Name: ניתוח זרימת דיווח כפול מבוסס חרוזים פלואורסצנטיים מגנטיים של חסימת נוגדנים המושרה על ידי חיסון PDL1-Vaxx של אינטראקציה PD-1/PD-L1 (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: למדו לנתח חסימת נוגדנים נגד PD-L1 באמצעות חרוזים פלואורסצנטיים מגנטיים. שיטה זו מאפשרת הערכת יעילות חיסון PDL1-Vaxx בחסימת אינטראקציית PD-1/PD-L1 לטיפול בסרטן.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים לשרי דנבר PhD, MBA של Luminex Corporation (אוסטין, טקסס) על התמיכה במחקר ומתיו סילברמן PhD של פתרונות הוצאה לאור ביו-רפואיים (פנמה סיטי, פלורידה; mattsilver@yahoo.com) על סיוע מדעי וכתיבה. עבודה זו נתמכה על ידי פרסים Pravin T. P. Kaumaya מהמכונים הלאומיים לבריאות (R21 CA13508 ו- R01 CA84356) ו- Imugene Ltd, סידני, אוסטרליה (OSU 900600, GR110567 ו- GR124326).

ניתוח זרימה של חסימת נוגדנים PDL1-Vaxx באמצעות חרוזים פלואורסצנטיים מגנטיים

<ol><li>Kaumaya, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B-cell+epitope+peptide+cancer+vaccines%3A+a+new+paradigm+for+combination+immunotherapies+with+novel+checkpoint+peptide+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Oncology%22%5BJournal%5D)">B-cell epitope peptide cancer vaccines: a new paradigm for combination immunotherapies with novel checkpoint peptide vaccine.</a> Future Oncology. 16 (23), 1767-1791 (2020).</li>
<li>Pandey, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revolutionization+in+cancer+therapeutics+via+targeting+major+immune+checkpoints+PD-1%2C+PD-L1+and+CTLA-4%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceuticals%22%5BJournal%5D)">Revolutionization in cancer therapeutics via targeting major immune checkpoints PD-1, PD-L1 and CTLA-4.</a> Pharmaceuticals. 15 (3), 335(2022).</li>
<li>Guo, L., Overholser, J., Good, A. J., Ede, N. J., Kaumaya, P. T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+studies+of+a+novel+human+PD-1+B-cell+peptide+cancer+vaccine+PD1-Vaxx+from+BALB%2Fc+mice+to+beagle+dogs+and+to+non-human+primates+%28cynomolgus+monkeys%29%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Preclinical studies of a novel human PD-1 B-cell peptide cancer vaccine PD1-Vaxx from BALB/c mice to beagle dogs and to non-human primates (cynomolgus monkeys).</a> Frontiers in Oncology. 12, 826566(2022).</li>
<li>Brahmer, J. R., Hammers, H., Lipson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nivolumab%3A+Targeting+PD-1+to+bolster+antitumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Oncology%22%5BJournal%5D)">Nivolumab: Targeting PD-1 to bolster antitumor immunity.</a> Future Oncology. 11 (9), 1307-1326 (2015).</li>
<li>Shah, N. J., Kelly, W. J., Liu, S. V., Choquette, K., Spira, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Product+review+on+the+Anti-PD-L1+antibody+atezolizumab%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Vaccines+%26+Immunotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Product review on the Anti-PD-L1 antibody atezolizumab.</a> Human Vaccines & Immunotherapeutics. 14 (2), 269-276 (2018).</li>
<li>Postow, M. A., Sidlow, R., Hellmann, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune-related+adverse+events+associated+with+immune+checkpoint+blockade%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Immune-related adverse events associated with immune checkpoint blockade.</a> The New England Journal of Medicine. 378 (2), 158-168 (2018).</li>
<li>Kaumaya, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+paradigm+shift%3A+Cancer+therapy+with+peptide-based+B-cell+epitopes+and+peptide+immunotherapeutics+targeting+multiple+solid+tumor+types%3A+Emerging+concepts+and+validation+of+combination+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Vaccines+%26+Immunotherapeutics%22%5BJournal%5D)">A paradigm shift: Cancer therapy with peptide-based B-cell epitopes and peptide immunotherapeutics targeting multiple solid tumor types: Emerging concepts and validation of combination immunotherapy.</a> Human Vaccines & Immunotherapeutics. 11 (6), 1368-1386 (2015).</li>
<li>Guo, L., Kaumaya, P. T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+prototype+checkpoint+inhibitor+B-cell+epitope+vaccine+%28PD1-Vaxx%29+en+route+to+human+Phase+1+clinical+trial+in+Australia+and+USA%3A+Exploiting+future+novel+synergistic+vaccine+combinations%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">First prototype checkpoint inhibitor B-cell epitope vaccine (PD1-Vaxx) en route to human Phase 1 clinical trial in Australia and USA: Exploiting future novel synergistic vaccine combinations.</a> British Journal of Cancer. 125 (2), 152-154 (2021).</li>
<li>Dakappagari, N. K., Douglas, D. B., Triozzi, P. L., Stevens, V. C., Kaumaya, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+mammary+tumors+with+a+chimeric+HER-2+B-cell+epitope+peptide+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Prevention of mammary tumors with a chimeric HER-2 B-cell epitope peptide vaccine.</a> Cancer Research. 60 (14), 3782-3789 (2000).</li>
<li>Dakappagari, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+HER-2%2Fneu+B-cell+epitope+peptide+vaccine+designed+to+incorporate+two+native+disulfide+bonds+enhances+tumor+cell+binding+and+antitumor+activities%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Conformational HER-2/neu B-cell epitope peptide vaccine designed to incorporate two native disulfide bonds enhances tumor cell binding and antitumor activities.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280 (1), 54-63 (2005).</li>
<li>Kaumaya, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+I+active+immunotherapy+with+combination+of+two+chimeric%2C+human+epidermal+growth+factor+receptor+2%2C+B-cell+epitopes+fused+to+a+promiscuous+Tcell+epitope+in+patients+with+metastatic+and%2For+recurrent+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Phase I active immunotherapy with combination of two chimeric, human epidermal growth factor receptor 2, B-cell epitopes fused to a promiscuous Tcell epitope in patients with metastatic and/or recurrent solid tumors.</a> Journal of Clinical Oncology. 27 (31), 5270-5277 (2009).</li>
<li>Bekaii-Saab, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+I+immunotherapy+trial+with+two+chimeric+HER-2+B-cell+peptide+vaccines+emulsified+in+montanide+ISA+720VG+and+Nor-MDP+adjuvant+in+patients+with+advanced+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Phase I immunotherapy trial with two chimeric HER-2 B-cell peptide vaccines emulsified in montanide ISA 720VG and Nor-MDP adjuvant in patients with advanced solid tumors.</a> Clinical Cancer Research. 25 (12), 3495-3507 (2019).</li>
<li>Kaumaya, P. T. P., Guo, L., Overholser, J., Penichet, M. L., Bekaii-Saab, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunogenicity+and+antitumor+efficacy+of+a+novel+human+PD-1+B-cell+vaccine+%28PD1-Vaxx%29+and+combination+immunotherapy+with+dual+trastuzumab%2Fpertuzumab-like+HER-2+B-cell+epitope+vaccines+%28B-Vaxx%29+in+a+syngeneic+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Immunogenicity and antitumor efficacy of a novel human PD-1 B-cell vaccine (PD1-Vaxx) and combination immunotherapy with dual trastuzumab/pertuzumab-like HER-2 B-cell epitope vaccines (B-Vaxx) in a syngeneic mouse model.</a> Oncoimmunology. 9 (1), 1818437(2020).</li>
<li>Guo, L., Overholser, J., Darby, H., Ede, N. J., Kaumaya, P. T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+newly+discovered+PD-L1+B_cell+epitope+peptide+vaccine+%28PDL1-Vaxx%29+exhibits+potent+immune+responses+and+effective+anti-tumor+immunity+in+multiple+syngeneic+mice+models+and+%28synergizes%29+in+combination+with+a+dual+HER-2+B-cell+vaccine+%28B-Vaxx%29%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">A newly discovered PD-L1 B_cell epitope peptide vaccine (PDL1-Vaxx) exhibits potent immune responses and effective anti-tumor immunity in multiple syngeneic mice models and (synergizes) in combination with a dual HER-2 B-cell vaccine (B-Vaxx).</a> Oncoimmunology. 11 (1), 2127691(2022).</li>
<li>Angeloni, S., Das, S., De Jager, W., Dunbar, S. Luminex Corporation. The xMAP® Cookbook, 5th edition. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://info.luminexcorp.com/en-us/research/download-the-xmap-cookbook?utm_referrr=https%3A%2F%2Fwww.luminexcorp.com%2F">https://info.luminexcorp.com/en-us/research/download-the-xmap-cookbook?utm_referrr=https%3A%2F%2Fwww.luminexcorp.com%2F</a> (2022).</li>
<li>MagPlex® Microspheres Documentation. Product information sheet. Luminex Corporation. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.luminexcorp.com/magplex-microspheres/#overview">https://www.luminexcorp.com/magplex-microspheres/#overview</a> (2014).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+MR+%22Estimation+of+cell+number+by+hemocytometry+counting%22">Estimation of cell number by hemocytometry counting</a>. 2019 (11), Cold Spring Harbor Protocols. (2019).</li>
<li>Gibbs, J., Vessels, M., Rothenberg, M. Selecting the Detection System - Colorimetric, Fluorescent, Luminescent Methods for ELISA Assays. Corning Inc. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.corning.com/catalog/cls/documents/application-notes/CLS-DD-AN-458.pdf">https://www.corning.com/catalog/cls/documents/application-notes/CLS-DD-AN-458.pdf</a> (2019).</li>
</ol>

Pravin T.P. Kaumaya הוא יועץ Imugene, Ltd.

מטרת האימונותרפיה לסרטן הקשורה לנקודות ביקורת היא לשבש את האינטראקציה בין חלבוני נקודת ביקורת לבין הליגנדות החשובות שלהם בהישרדות הגידול ובהתקדמותו2. קבוצת מחקר זו מפתחת באופן פעיל חיסונים חדשניים נגד PD-1 ו-PD-L1 המעוררים תגובת נוגדנים המכוונת וקוטעת את מחסום PD-1/PD-L1 3,8,13,14. בעבר, בוצעו שתי וריאציות של בדיקות אימונוסורבנטיות מקושרות אנזימים (ELISAs) כדי להעריך את ההשפעות של נוגדנים נגד PDL1-פפטיד על עיכוב האינטראקציה הרקומביננטית PD1/PD-L114. (1) בווריאנט הראשון, rhPD-L1 היה מצופה על צלחת מיקרוטיטר, ואז הצלחת הודגרה בנוגדנים מדוללים נגד PDL1 המועמדים לחיסון המושרה על ידי מועמדים. עיכוב האינטראקציה הרקומביננטית PD-1/PD-L1 על ידי הנוגדנים הוערך לאחר מכן על ידי הוספת rhPD-1 ביוטינילציה וכימות הקישור ל- rhPD-L1 המשותק באמצעות מצומד פרוקסידז סטרפטווידין-חזרת ומצע קולורימטרי. הגדרנו את זה כמבחן הסגר הישיר. (2) בגרסה השנייה, PD-1 היה מצופה על לוח המיקרוטיטר. rhPD-L1 ביוטינילציה הודגר מראש עם כל אחד מהנוגדנים הרב-שבטיים המועמדים ל-PLD1 בצינורות תגובה נפרדים. תערובות rhPDL1/anti-PDL1 נוספו לאחר מכן לבארות הצלחת שהכילו rhPD-1 משותק והורשו להגיב. כל rhPDL1 שהגיב עם rhPD-1 המשותק בנוכחות נוגדנים PDL1-Vaxx שעלולים לחסום זוהה עם סטרפטווידין-HRP ודגירה של מצע קולורימטרי. הגדרנו את זה כמבחן הסגר ההפוך.
המצור ההפוך של האינטראקציה הרקומביננטית PD-1/PD-L1 על ידי נוגדנים נגד PDL1-פפטיד הראה עיכוב של האות (כלומר, חסימה PD-1/PD-L1) באופן תלוי ריכוז נוגדנים14, בעוד שגישת החסימה הישירה לא סיפקה תוצאות עקביות (לא מוצגות). בדיקת חסימת הדיווח הכפול מבוססת החרוזים פותחה כדי לאמת את תוצאות ELISA ולחקור את המצור של אינטראקציית PD-1/PD-L1 בפאזה נוזלית, אשר מבטלת את בעיות זמינות האפיטופ הסטריות / קושרות פוטנציאליות הקשורות לשיתוק חלבונים רקומביננטיים על קרקעית באר. ניתוח המיקרוספירה נמצא בקורלציה ישירה עם תוצאות חסימת ELISA באמצעות בדיקת המצור ההפוך (איור 2). בנוסף, בדיקות חיסוניות מבוססות פלואורסצנטיות יכולות לספק רגישות משופרת לבדיקה וטווח דינמי מורחב בהשוואה ל- ELISAs18 קולורימטריים, ויתר על כן, הבדיקה מבוססת החרוזים המרובבים מאפשרת ביצוע בו-זמני של שתי בדיקות חיסוניות עצמאיות בתגובה אחת. הסולפו-NHS וה-EDC המשמשים לצימוד קוולנטי של המיקרוספרות ל-rhPD-1 עשויים היו להוביל להבדלי הביצועים שנצפו בין מבחני הסגר הישיר והמצור ההפוך לבין ההבדלים שנצפו ברגישות בין מבחני האינטראקציה הרקומביננטיים PD-1/PD-L1 מבוססי החרוזים של ELISA ו-Luminex. יש צורך בחקירה נוספת ברמה הכימית והמולקולרית כדי לחקור את המנגנונים האפשריים האחראים להבדלים אלה.
הן ELISA14 והן הבדיקות מבוססות החרוזים מראות כי נוגדנים נגד PDL1-Vaxx המושרים על ידי PDL1 יכולים לעכב היווצרות קומפלקס נקודות ביקורת PD1/PD-L1. PDL1-Vaxx מבוסס הפפטיד משרה בהצלחה נוגדנים נגד PDL1 שיכולים לחסום את האינטראקציה PD-1/PD-L1. גישה זו עשויה לשמש כאסטרטגיה טיפולית חדשנית לטיפול בסרטן, כפי שנתמך על ידי מחקרים פרה-קליניים בבעלי חיים 3,13,14. ניסויים קליניים מתוכננים יקבעו את היעילות של PDL1-Vaxx עבור אימונותרפיה של נקודות ביקורת ובקרת מחלות בחולי סרטן.

בתאי T, תאי B ונקודות ביקורת תוך-תאיות של מערכת החיסון, מסלולי איתות מווסתים את פעילות מערכת החיסון. חלק מהתאים הסרטניים מגנים על עצמם מפני התקפה חיסונית על ידי גירוי מטרות נקודות ביקורת, המעכבות את תפקוד מערכת החיסון ומעודדות הישרדות ושגשוג ניאופלסטיים. אימונותרפיה אונקולוגית על ידי עיכוב נקודות ביקורת משתמשת בנוגדנים כדי למקד ולחסום את מחסומי האיתות, ובכך לשחזר את הפונקציות האנטי ניאופלסטיות של המערכת החיסונית 1,2,3. טיפולים אנטי-סרטניים יעילים ביותר כוללים כיום את הנוגדנים החד-שבטיים nivolumab, המכוונים לחלבון מוות מתוכנת 1 (PD-1)4, ואת atezolizumab, המכוון לליגנד מוות מתוכנת 1 (PD-L1)5. גישה זו הראתה הצלחה קלינית רבה בטיפול בחולי סרטן. עם זאת, התועלת הקלינית של אסטרטגיות עיכוב נקודות ביקורת הנוכחיות מתמתנת על ידי תופעות לוואי ועמידות לטיפול, במיוחד בטיפול בסוכן יחיד6. יש צורך דחוף בשילוב של אימונותרפיה ואסטרטגיות טיפוליות יעילות יותר עם רעילות נמוכה יותר בטיפול בסרטן 1,3,6.
במהלך 30 השנים האחרונות, המעבדה של ד"ר קאומאיה פיתחה חיסונים פפטידים לסרטן וחומרים הקשורים לחיקוי פפטיד לטיפול בסרטן, חלקם נמצאים בניסויים קליניים מתמשכים 1,2,7,8,9,10,11,12,13,14 . לדוגמה, B-Vaxx עם אימונותרפיה משולבת HER-2 הראתה יתרונות למטופלים נגד גידולים מוצקים גרורתיים ו / או חוזרים בניסויים קליניים12. חיסוני הסרטן האחרונים של המעבדה הם PD1-Vaxx 2,13 ו-PDL1-Vaxx14, שהראו יתרונות גדולים במחקרים פרה-קליניים, במיוחד בטיפול משולב. PD1-Vaxx השלים ניסויים קליניים להעלאת מינון בארה"ב ובאוסטרליה. PD1-Vaxx ישולב עם atezolizumab בניסוי שלב 1b שיחל במאי 2023. דוח זה מתמקד בהערכת היכולת של נוגדנים הנגרמים על ידי PDL1-Vaxx לחסום את האינטראקציה PD-1/PD-L1.
החיסון לסרטן PDL1-Vaxx הוא חיסון אפיטופ פפטידי תאי B חדשני עם חומצות אמינו PD-L1 130-147 המקושרות לפפטיד המופקר של נגיף חצבת תאי T (MVF) באמצעות מקשר פפטידי GPSL. מחקרים פרה-קליניים הראו כי PDL1-Vaxx הוא אימונוגני מאוד בהמרצת ייצור נוגדנים אנטי-סרטניים במודלים שונים של בעלי חיים, מאריך הישרדות ומפחית את נטל הגידול14. נוגדנים אלה הנוצרים כנגד פפטיד PD-L1 יכולים לחסום בהצלחה את האינטראקציה PD1/PD-L1, ובכך לגרום לפעילות אנטי-ניאופלסטית. דו"ח זה מציג בדיקה המנתחת את המצור של היווצרות קומפלקס PD1/PD-L1 על ידי נוגדנים הנגרמים על ידי PDL1-Vaxx באמצעות פורמט מבוסס חרוזים מגנטיים עם קריאת כתב כפול במכשיר ציטומטריית זרימה.

<table><tbody><tr><td><מאגר הפעלה חזק></חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מאגר הפעלה: 0.1 מ' NaH2PO4, pH 6.2</td><td>Millipore/Sigma</td><td>S3139</td><td></td></tr><tr><td>מאגר בדיקה/שטיפה: PBS-TBN (1x PBS, pH 7.4 + 0.1% BSA + 0.05% (v/v) Tween-20; 0.05% NaN3)</td> <td>Millipore/Sigma</td><td>P3563 (PBS+Tween20), A7888 (אלבומין בסרום בקר), S8032 (נתרן אזיד)</td><td></td></tr><tr><td>מאגר צימוד: 50 מ"מ 2-morpholinoethanesulfonic חומצה (MES), pH 5.0</td><td>MilliporeSigma&nbsp;</td><td>M2933</td><td></td></tr><tr><td><ריאגנטים חזקים>צימוד</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-אתיל-3-[3-דימתיל-אמינופרופיל] קרבודימיד הידרוכלוריד (EDC)</td><td>ThermoFisher Scientific (וולת'ם, MA)</td><td>77149</td><td></td></tr><tr><td>ערכת צימוד נוגדנים xMAP (אם תרצה), כוללת:</td><td>Luminex Corp.&nbsp; (אוסטין, טקסס)</td><td>40-50016</td><td></td></tr><tr><td>EDC, 10 מ"ג&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>פתרון sNHS, 250 ומיקרו; L</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מאגר הפעלה/צימוד: 0.1 M 2-morpholinoethanesulfonic acid (MES), pH 6.0</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מאגר כביסה: 1x PBS, pH 7.4 + 0.1% BSA + 0.05% (v/v) Tween-20; 0.05% NaN3 (PBS-TBN)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide)</td><td>ThermoFisher Scientific (Waltham, MA)</td><td>24510</td><td></td></tr><tr><td><חזק>מכשור וציוד מעבדה נלווה</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>xMAP INTELLIFLEX (מכשיר מדווח כפול)Luminex</td> <td>Corp.&nbsp; (אוסטין, טקסס)</td><td>INTELLIFLEX-DRSE-RUO</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תחתונה עגולה מחייבת חלבון נמוכה 96 בארות</td><td>ThermoFisher Scientific (וולת'אם, MA)</td><td>07-200-761</td><td></td></tr><tr><td>מפריד צלחות מגנטי Luminex (או דומה)&nbsp;</td><td>לומינקס קורפ&nbsp; (אוסטין, טקסס)</td><td>CN-0269-01</td><td></td></tr><tr><td>מפריד צינורות מגנטי Luminex (או דומה)</td> <td>Luminex Corp.&nbsp; (אוסטין, טקסס)</td><td>CN-0288-01</td><td></td></tr><tr><td>MagPlex Microspheres (מגנטי, פלורסנט, 6.5 ומיקרו; חרוזים בקוטר m)</td><td>Luminex Corp.&nbsp; (אוסטין, טקסס)</td><td>MC-1**** (משתנה לפי תווית החרוז)</td><td></td></tr><tr><td>צינורות מיקרוצנטריפוגה חלבון LoBind</td><td>ThermoFisher Scientific (וולת'אם, מסצ'וסטס)</td> <td>022431081</td><td></td></tr><tr><td><חזקים>פפטידים, נוגדנים & ריאגנטים לזיהוי</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אטזוליזומאב (נוגדן חד שבטי אנטי-PDL1 IgG1 אנושי), בקרה חיובית</td><td>Genentech/Roche (סן פרנסיסקו, קליפורניה)</td><td>n/a (תרופות מרשם)</td><td></td></tr><tr><td>PDL1 אנושי רקומביננטי ביוטיניל;</td><td>סינו ביולוגי (וויין, פנסילבניה)</td><td>10084-H49H-B</td><td></td></tr><tr><td>סגול מבריק 421-חמור מצומצם אנטי-אנושי IgG</td><td>Jackson Immunoresearch Laboratories Inc. (ווסטגרוב, פנסילבניה)</td><td>709-675-149</td><td></td></tr><tr><td>סגול מבריק 421-חמור משולב נגד ארנב IgG</td><td>Jackson Immunoresearch Laboratories Inc. (ווסטגרוב, פנסילבניה)</td><td>711-675-152</td><td></td></tr><tr><td>PD-1 אנושי רקומביננטי (מתויג פולי-היסטידין)</td><td>אקרו ביוסיסטמס (ניוארק, DE)</td><td>PD1-H5256&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>R-פיקואריתרין מצומד סטרפטווידין (SAPE)</td><td>אג'ילנט (סנטה קלרה, קליפורניה)</td><td>PJRS34-1</td><td></td></tr><tr><td>טרסטוזומאב (הרצפטין, נוגדן חד-שבטי אנטי-HER2 אנושי), בקרה שלילית</td><td>Genentech/Roche (סן פרנסיסקו, קליפורניה)</td><td>n/a (תרופות מרשם)</td><td></td></tr></tbody></table>

ניתוח זרימת דיווח כפול מבוסס חרוזים פלואורסצנטיים מגנטיים של חסימת נוגדנים המושרה על ידי חיסון pdl1-vaxx של אינטראקציה pd-1/pd-l1

Magnetic Fluorescent Bead-Based Dual-Reporter Flow Analysis of PDL1-Vaxx Peptide Vaccine-Induced Antibody Blockade of the PD-1/PD-L1 Interaction

עיכוב קולטני נקודות ביקורת (PD-1, PD-L1 ו-CTLA-4) עם נוגדנים חד-שבטיים הראה תועלת רבה בניסויים קליניים לטיפול בחולי סרטן והפך לגישה מרכזית באימונותרפיה מודרנית לסרטן. עם זאת, רק תת-קבוצה של חולים מגיבה לאימונותרפיה של נוגדנים חד-שבטיים של נקודות ביקורת. לכן, דחוף לפתח אסטרטגיות טיפוליות חדשות נגד סרטן. פותח חיסון חדשני נגד סרטן מסוג PDL1 (ליגנד מוות מתוכנת 1), עם חומצות אמינו 130-147 המקושרות לפפטיד MVF (חלבון היתוך נגיף חצבת "מופקר") באמצעות מקשר GPSL. בדיקות פרה-קליניות הצביעו על כך שחיסון PDL1 זה (PDL1-Vaxx) מעורר ביעילות נוגדנים אימונוגניים מאוד בבעלי חיים. בעלי חיים שחוסנו ב-PDL1-Vaxx מראים ירידה בנטל הגידול ושיעורי הישרדות מורחבים במודלים שונים של סרטן בעלי חיים. מנגנוני הפעולה מצביעים על כך שנוגדנים שמקורם בחיסון מעכבים את התרבות תאי הגידול, גורמים לאפופטוזיס וחוסמים את האינטראקציה PD-1/PD-L1. כתב יד זה מציג בדיקה מבוססת חרוזים מגנטיים המשתמשת במערכת ניתוח זרימה בעלת דיווח כפול כדי להעריך את האינטראקציה PD-1/PD-L1 ואת חסימה על ידי נוגדנים נגד PDL1 שהועלו כנגד PDL1-Vaxx.

המחקר הצליח לכמת במדויק את עיכוב האינטראקציה PD-1/PD-L1 על ידי ארבעה נוגדנים רב-שבטיים ייחודיים, שנוצרו כנגד פפטידים של חיסון rhPD-L1, הנחקרים כסוכנים טיפוליים פוטנציאליים לסרטן. הסכימה של בדיקה זו מוצגת באיור 1. כמות rhPD-L1 ביוטינילציה שנקשרו לחרוזים מצומדים של rhPD-1 ועיכוב הקישור הזה על-ידי ארבעת המועמדים לנוגדנים המושרים על-ידי PLD1-Vaxx נמדדו בערוץ 1 באמצעות מגיב זיהוי סטרפטווידין-PE שקשר ישירות את rhPD-L1 (איור 2).
כל ארבעת הנוגדנים הרב-שבטיים נגד PDL1-פפטיד חסמו את האינטראקציה של rhPD-L1 עם PD-1 שהושתקה במיקרוספרות במידה משתנה. אחוז העיכוב של נוגדנים שונים נגד PDL1 פפטיד נע בין 48% ל 74% בריכוז הנבדק המרבי של 1,000 מיקרוגרם / מ"ל. הנוגדן החד-שבטי החיובי atezolizumab השיג חסימה של 92% של האינטראקציה PD-1/PD-L1 בריכוז המרבי שנבדק14 מתוך 4 מיקרוגרם/מ"ל (איור 2). כל נוגדני PDL1-Vaxx הניסיוניים הראו עיכוב תלוי ריכוז של קישור rhPD-L1 לחרוזים מצומדים של rhPD-1 בהשוואה לטרסטוזומאב, נוגדן הבקרה השלילי שלא היה צפוי לקיים אינטראקציה עם מערכת PD-1/PD-L1.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65467/65467fig02.jpg"> איור 2: חסימה של אינטראקציה של rhPD-L1 עם rhPD-1 המצומדת לחרוזים מגנטיים על-ידי נוגדנים נגד PDL1-פפטידים, כפי שמוצג על-ידי מערכת חיסון חדשה המבוססת על חרוזים פלואורסצנטיים. PD-1 אנושי רקומביננטי הוצמד למיקרוספרות מגנטיות, והחרוזים הודגרו עם rhPD-L1 ביוטינילציה שהודגרה מראש עם נוגדנים שונים נגד PDL1-פפטידים. נעשה שימוש בריאגנט לזיהוי סטרפטווידין-פיקואריתרין כדי לקשור את הביוטין, ובכך להעריך את הכמות היחסית של rhPD-L1 שהייתה זמינה להיקשר ל-PD-1. נוגדנים רב-שבטיים שגודלו בארנבים כנגד חיסוני פפטיד PDL1 (אנטי-PDL1[36], אנטי-PDL1[50], אנטי-PDL1[95] ואנטי-PDL1[130]) נבדקו לפעילות מעכבת והראו חסימה של 48%-74% של אינטראקציות רקומביננטיות PD-1/PD-L1 בריכוז הגבוה ביותר שנבדק. Atezolizumab (נוגדן חד שבטי שונה נגד PDL1) שימש כבקרה חיובית. הנוגדן החד-שבטי המסחרי הלא קשור trastuzumab (anti-HER2) שימש כבקרה שלילית. איור זה נלקח מ Guo et al.14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65467/65467fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65467/65467fig03.jpg"> איור 3: קשירה השוואתית של נוגדנים שונים הנגרמים על-ידי PDL1-Vaxx ל-rhPD-L1 המורכבים לחרוזים מגנטיים מצופים rhPD1. נוגדן זיהוי משני סגול מבריק 421-מצומד שימש להשוואת הקישור של נוגדנים רב-שבטיים שונים נגד PDL1-peptide ארנב ל- rhPD-L1 באמצעות חרוזים מצופים rhPD-1. אות הפלואורסצנטיות הכחול BV421 הוקלט בערוץ 2 של מכשיר הכתב הכפול; אות זה מתואם עם יעילות הקישור היחסית של נוגדנים ניסיוניים נגד PDL1-פפטידים. Trastezumab (anti-HER2), נוגדן חד-שבטי המכוון לנקודת ביקורת שונה מ-PD-1/PD-L1, שימש כביקורת שלילית. MFI מייצג את עוצמת הפלואורסצנטיות החציונית הממוצעת של חרוזים, שנמדדה בבארות תגובה כפולות לכל מצב. איור זה נלקח מ Guo et al.14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65467/65467fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
היכולות היחסיות של ארבעת הנוגדנים המועמדים הניסיוניים PDL1-Vaxx לקשור rhPD-L1 הושוו באמצעות מערכת זיהוי נפרדת (BV421-conjugated anti-rabbit IgG) שהוערכה בערוץ הכתבים השני של המכשיר. התוצאות האלה הצביעו על כך שכל ארבעת הנוגדנים הרב-שבטיים נגד PDL1-פפטיד קשורים ל-rhPD-L1 באופן תלוי ריכוז14 (איור 3). הנוגדן נגד PDL1(130) הראה את אות הקישור הגבוה ביותר של rhPDL1 מבין ארבעת המועמדים לנוגדנים הנגרמים על ידי PDL1-Vaxx.

מעכבי צ'קפוינט הם מטרות חשובות בפיתוח טיפולים למלחמה בסרטן. דו"ח זה מציג חיסון חדשני לסרטן מבוסס פפטיד PDL1, PDL1-Vaxx, אשר גורם לייצור נוגדנים רב-שבטיים מנטרלים החוסמים היווצרות קומפלקס PD-1/PDL1. עבודה זו מפרטת גם את הפיתוח והבדיקות של בדיקה מבוססת חרוזים פלואורסצנטיים לניתוח פעילות זו.

ניתוח זרימת דיווח כפול מבוסס חרוזים פלואורסצנטיים מגנטיים של חסימת נוגדנים המושרה על ידי חיסון PDL1-Vaxx של אינטראקציה PD-1/PD-L1

The inhibition of checkpoint receptors (PD-1, PD-L1, and CTLA-4) with monoclonal antibodies has shown great benefit in clinical trials for treating cancer ...

הפרויקט שלנו בראשות פרופסור Pravin Kaumaya מתמקד בפיתוח חיסונים נגד פפטידי אפיטופ של תאי B שניתן להשתמש בהם כדי לחזק את המערכת החיסונית כדי להילחם טוב יותר נגד הסרטן. אנו מאמינים כי חיסונים פפטידים המכוונים למטרות בקרה חיסונית עשויים אפילו להיות משולבים עם טיפולים אחרים כדי לשפר את תוצאות המטופלים. רצינו לבדוק את יכולת החסימה של נוגדני האנטי-PD-L1 שלנו בבדיקת מיקרו-חרוזים מסורתית שבה חלבון PD-L1 רקומביננטי אנושי נקשר לחרוזי MagPlex.מצאנו שברגע שה-PD-L1 היה קשור לחרוזים, הייתה להם יכולת קשירה נמוכה עבור ליגנד PD-1 שלו. זה מנע מאיתנו להשתמש באפיק הזה של חסימת בדיקות. כאשר קשירת חלבון לחרוזים מעכבת קשירה לליגנד או נוגדנים, טיפול מקדים בנוגדני הבדיקה בתמיסה הוא אופציה, ובהמשך הוספת חרוזים מצופים ליגנד לתערובת חוסמי המטרה.ניתן לבחון את האינטראקציה ביניהם. זה עשוי להיות נתיב שונה לחקור את אותה אינטראקציה קשירת ליגנד מטרה פיתחנו חיסונים נגד סרטן B-Vaxx, PD1-Vaxx, PDL1-Vaxx ו- CTLA4-Vaxx. חיסונים אלה מכוונים ל-HER2 וכמה סמני בקרה חיסונית מעורבים בצורות שונות של סרטן.B-Vaxx ו-PD1-Vaxx נמצאים בניסויים קליניים מתמשכים באוסטרליה ובארה"ב. אנו מקווים שהחיסונים שלנו בנקודות ביקורת החיסון יועילו ליותר חולים. בניסויים מיקרוספיריים קודמים מצאנו כי PD-1 קיים אינטראקציה טובה עם הליגנד PD-L1 שלו. לכן, הנדסנו מחדש את הפרוטוקול, וקשרנו מראש את הנוגדנים הפפטידים נגד PD-L1 לחלבון PD-L1 ביוטינילציה לפני הוספת חרוזי MagPlex המתויגים ב-PD-1.זה אפשר לנו לבדוק את הנוגדנים שלנו על יכולתם לחסום אינטראקציה PD-1/PD-L1. נמשיך להתמקד באימונותרפיה משולבת המתגברת על עמידות לטיפול. אנו רוצים גם לחקור טיפולים משולבים יעילים יותר המעכבים טוב יותר את צמיחת הגידול, מונעים גרורות ומאריכים את שיעורי ההישרדות של החולים.

magnetic-fluorescent-bead-based-dual-reporter-flow-analysis-pdl1-vaxx

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

בסרטון זה, אנו מדגימים טכניקה לביצוע משקעים חיסוניים משותפים של חלבוני PD-1 מסוג פרא המתויגים כ-GFP ומוטציה PD-1 באמצעות חרוזים המצופים בנוגדנים נגד GFP. חלבוני PD-1-GFP הקשורים לחרוזים מודגרים עם חלבוני SHP2 המקיימים אינטראקציה עם PD-1, ומאפשרים זיהוי מוטיבים מבניים ספציפיים ב-PD-1 הממלאים תפקיד קריטי באינטראקציה עם SHP2.

בדיקת משקעים חיסוניים לחקר אינטראקציות קולטני אנזימים בתאים נגועים

ניתוח תזרים cytometric של שלמת הקרינה bimolecular מספק שיטה כמותית תפוקה גבוהה ללמוד אינטראקציה בין חלבונים. מתודולוגיה זו יכולה להיות מיושמת על אתרי קישור ומיפוי חלבון לסינון גורמים המווסתים את האינטראקציה בין חלבונים.

ניתוח תזרים cytometric של שלמת הקרינה bimolecular: שיטה כמותית תפוקה גבוהה לחקר אינטראקציה בין חלבונים

אנו מתארים הדמיה של בעלי חיים שלמים וטכניקות מבוססות ציטומטריית זרימה לניטור התרחבות של תאי CD8+ T ספציפיים לאנטיגן בתגובה לחיסון עם ננו-חלקיקים במודל חיסון עכברי.

טכניקות הדמיה כל-החיה והזרימה Cytometric לתגובות ניתוח של אנטיגן ספציפי CD8 + T תא לאחר Nanoparticle חיסון

כאן, אנו מציגים עבור co-immunoprecipitation ואת וזמינותו של פעילות אנזימטי על חרוזי ללמוד בו זמנית את התרומה של חלבון ספציפי דומיינים של קולטני ממברנה פלזמה אנזים הגיוס והן פעילות אנזים פרוטוקול.

Co-immunoprecipitation Assay ללמוד אינטראקציות פונקציונלי בין קולטנים ואנזימים

פיתחנו זרימה פשוטה cy, לנסות הערכה להערכת האיגוד של PD-1-חסימת נוגדנים לתאי T, המחייב רק טיפה של דם היקפי מחולי סרטן.

ניטור PD-1-חסימת נוגדנים המאוגדים לתאי T נגזר טיפת דם היקפי

מערכת ניתוח זרימה לבדיקות מולטיפלקס מבוססות חרוזים המספקת קריאה של שני עיתונאים שימשה לפיתוח בדיקות נטרול סרולוגיות ונוגדנים מולטיפלקס שיכולות למדוד בו זמנית נוגדני IgG ו- IgM מנטרלים עבור SARS-CoV-2.

בדיקת נטרול מהירה, מולטיפלקס כפולה IgG ו- IgM SARS-CoV-2 עבור מערכת ניתוח זרימה מבוססת חרוזים מרובי קסים

פרוטוקול זה מתאר בדיקת חסימה עבור מעכבי PD-1/PD-L1 באמצעות טכנולוגיית תהודה פלזמון פני השטח. היא משתמשת באסטרטגיית אימוביליזציה דו-שלבית ומערכת חיץ מותאמת למדידה מדויקת של יחידות תגובה, מה שמקל על הערכת שיעורי החסימה של תרכובות או תרופות ביולוגיות. בנוסף, הוא תומך בזיהוי תפוקה גבוהה של מעכבי PD-1/PD-L1.

זיהוי מעכבי PD-1/PD-L1 עם טכנולוגיית תהודה פלזמון פני השטח

GnRH-I ניאון שכותרתו סלקטיבי, -II ו -III נגזרים הם כלי אמין עבור מעקב וכימות ספיגת הסלולר שלהם. כתב יד זה מציג ניסויים כדי להמחיש, לכמת ולהשוות את היעילות הספיגה של conjugates GnRH אלה שורות תאים שונות.

במבחנה הדמיה וכימות של יעילות מיקוד והתרופות של אנלוגים של GnRH שכותרתו fluorescently

נמוך-שדה (L-band, 1.2 GHz) אלקטרון פאראמגנטיים תהודה באמצעות הגששים nitroxyl ו- trityl מסיס הוא הפגין עבור הערכה של פרמטרים חשובים מבחינה פיזיולוגית ב microenvironment הגידול במודלים של העכבר של סרטן השד.

אין ויוו הערכת EPR pH, pO2, מצב חמצון-חיזור, ואת ריכוזים של פוספט גלוטתיון ב Microenvironment הגידול

קבלת דנ א גנומי באיכות גבוהה רקמות הגידול, מהווה צעד ראשון חיוני לניתוח שינויים גנטיים באמצעות רצף הדור הבא. במאמר זה, נציג שיטה פשוטה ומהירה כדי להשיג שלמות הדנ א של מגע ההטבעה ציטולוגיה דגימות ולהעשיר תאים סרטניים.

שיטה פשוטה ומהירה להשיג גידול איכותיים הדנ א של דגימות קליני-פתולוגיים באמצעות מגע ההטבעה ציטולוגיה

למדו לנתח חסימת נוגדנים נגד PD-L1 באמצעות חרוזים פלואורסצנטיים מגנטיים. שיטה זו מאפשרת הערכת יעילות חיסון PDL1-Vaxx בחסימת אינטראקציית PD-1/PD-L1 לטיפול בסרטן.

ניתוח זרימת דיווח כפול מבוסס חרוזים פלואורסצנטיים מגנטיים של חסימת נוגדנים המושרה על ידי חיסון PDL1-Vaxx של אינטראקציה PD-1/PD-L1 (וידאו) | JoVE Journal

ניתוח זרימת דיווח כפול מבוסס חרוזים פלואורסצנטיים מגנטיים של חסימת נוגדנים המושרה על ידי חיסון PDL1-Vaxx של אינטראקציה PD-1/PD-L1

גלה סרטונים נוספים