אימונופלואורסנציה כפולה של γH2AX ו- 53BP1 בלימפוציטים היקפיים אנושיים
14 ביולי 2023
פרוטוקול זה מציג שיטה להערכת היווצרות ותיקון של פריצות דו-גדילי DNA באמצעות זיהוי סימולטני של מוקדי γH2AX ו-53BP1 בגרעינים בין-פאזיים של לימפוציטים היקפיים אנושיים שטופלו בבלומיצין.
מטרת כתב היד הייתה להעריך את התאמת הכימות הסימולטני של מוקדי גמא H2AX ו-53BP1 כדי להעריך את הנזק הגנומי שנגרם בלימפוציטים היקפיים אנושיים על ידי בלומיצין. מספר גורמים יכולים לגרום לשברים כפולים. התאים מקבלים אפוא מספר מנגנוני תיקון, המערבים גם גמא H2AX וגם 53 חלבון קושר 1, שיכולים למקם יחד ליד שבר הגדיל הכפול.
לאחר איסוף דגימות דם שלמות, להוסיף 300 מיקרוליטר של מדגם לצינור המכיל 4.7 מיליליטר של מדיום מלא. לאחר מכן להוסיף חמישה מיקרוגרם למיליליטר של ריכוז הסופי של בלומיצין סולפט. עבור כל דגימה, הגדר פקד שלילי.
שים את הצינור בתרמוסטט ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים. דגימות צנטריפוגות ב 540 גרם במשך חמש דקות. לאחר מכן להוסיף חמישה מיליליטר של פתרון hypotonic לכדור.
לאחר מכן להוסיף 400 מיקרוליטר של פתרון מראש קיבוע על מנת לגרום המוליזה. דגימות צנטריפוגות ב 540 גרם במשך חמש דקות, ולאחר מכן להשהות מחדש גלולה בחמישה מיליליטר מתנול בטמפרטורת החדר לפחות 30 דקות כדי לתקן את התאים. דגימות צנטריפוגות ב 540 גרם במשך חמש דקות, ולאחר מכן להשהות מחדש את הגלולה בחמישה מיליליטר של פתרון קיבוע.
חזור על שלב זה פעם נוספת. צנטריפוגה שוב ב 540 G במשך חמש דקות, ואז לשאוף supernatant משאיר מספיק פתרון כדי להשהות מחדש את הכדור. שחרר את גלולת התא התלויה מחדש על המגלשות.
הכינו את שתי התמיסות המכילות את האנטי-גמא H2AX ואת האנטי-53BP1 הנוגדנים הראשוניים המומסים בתמיסת חסימה. לאחר מכן שטפו שקופיות פעמיים ב-PBS 1X. לאחר מכן שמור שקופיות למשך 30 דקות בתמיסת חסימה.
הוסף לכל שקופית 10 מיקרוליטר של כל אחת משתי התמיסות המכילות את הנוגדנים הראשוניים המומסים בתמיסת חסימה. כסו את השקופיות בפרפילם. דוגרים בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה.
לאחר הדגירה, בצע שלוש שטיפות ב- PBS 1X במשך חמש דקות. הכינו את שתי התמיסות המכילות נוגדנים משניים DyLight 488 ו-Alexa Fluor 568 המומסים בתמיסת חסימה. לאחר מכן הוסף לכל שקופית 10 מיקרוליטר של כל אחת משתי התמיסות המכילות את הנוגדנים המשניים המומסים בתמיסת חסימה.
מכסים את המגלשות בפרפילם ודגרים בטמפרטורת החדר במשך שעתיים. לאחר הדגירה השנייה, בצעו שלוש שטיפות ב-PBS 1X במשך חמש דקות. הוסף 2.5 מיקרוליטר של תמיסת Antifade עם DAPI על פתקי הכיסוי לפני ההרכבה כדי למנוע כתמים של הגרעינים.
על מנת להעריך מוקדים קינטיים, ההליך זהה למתואר כעת. השלב האחרון הוא תצפית וכימות מוקדים. לימפוציטים אנושיים ללא מוקדי גמא H2AX ו-53BP1 מוצגים ב-A, ב-B, וב-C מוצגים לימפוציטים אנושיים עם כמויות שונות של מוקדי גמא H2AX ו-53BP1.
זה נצפתה רמה נמוכה של לוקליזציה משותפת מוקדים. כצפוי, תדירות גבוהה מאוד של מוקדי גמא H2AX ו- 53BP1 נצפים בין תאים לא מטופלים. כמו כן, הבדל גדול נצפה במספר המוקדים של שני הסמנים.
מהלך הזמן של מוקדי גמא H2AX ו- 53BP1 לאורך זמן הראה התנהגות שונה למרות שהם תורמים לאותה פונקציה. לניתוח מוקדי גמא H2AX ו-53BP1 יש את היכולת להעריך את התגובה התאית בחשיפה או בהקשרים פתולוגיים. עם זאת, גמא H2AX ו 53BP1 כפול immunofluorescence יכול להוביל לזלזל בתדירות האמיתית של האירוע.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מציג שיטה להערכת היווצרותם ותיקונם של שברים דו-גדיליים ב-DNA באמצעות זיהוי סימולטני של מוקדי γH2AX ו-53BP1 בגרעיני תאים בשלב האינטרפאזה של לימפוציטים פריפריים אנושיים שטופלו בבלאומיצין.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- גנומיקה
רקע
- ניתן להשרות שברים דו-גדיליים על ידי גורמים שונים.
- לתאים ישנם מספר מנגנוני תיקון לנזקי DNA.
- $\gamma\text{H2AX}$ ו-53BP1 הם חלבוני מפתח המעורבים בתיקון DNA.
- קו-לוקליזציה (Co-localization) של חלבונים אלו מתרחשת סמוך לשברים דו-גדיליים.
מטרת המחקר
- להערכת התאמת הכימות הסימולטנית של מוקדי γH2AX ו-53BP1.
- להערכת נזק גנומי בלימפוקיטים פריפריים אנושיים.
- להבנת ההשפעות של bleomycin על שלמות ה-DNA.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- דגימות דם מלא נאספות מנבדקים אנושיים.
- הדגימות מטופלות בבלאומייצין סולפט (bleomycin sulfate).
- ביקורות שליליות מוכנות לצורך השוואה.
- ביצוע זיהוי של מוקדי γH2AX ו-53BP1 בגרעיני תאים בשלב האינטרפאזה.
תוצאות עיקריות
- גילוי סימולטני של מוקדי γH2AX ו-53BP1 הוא בר-ביצוע.
- טיפול בבלאומיצין מוביל לנזק למסלול ה-DNA שניתן למדידה.
- כימות המוקדים נמצא במתאם עם היקף הנזק הגנומי.
- התוצאות תומכות בשימוש בשיטה זו להערכת מנגנוני תיקון DNA.
מסקנות
- הפרוטוקול מעריך ביעילות את היווצרותם ותיקונם של שברים דו-גדיליים ב-DNA.
- זיהוי סימולטני של γH2AX ו-53BP1 מספק תובנות בעלות ערך.
- ניתן ליישם שיטה זו במגוון מחקרים על נזק ותיקון של DNA.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית רחבה
זיהוי כמותי של סמני שבירה של גדילי DNA כפולים (DSB), γH2AX ו-53BP1 בלימפוציטים אנושיים, מאפשר הערכה מדויקת של נזק גנומי וקינטיקה של תיקון. גישה כפולה זו של אימונופלואורסצנציה מחזקת את הביטחון החזוי בסריקת גנוטוקסיות מוקדמת ובהסרת סיכונים מכניסטית עבור תרכובות מועמדות. שילוב של מדדים אלו בשלב הגילוי תומך בהחלטות פורטפוליו מותאמות סיכון ובהמשכיות תרגומית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בדיקה ישירה של נתיבי התגובה לנזקי DNA בתאים אנושיים.
- תומך בהסרת סיכונים מכניסטית על ידי כימות השראת DSB וקינטיקת תיקון.
- מקל על תיקוף תפקודי של מטרות המעורבות ביציבות הגנום.
- משפר את הביטחון החזוי לגבי חסרונות של רעילות גנומית בתרכובות מובילות.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מספק מערכת מתוקתקת לכימות סממנים לנזקי DNA בתאי אדם ראשוניים.
- מאפשר קריאות כמותיות הניתנות לשחזור עבור שברים דו-גדיליים (DSBs) המושרים על ידי תרכובות.
- תומך בסטנדרטיזציה של הבדיקה לצורך סריקת תוכן גבוהה (high-content screening) של מווסתים לנזקי DNA.
- מקל על הערכה מהימנה של פרופילי בטיחות של תרכובות בסריקות ראשוניות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה את הכימות של סממני נזקי DNA לאסטרטגיות של סממנים ביומטריים תרגומיים.
- תומכת ברצף מהגילוי in vitro ועד להערכת בטיחות פרה-קלינית.
- מאפשרת קידום מותאם סיכונים של מועמדים בעלי פרופילי תיקון DNA נוחים.
- מספקת תובנה מכניסטית לגבי תגובות תאיות הרלוונטיות למחלה ולטיפול.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
שיטת אימונופלואורסצנציה כפולה זו ממוקמת ברצף שבין השלב המוקדם של הגילוי לשלב הפרה-קליני, ומאפשרת הערכה מונחית-השערה של נזקי DNA ותיקונם בלימפוציטים אנושיים.
- ביולוגיה של גילוי: מכמת מוקדי סממני DSB כדי להבהיר את מעורבותן של מסלולי תיקון ה-DNA והפחתת סיכונים ביולוגיים.
- סריקה: מספק פלטים כמותיים הניתנים לשחזור לצורך פרופיל גנו- độcיות של תרכובות.
- אנליטיקה: מספקת מדידות לאורך זמן של מוקדי γH2AX ו-53BP1 לצורך ניתוח השוואתי.
- מחקר תרגומי: מגשר בין ממצאים in vitro לאסטרטגיות של סממנים ביולוגיים פרה-קליניים לתגובה לנזקי DNA.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה לשימוש חוזר להערכת נזקי DNA בתוכניות גילוי שונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי ומפחית עמימות מכניסטית בהערכת נזקי DNA.
- ערך תפעולי: מנרמל את הכימות של סממני DSB לצורך הדירות ויכולת הרחבה.
- ערך אסטרטגי: מספק בסיס להחלטות go/no-go ומפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים של בדיקות גנוטוקסיות.
- השפעה על תיק המועמדים: מאפשר תעדוף מותאם-סיכון של מועמדים בהתבסס על פרופילי תיקון DNA.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במיקרוסקופיה של אימונופלואורסצנציה ובניתוח כמותי של תמונות.
- נחושה גישה לנוגדנים מאושרים ולתשתית של דימיון פלואורסצנטי.
- דורש סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי הכנת הדגימות והכימות.
- ייתכן הצורך בהתאמה עבור סוגי תאים או מערכות מודל שונות.
- סבירות להערכה חסרה של תדירות ה-DSB האמיתית בשל מגבלות של קו-לוקליזציה של סמנים.
