקביעת הזיקות מחייב שיווי משקל ועל בתמיסה עם רגישות גבוהה בקנה מידה גדול. זה משפר את ניתוח כמותי של שעתוק מקדם-DNA מחייב. השיטה מבוססת על מידות חיזקו פלורסצנטיות אוטומטי מערכת מבוקרת.

רגישות גבוהה מדידה של שעתוק הזיקות איגוד מקדם-DNA על ידי טיטור תחרותי באמצעות מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית

למדו בידוד כרומטין ספציפי ללוקוס ב-Saccharomyces cerevisiae לחקר אינטראקציות חלבון-דנ"א. שיטה זו מאפשרת עשרות מונים של העשרת הלוקוס הממוקד ללא צלב קושר.

עותק יחיד של גן לוקוס כרומטין טיהור ב Saccharomyces cerevisiae

גלה סרטונים נוספים