Name: אימונופלואורסנציה כפולה של γH2AX ו- 53BP1 בלימפוציטים היקפיים אנושיים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 34 s
Description: למדו אימונופלואורסנציה כפולה של γH2AX ו-53BP1 בלימפוציטים היקפיים אנושיים לבחינת נזקי DNA ותהליכי תיקון. שיטה זו מאפשרת הערכה מדויקת של שבירות דו-גדיליות שנגרמו על ידי בליאומיצין.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו אסירי תודה לכל תורמי הדם ולכל אנשי הצוות הרפואי שלקחו את דגימות הדם.

המחקר אושר על ידי הוועדה האתית של אוניברסיטת פיזה, והתקבלה הסכמה מדעת וחתומה מכל תורם.
1. היווצרות מוקדי γH2AX ו- 53BP1
<ol><li>הכנת דגימות וטיפול מוטגני<ol><li>איסוף דגימות דם שלמות על ידי ניקור מאנשים בוגרים בריאים בצינורות איסוף דם (למשל, Vacutainer) המכילים ליתיום הפרין כנוגד קרישה.</li>
		<li>על מנת להבטיח שימור דגימת דם תקין, יש להתחיל את ההליך תוך 24 שעות מרגע הדגימה.</li>
		<li>הוסף 300 μL של הדגימה לצינור המכיל 4.7 מ"ל של מדיום מלא (0.5% פניצילין-סטרפטומיצין, 0.75% phytohemagglutinin, 10% FBS מושבת בעבר, 88.75% RPMI 1640).</li>
		<li>לאחר מכן הוסיפו בלומיצין סולפט לריכוז סופי של 5 מק"ג/מ"ל. זהירות: בלומיצין סולפט הוא מוטגן. יש להימנע ממגע עם העור ומשאיפה. הכינו את הפתרון והוסיפו את הדגימה מתחת למכסה המנוע.</li>
		<li>עבור כל דגימה, הגדר בקרה שלילית (היעדר mutagen).</li>
		<li>הניחו את הצינור בתרמוסטט בטמפרטורה של 37°C למשך שעתיים.</li>
	</ol></li>
	<li>קיבוע<ol><li>דגימות צנטריפוגות ב 540 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>שאפו את הסופרנאטנט ותלו מחדש את הגלולה עם מערבולת.</li>
		<li>הוסף 5 מ"ל של תמיסה היפוטונית (2.87 גרם של KCl מומס ב 500 מ"ל של מים deionized) ו 400 μL של תמיסה מראש קיבוע (5: 3 חומצה אצטית: מתנול) כדי לגרום המוליזה של כדוריות דם אדומות.</li>
		<li>דגימות צנטריפוגות ב 540 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>שאפו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את הגלולה ב-5 מ"ל מתנול בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות לפחות כדי לתקן את התאים.</li>
		<li>לחלופין, אחסנו את התאים בטמפרטורה של -20°C עד לשימוש.</li>
	</ol></li>
	<li>הכנת שקופיות<ol><li>דגימות צנטריפוגות ב 540 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>שאפו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את הגלולה ב-5 מ"ל של מתנול 3:1: תמיסת חומצה אצטית. חזור על שלבים אלה פעם נוספת.</li>
		<li>בסוף, צנטריפוגה את התמיסה שוב ב 540 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>שאפו שוב את הסופרנאטנט והשאירו מספיק תמיסה (0.5 מ"ל) כדי להשעות מחדש את הכדורית, פיפטה במרץ, להפיל את גלולת התא המרחפת על המגלשות ולייבש באוויר. אחסן את השקופיות ב- 4 ° C.</li>
	</ol></li>
	<li>אימונופלואורסנציה הערה: אימונופלואורסנציה היא שיטה אימונולוגית לזיהוי מטרות תאים ספציפיות באמצעות נוגדן ראשוני הקושר את המטרה עצמה ונוגדן משני פלואורסצנטי הקושר את הראשוני המאפשר למקם את המטרה11. במקרה זה, עכבר חד שבטי anti-53BP1 (1:50) ו ארנב רב שבטי anti-γH2AX (1:50) משמשים נוגדנים ראשוניים, בעוד AlexaFluor568 נגד עכבר (1:400) ו DyLight488 נגד ארנב (1:200) משמשים נוגדנים משניים, בהתאמה.<ol><li>שטפו את המגלשות פעמיים ב-50 מ"ל של 1x PBS במשך 5 דקות בצנצנת קופלין (16 שקופיות גב אל גב).</li>
		<li>לאחר מכן שמור אותם למשך 30 דקות בתמיסת חסימה (10 מ"ל של FBS, 10 מ"ל של 10x PBS, 80 מ"ל של מים נטולי יונים, 300 מיקרוליטר של Triton-X).</li>
		<li>הוסף לכל שקופית 10 μL של כל אחת משתי התמיסות המכילות את הנוגדנים הראשוניים המומסים בתמיסת החסימה. מכסים את המגלשות בסרט פרפין ודגרים בטמפרטורה של 4°C למשך הלילה.</li>
		<li>לאחר הדגירה, יש לבצע שלוש שטיפות ב-1x PBS במשך 5 דקות.</li>
		<li>הוסף לכל שקופית 10 μL של כל אחת משתי התמיסות המכילות את הנוגדנים המשניים המומסים בתמיסת החסימה. מכסים את המגלשות בסרט פרפין ודגרים בטמפרטורת החדר למשך שעתיים.</li>
		<li>בצעו שלוש שטיפות ב-1x PBS במשך 5 דקות.</li>
		<li>הוסף 2.5 μL של תמיסת אנטי-דהייה עם DAPI על הכיסויים לפני ההרכבה כדי להכתים את הגרעינים. הערה: על מנת להעריך קינטיקה מוקדית, ההליך זהה למתואר מ 1.1 ל 1.4, וציין כי קצירת תאים ואת immunofluorescence כפול מבוצעים ב 0 שעות, לאחר 2 שעות לאחר טיפול bleomycin ולאחר מכן, לאחר הסרת mutagen, ב 4 שעות, 6 שעות, ו 24 שעות לאחר הטיפול.</li>
	</ol></li>
</ol>2. ניתוח באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי
הערה: "מיקרוסקופ פלואורסצנטי" מתייחס לכל מיקרוסקופ המשתמש בפלואורסצנטיות כדי ליצור תמונה. הדגימה מוארת באור מסוים (או אורכי גל) הנבלע על ידי הפלואורופורים, מה שגורם להם לפלוט אור באורכי גל ארוכים יותר12. AlexaFluor568 ו-DyLight 488 בולעים אור של כ-568 ו-488 ננומטר ופולטים אור של 603 ו-520 ננומטר, בהתאמה. לכן, הם נראים כמו פלואורסצנטיות אדומה או ירוקה באמצעות מסנן TRITC או FITC, בהתאמה.
<ol><li>דרג את נוכחות המוקדים בכל שקופית תחת יעד טבילה של 100x (איור 1).</li>
	<li>הניחו 200 גרעינים בכל שקופית וספרו את מספר מוקדי γH2AX/53BP1 בכל גרעין.</li>
	<li>תוצאות אקספרס במונחים של מספר המוקדים הממוצע לכל סך הגרעינים שדורגו. אלה כוללים גרעיני γH2AX/53BP1 חיוביים (מראים לפחות אות פלואורסצנטי אחד) ושליליים (לא מראים אות פלואורסצנטי אחד).</li>
</ol>

<ol><li>Chatterjee, N., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+DNA+damage%2C+repair+and+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+and+Molecular+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of DNA damage, repair and mutagenesis.</a> Environmental and Molecular Mutagenesis. 58 (5), 235-263 (2017).</li>
<li>Aleksandrov, R., Hristova, R., Stoynov, S., Gospodinov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chromatin+response+to+double-strand+DNA+breaks+and+their+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">The chromatin response to double-strand DNA breaks and their repair.</a> Cells. 9 (8), 1853(2020).</li>
<li>Jackson, S. P., Bartek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA-damage+response+in+human+biology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The DNA-damage response in human biology and disease.</a> Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).</li>
<li>Dickey, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H2AX%3A+functional+roles+and+potential+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">H2AX: functional roles and potential applications.</a> Chromosoma. 118 (6), 683-692 (2009).</li>
<li>Her, J., Bunting, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+cells+ensure+correct+repair+of+DNA+double-strand+break%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%2C+Thematic+Minireview%22%5BJournal%5D)">How cells ensure correct repair of DNA double-strand break.</a> Journal of Biological Chemistry, Thematic Minireview. 293 (27), 10502-10511 (2018).</li>
<li>Kuo, L. K., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B3-H2AX+-+A+novel+biomarker+for+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vivo%22%5BJournal%5D)">γ-H2AX - A novel biomarker for DNA double-strand breaks.</a> In Vivo. 22 (3), 305-310 (2008).</li>
<li>Bártová, E., Legartova, S., Dundr, M., Suchánková, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+of+the+53BP1+protein+in+genome+protection%3A+structural+and+functional+characteristics+of+53BP1-dependent+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Aging%22%5BJournal%5D)">A role of the 53BP1 protein in genome protection: structural and functional characteristics of 53BP1-dependent DNA repair.</a> Aging. 11 (8), 2488-2511 (2019).</li>
<li>Popp, H. D., Brendel, S., Hofman, W., Fabarius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescence+microscopy+of+%CE%B3H2AX+and+53BP1+for+analyzing+the+formation+and+repair+of+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescence microscopy of γH2AX and 53BP1 for analyzing the formation and repair of DNA double-strand breaks.</a> Journal of Visualized Experiments. (129), 56617(2017).</li>
<li>Jezkova, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particles+with+similar+LET+values+generate+DNA+breaks+of+different+complexity+and+reparability%3A+a+high-resolution+microscopy+analysis+of+%CE%B3H2AX%2F53BP1+foci%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Particles with similar LET values generate DNA breaks of different complexity and reparability: a high-resolution microscopy analysis of γH2AX/53BP1 foci.</a> Nanoscale. 10, 1162-1179 (2018).</li>
<li>Scarpato, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+nuclear+phosphorylation+%28%CE%B3-H2AX%29+in+human+lymphocytes+treated+in+vitro+with+UVB%2C+bleomycin+and+mitomycin+C%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Kinetics of nuclear phosphorylation (γ-H2AX) in human lymphocytes treated in vitro with UVB, bleomycin and mitomycin C.</a> Mutagenesis. 28 (4), 465-473 (2013).</li>
<li>Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+performing+immunofluorescence+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An introduction to performing immunofluorescence staining.</a> Methods in Molecular Biology. 1897, 299-311 (2019).</li>
<li>Sanderson, M. J., Smith, I., Parker, I., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSanderson%2C+MJ+%22Fluorescence+microscopy%22">Fluorescence microscopy</a>. 10, Cold Spring Harbor Protocol. (2014).</li>
<li>Jamur, M. C., Oliver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+fixatives+for+immunostaining%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell fixatives for immunostaining.</a> Methods in Molecular Biology. , 55-61 (2010).</li>
<li>Jamur, M. C., Oliver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeabilization+of+the+cell+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Permeabilization of the cell membrane.</a> Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).</li>
<li>Hecht, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bleomycin%3A+New+perspectives+on+the+mechanism+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Natural+Products%22%5BJournal%5D)">Bleomycin: New perspectives on the mechanism of action.</a> Journal of Natural Products. 63, 158-168 (2000).</li>
<li>Fei, P., El-Deiry, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P53+and+radiation+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">P53 and radiation responses.</a> Oncogene. 22, 5774-5783 (2003).</li>
<li>Mahaney, B. L., Meek, K., Lees-Miller, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+ionizing+radiation-induced+DNA+double-strand+breaks+by+non-homologous+end-joining%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Repair of ionizing radiation-induced DNA double-strand breaks by non-homologous end-joining.</a> Biochemical Journal. 417 (3), 639-650 (2009).</li>
<li>Palla, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamma-H2AX%3A+Can+it+be+established+as+a+classical+cancer+prognostic+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Tumor+Biology%22%5BJournal%5D)">Gamma-H2AX: Can it be established as a classical cancer prognostic factor.</a> Tumor Biology. 39 (3), 1010428317695931(2017).</li>
<li>Markovà, E., Hillert, L., Malmgren, L., Persson, B. R. R., Belyaev, I. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microwaves+from+GSM+mobile+telephones+affect+53BP1+and+gamma-H2AX+foci+in+human+lymphocytes+from+hypersensitive+and+healthy+persons%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Health+Perspectives%22%5BJournal%5D)">Microwaves from GSM mobile telephones affect 53BP1 and gamma-H2AX foci in human lymphocytes from hypersensitive and healthy persons.</a> Environmental Health Perspectives. 113 (9), 1172-1177 (2005).</li>
<li>Scarpato, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+damage+in+peripheral+lymphocytes+of+obese+and+overweight+Italian+children+as+evaluated+by+the+%CE%B3-H2AX+focus+assay+and+micronucleus+test%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Nuclear damage in peripheral lymphocytes of obese and overweight Italian children as evaluated by the γ-H2AX focus assay and micronucleus test.</a> The FASEB Journal. 25 (2), 685-693 (2018).</li>
<li>Shanbhag, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+neuronal+accumulation+of+DNA+double-strand+breaks+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communication%22%5BJournal%5D)">Early neuronal accumulation of DNA double-strand breaks in Alzheimer's disease.</a> Acta Neuropathologica Communication. 7 (1), 77(2019).</li>
<li>Lassmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+formation+of+gamma-H2AX+and+53BP1+DNA+repair+foci+in+blood+cells+after+radioiodine+therapy+of+differentiated+thyroid+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nuclear+Medicine%22%5BJournal%5D)">In vivo formation of gamma-H2AX and 53BP1 DNA repair foci in blood cells after radioiodine therapy of differentiated thyroid cancer.</a> Journal of Nuclear Medicine. 51 (8), 1318-1325 (2010).</li>
<li>Derlin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+%CE%B3-H2AX+and+53BP1+foci+in+peripheral+blood+lymphocytes+to+predict+subclinical+hematotoxicity+and+response+in+somatostatin+receptor-targeted+radionuclide+therapy+for+advanced+gastroenteropancreatic+neuroendocrine+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Assessment of γ-H2AX and 53BP1 foci in peripheral blood lymphocytes to predict subclinical hematotoxicity and response in somatostatin receptor-targeted radionuclide therapy for advanced gastroenteropancreatic neuroendocrine tumors.</a> Cancers (Basel). 13 (7), 1516(2021).</li>
<li>Djuzenova, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiosensitivity+in+breast+cancer+assessed+by+the+histone+%CE%B3-H2AX+and+53BP1+foci%5BTitle%5D)+AND+%22Radiation+Oncology%22%5BJournal%5D)">Radiosensitivity in breast cancer assessed by the histone γ-H2AX and 53BP1 foci.</a> Radiation Oncology. 24, 8-98 (2013).</li>
<li>Atkinson, J., Bezak, E., Kempson, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+DNA+double-strand+breaks+-+are+we+there+yet%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+in+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Imaging DNA double-strand breaks - are we there yet.</a> Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 23, 579-580 (2022).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

ניתוח אימונופלואורסנציה של מוקדי γH2AX ו-53BP1 הוא שיטה מתאימה להערכת נזק גנומי בגרעינים בין-פאזיים של מערכת תאים. הליך זה יש כמה נקודות קריטיות שיכולות להשפיע על התוצאה של הניסויים, בעיקר, הסוכנים המשמשים קיבוע וחדירה, סוג הנוגדנים וגורמי דילול שלהם, ואת ריכוז של mutagen.
שמירה על שלמות החלבון היא בסיסית שכן שיטת immunofluorescence מצפה לזהות אנטיגנים כי הם בעיקר חלבונים. בפרוטוקול זה, מתנול משמש לתיקון לימפוציטים. שלב זה חשוב במיוחד מכיוון שאלכוהול פועל על ידי החלפת מים וגרימת משקעים של חלבו...

נזק לדנ"א נגרם באופן מתמשך על ידי חומרים שיכולים להיות אנדוגניים, כגון ROS שנוצר על ידי מטבוליזם חמצוני תאי, או אקסוגני, הן כימיקלים והן פיזיים1. בין הנגעים המזיקים ביותר, שברים דו-גדיליים (DSB) ממלאים תפקיד בסיסי בתרומה לאי יציבות גנומית, שכן הם גורמים לסטיות כרומוזומים שבתורן יכולות להתחיל את תהליך הקרצינוגנזה. לפיכך, תאים מסופקים עם מנגנונים מורכבים ויעילים של DSB תיקון2.
כאשר DSB מתרחש, התא מפעיל את תגובת הנזק לדנ"א (DDR) שבה, יחד עם קומפלקס MRE11/RAD50/NBS1, קינאזות ATM או ATR מגויסות כדי להפעיל חלבונים אחרים שמאטים או עוצרים את מחזור התא3. מטרה חיונית של קינאזות אלה היא היסטון H2AX, אשר פוספורילציה על Ser-139 בתוך כמה מגה-בסיסים מן DSB (כלומר γH2AX), ובכך מאפשר גיוס של מספר גורמי תיקון כגון, בין היתר, BRCA1 ו p53 קושר חלבון 1 (53BP1)3. מאוחר יותר, מסלול אחד בין רקומבינציה הומולוגית (HR), חיבור קצה לא הומולוגי (NHEJ), או חישול חד-גדילי (SSA) מופעל כדי לתקן את DSBs 4,5. לכן, 53BP1 מעורב בהכתבת הבחירה בין HR או NHEJ, בעיקר קידום ההפעלה של NHEJ ולא HR6. יתר על כן, הן הצורה הזרחנית של היסטון H2AX והן 53BP1 יכולות ליצור מוקדים באתרי DSB. מכיוון שמוקדים אלה נמשכים עד לשחזור שלמות הגדיל הכפול, הערכת המראה / היעלמות של מוקדי γH2AX או 53BP1 במרווח זמן נחשבת לשיטה שימושית להערכת המופע והתיקון של DSB במערכת התא 6,7. עם זאת, על פי התהליכים המולקולריים שתוארו לעיל, מכיוון שמוקדי γH2AX ו- 53BP1 צפויים להתמקם יחד ליד ה- DSB במהלך DDR8,9, זה יכול להיות שימושי לזהות בו זמנית את נוכחותם של סמנים אלה באימונופלואורסנציה כפולה.
לפיכך, מטרת כתב היד הייתה להעריך את התאמתם של מוקדי γH2AX ו-53BP1 בו זמנית כדי להעריך את הנזק הגנומי שנגרם בלימפוציטים היקפיים אנושיים על ידי הסוכן הרדיומימטי בלומיצין. באמצעות אותה מתודולוגיה, ניסינו גם להגדיר קינטיקה של תיקון של DSB המושרה על ידי בלומיצין על פי הליך ניסיוני10 שהוקם בעבר.

<table><tbody><tr><td>AlexaFluor 568 עז נגד עכבר IgG (&גמא; 1)</td> <td>Invitrogen</td><td>A21124</td><td>53BP1 נוגדן משני</td></tr><tr><td>Bleoprim</td><td>Sanofi</td><td></td><td>bleomycin sulfate (mutagen)</td></tr> <tr><td>תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין 100X</td><td>Euroclone</td><td>ECB3001D</td><td>אנטיביוטיקה לתרבית מדיום</td></tr><tr><td>PBS 10X</td><td>Termofisher</td><td>14200075</td><td>Phosphate-buffered</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Euroclone</td><td>EC20180L</td><td>סרום בקר עוברי לאימונופלואורסצנציה</td></tr><tr><td>עיזים אנטי ארנב IgG (H + L) DyLight 488 Coniugated</td><td>Termofisher</td> <td># 35552</td><td>&gamma; נוגדן משני H2AX</td></tr><tr><td>עכבר אנטי-53BP1 נוגדן חד שבטי</td><td>Merck</td><td>MAB 3802</td><td>53BP1 נוגדן ראשוני</td></tr><tr><td>Labophot 2</td><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי</td><td>של ניקון</td><td></td></tr><tr><td>P-histone H2AX (Ser139) נוגדן ארנב</td><td>איתות תאים</td> <td>#2577</td><td>&gamma; נוגדן ראשוני H2AX</td></tr><tr><td>Phytohemoagglutinin</td><td>Termofisher</td><td></td><td>R30852801 רכיב של מדיום תרבית</td></tr><tr><td>Prolong gold antifade reagent with DAPI</td><td>Cell Signaling</td><td>#8961</td><td>תמיסת אנטי-דהייה עם DAPI לצביעה נגדית</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Euroclone</td><td>ECB9006L</td><td>תרבית מדיום</td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td>חומר ניקוי לא יוני עבור חדירות</td></tr></tbody></table>

אימונופלואורסנציה כפולה של γh2ax ו- 53bp1 בלימפוציטים היקפיים אנושיים

Dual Immunofluorescence of &#947;H2AX and 53BP1 in Human Peripheral Lymphocytes

שברי גדיל כפול (DSB) הם אחד הנגעים החמורים ביותר שיכולים להתרחש בגרעין התא, ואם לא יתוקנו, הם יכולים להוביל לתוצאות חמורות, כולל סרטן. התא, אם כן, מסופק עם מנגנונים מורכבים לתיקון DSBs, ומסלולים אלה כוללים היסטון H2AX בצורתו הזרחנית ב- Ser-139 (כלומר γH2AX) וחלבון קושר p53 1 (53BP1). מכיוון ששני החלבונים יכולים ליצור מוקדים באתרי DSBs, זיהוי סמנים אלה נחשב לשיטה מתאימה לחקור הן את DSB והן את קינטיקה התיקון שלהם. על פי התהליכים המולקולריים המובילים להיווצרות מוקדי γH2AX ו-53BP1, זה יכול להיות שימושי יותר לחקור את הלוקליזציה המשותפת שלהם ליד ה-DSB על מנת להקים גישה חלופית המאפשרת לכמת DSB על ידי זיהוי סימולטני של שני סמני נזק לדנ"א. לפיכך, פרוטוקול זה נועד להעריך את הנזק הגנומי הנגרם בלימפוציטים אנושיים על ידי הסוכן הרדיומימטי בלומיצין באמצעות נוכחות של מוקדי γH2AX ו- 53BP1 באימונופלואורסנציה כפולה. באמצעות מתודולוגיה זו, תיארנו גם את השונות במספר מוקדי γH2AX ו-53BP1 לאורך זמן, כניסיון ראשוני לחקור את קינטיקה התיקון של DSB המושרה על ידי בלומיצין.

נתונים המתקבלים על ידי ניתוח מיקרוסקופ פלואורסצנטי של לימפוציטים היקפיים מאפשרים לנו להעריך שלושה היבטים עיקריים: היעילות של טיפול בלומיצין בהגדלת מספר מוקדי γH2AX ו- 53BP1 (ולכן של DSBs) בשל השפעתו המוטגנית, באיזו מידה שני מוקדים לוקליזציה משותפת באתר של DSBs, ואת מהלך הזמן של γH2AX ו 53BP1 מוקדים כדי לשרטט את קינטיקה תיקון של DSB המושרה בלומיצין. כצפוי, נצפתה תדירות גבוהה מאוד של מוקדי γH2AX ו-53BP1 בין תאים לא מטופלים לתאים מטופלים, מה שמאשר כי בלומיצין גורם להיווצרות DSB בלימפוציטים היקפיים (איור...

פרוטוקול זה מציג שיטה להערכת היווצרות ותיקון של פריצות דו-גדילי DNA באמצעות זיהוי סימולטני של מוקדי γH2AX ו-53BP1 בגרעינים בין-פאזיים של לימפוציטים היקפיים אנושיים שטופלו בבלומיצין.

אימונופלואורסנציה כפולה של γH2AX ו- 53BP1 בלימפוציטים היקפיים אנושיים

Double strand breaks (DSBs) are one of the most severe lesions that can occur in cell nuclei, and, if not repaired, they can lead to severe outcomes, ...

מטרת כתב היד הייתה להעריך את התאמת הכימות הסימולטני של מוקדי גמא H2AX ו-53BP1 כדי להעריך את הנזק הגנומי שנגרם בלימפוציטים היקפיים אנושיים על ידי בלומיצין. מספר גורמים יכולים לגרום לשברים כפולים. התאים מקבלים אפוא מספר מנגנוני תיקון, המערבים גם גמא H2AX וגם 53 חלבון קושר 1, שיכולים למקם יחד ליד שבר הגדיל הכפול.לאחר איסוף דגימות דם שלמות, להוסיף 300 מיקרוליטר של מדגם לצינור המכיל 4.7 מיליליטר של מדיום מלא. לאחר מכן להוסיף חמישה מיקרוגרם למיליליטר של ריכוז הסופי של בלומיצין סולפט. עבור כל דגימה, הגדר פקד שלילי.שים את הצינור בתרמוסטט ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים. דגימות צנטריפוגות ב 540 גרם במשך חמש דקות. לאחר מכן להוסיף חמישה מיליליטר של פתרון hypotonic לכדור.לאחר מכן להוסיף 400 מיקרוליטר של פתרון מראש קיבוע על מנת לגרום המוליזה. דגימות צנטריפוגות ב 540 גרם במשך חמש דקות, ולאחר מכן להשהות מחדש גלולה בחמישה מיליליטר מתנול בטמפרטורת החדר לפחות 30 דקות כדי לתקן את התאים. דגימות צנטריפוגות ב 540 גרם במשך חמש דקות, ולאחר מכן להשהות מחדש את הגלולה בחמישה מיליליטר של פתרון קיבוע.חזור על שלב זה פעם נוספת. צנטריפוגה שוב ב 540 G במשך חמש דקות, ואז לשאוף supernatant משאיר מספיק פתרון כדי להשהות מחדש את הכדור. שחרר את גלולת התא התלויה מחדש על המגלשות.הכינו את שתי התמיסות המכילות את האנטי-גמא H2AX ואת האנטי-53BP1 הנוגדנים הראשוניים המומסים בתמיסת חסימה. לאחר מכן שטפו שקופיות פעמיים ב-PBS 1X. לאחר מכן שמור שקופיות למשך 30 דקות בתמיסת חסימה.הוסף לכל שקופית 10 מיקרוליטר של כל אחת משתי התמיסות המכילות את הנוגדנים הראשוניים המומסים בתמיסת חסימה. כסו את השקופיות בפרפילם. דוגרים בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה.לאחר הדגירה, בצע שלוש שטיפות ב- PBS 1X במשך חמש דקות. הכינו את שתי התמיסות המכילות נוגדנים משניים DyLight 488 ו-Alexa Fluor 568 המומסים בתמיסת חסימה. לאחר מכן הוסף לכל שקופית 10 מיקרוליטר של כל אחת משתי התמיסות המכילות את הנוגדנים המשניים המומסים בתמיסת חסימה.מכסים את המגלשות בפרפילם ודגרים בטמפרטורת החדר במשך שעתיים. לאחר הדגירה השנייה, בצעו שלוש שטיפות ב-PBS 1X במשך חמש דקות. הוסף 2.5 מיקרוליטר של תמיסת Antifade עם DAPI על פתקי הכיסוי לפני ההרכבה כדי למנוע כתמים של הגרעינים.על מנת להעריך מוקדים קינטיים, ההליך זהה למתואר כעת. השלב האחרון הוא תצפית וכימות מוקדים. לימפוציטים אנושיים ללא מוקדי גמא H2AX ו-53BP1 מוצגים ב-A, ב-B, וב-C מוצגים לימפוציטים אנושיים עם כמויות שונות של מוקדי גמא H2AX ו-53BP1.זה נצפתה רמה נמוכה של לוקליזציה משותפת מוקדים. כצפוי, תדירות גבוהה מאוד של מוקדי גמא H2AX ו- 53BP1 נצפים בין תאים לא מטופלים. כמו כן, הבדל גדול נצפה במספר המוקדים של שני הסמנים.מהלך הזמן של מוקדי גמא H2AX ו- 53BP1 לאורך זמן הראה התנהגות שונה למרות שהם תורמים לאותה פונקציה. לניתוח מוקדי גמא H2AX ו-53BP1 יש את היכולת להעריך את התגובה התאית בחשיפה או בהקשרים פתולוגיים. עם זאת, גמא H2AX ו 53BP1 כפול immunofluorescence יכול להוביל לזלזל בתדירות האמיתית של האירוע.

dual-immunofluorescence-h2ax-53bp1-human-peripheral

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

כימות של גדיל הדנ"א הכפול פסים באמצעות היווצרות γH2AX כסמן המולקולרית הפכה כלי רב ערך בביולוגיה קרינה. כאן אנו מדגימים את השימוש assay immunofluorescence עבור כימות γH2AX מוקדים לאחר חשיפה לקרינה של תאים.

כימות γH2AX מוקדים בתגובה קרינה Ionising

Quantitation של גדיל הדנ"א הכפול נשבר על בסיס γH2AX מוקדים הפך כלי רב ערך, במיוחד בביולוגיה קרינה, להערכת radiosensitivity רקמות ההשפעות של תרכובות קרינה שינוי. כאן אנו מדגימים את השימוש assay immunofluorescence עבור quantitation של γH2AX מוקדים של דגימות רקמה.

Quantitation של γH2AX מוקדים של דגימות רקמה

ניתוח מיקרוסקופי של γH2AX מוקדים, אשר הטופס הבא זירחון של H2AX ב Ser-139 בתגובה פעמיים גדיל הדנ"א נשבר, הפך להיות כלי רב ערך בביולוגיה קרינה. כאן השתמשנו נוגדנים מונו מפוגל היסטון H3 ב ליזין 4 כסמן epigenetic של euchromatin פעיל לתעתוק, כדי להעריך את הפריסה המרחבית של היווצרות γH2AX קרינה הנגרמת בתוך הגרעין.

הערכת התפלגות מרחבית של γH2AX הבאים בקרינה מייננת

בסרטון זה, אנו מתארים את טכניקת המיקרוסקופ האימונופלואורסצנטי כדי לזהות חלבונים ספציפיים של תגובת נזק לדנ"א הממוקמים באתרים של שברים דו-גדיליים בדנ"א בתאים חד-גרעיניים אנושיים. החלבונים מזוהים על ידי נוגדנים ראשוניים ספציפיים, אשר בתורם נקשרים לנוגדנים משניים המתויגים בפלואורופור הפולטים פלואורסצנט במהלך הדמיה מיקרוסקופית, ומאפשרים הדמיה של החלבונים כמוקדים פלואורסצנטיים נפרדים בתוך גרעיני התא.

מיקרוסקופ אימונופלואורסנציה לניתוח שברים דו-גדיליים של DNA

כתב יד זה מספק פרוטוקול לניתוח של מעברי כפול-גדיל ה-DNA על ידי מיקרוסקופ immunofluorescence של γH2AX ושל 53BP1.

מיקרוסקופ immunofluorescence של γH2AX ו 53BP1 לניתוח את היווצרות והתיקון של מעברי כפול-גדיל ה-DNA

תיקון של זוגיות-גדיל DNA מעברי הוא תהליך דינמי, הדורשים לא רק היווצרות תיקון מכלולי השברים, אבל גם הרזולוציה שלהן לאחר הנגע הוא ממוען. כאן, אנו משתמשים מיקרוסקופ immunofluorescence עבור ארעי לטווח ארוך כפול גדילי ומעברי ככלי לנתח מנגנון תחזוקה זה הגנום.

אפיון תהליכי תיקון DNA-ארעי ומעברי DNA ארוך כפול-strand על ידי מיקרוסקופ Immunofluorescence

המושרה קרינה נזק DNA תגובה המופעלת על ידי מעורב נייטרון קרן המשמש בטיפול בורון נייטרון לכידת (BNCT) לא הוקמה במלואה. פרוטוקול זה מספק הליך צעד אחר צעד כדי לזהות וקדי המושרה קרינה (רי ' ף) של תיקון חלבונים על ידי immunofluorescence כתמים של סרטן המעי הגס האנושי התאים לאחר הקרנה עם הקורה מעורב נייטרונים.

Immunofluorescence הדמיה של נזק לדנ א ותיקון Foci בתאי סרטן המעי הגס האנושי

בעקבות נזק DNA, תאים אנושיים להפעיל מסלולי תיקון חיוניים כדי לשחזר את שלמות הגנום שלהם. כאן, אנו מתארים את השיטה של חיסון עקיף כאמצעי לזיהוי חלבוני תיקון DNA, לנתח את הגיוס המרחבי והזמני שלהם, ולעזור לחקור אינטראקציה חלבון-חלבון באתרים של נזק DNA.

הדמיה של אינטראקציה חלבוני תיקון DNA על ידי אימונופלואורסץ

פרוטוקול זה מציג את הכנת השקופית ואת הניקוד האוטומטי של γ-H2AX foci בדיקה על לימפוציטים דם היקפיים. כדי להמחיש את השיטה והרגישות של ההסתה, לימפוציטים מבודדים היו מוקרן במבחנה. שיטה אוטומטית זו של זיהוי DNA DSB שימושית עבור יישומי dosimetry ביולוגיים מהירים ותפוקה גבוהה.

שיטת ניקוד מיקרוסקופית אוטומטית לבדיקת מוקדי γ-H2AX בלימפוציטים אנושיים היקפיים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול פשוט ומהיר לזיהוי אינטראקציה של חלבונים באתרי נזק לדנ"א.

בדיקת ליגנד קרבה למיקום חלבונים באתרי נזק לדנ"א

למדו אימונופלואורסנציה כפולה של γH2AX ו-53BP1 בלימפוציטים היקפיים אנושיים לבחינת נזקי DNA ותהליכי תיקון. שיטה זו מאפשרת הערכה מדויקת של שבירות דו-גדיליות שנגרמו על ידי בליאומיצין.

אימונופלואורסנציה כפולה של γH2AX ו- 53BP1 בלימפוציטים היקפיים אנושיים

גלה סרטונים נוספים