Name: במבחנה מודל של כלי דם אנושיים עובריים על שבב לחקר מכנוביולוגיה התפתחותית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-28T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: למדו הפרדת תאי אנדותל מגזעיות פלוריפוטנטיות אנושיות וגירוי מכני בסביבה מבוקרת. שיטה זו מאפשרת חקר מכנוביולוגיה של כלי דם עובריים בצורה מדויקת ושחזורית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענק המחקר המתקדם 2021 מהאגודה ההמטולוגית האירופית, פרס המחקר העולמי 2021 מהאגודה האמריקאית להמטולוגיה, וקרן התמיכה באסטרטגיה פנימית ISSF3 במימון קרן ברוכים הבאים ואוניברסיטת אדינבורו. אנו מודים לפיונה רוסי ממתקן ציטומטריית הזרימה על התמיכה בניתוח ציטומטריית זרימה. לצורך גישה פתוחה, המחבר החיל רישיון Creative Commons Attribution (CC BY) על כל גרסה של כתב היד המקובל על המחבר הנובעת מהגשה זו.

התמיינות וגירוי מכני של תאי אנדותל שמקורם ב-hiPSC

<ol><li>Copp, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Death+before+birth%3A+clues+from+gene+knockouts+and+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Death before birth: clues from gene knockouts and mutations.</a> Trends in Genetics. 11 (3), 87-93 (1995).</li>
<li>Ji, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Onset+of+cardiac+function+during+early+mouse+embryogenesis+coincides+with+entry+of+primitive+erythroblasts+into+the+embryo+proper%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Onset of cardiac function during early mouse embryogenesis coincides with entry of primitive erythroblasts into the embryo proper.</a> Circulation Research. 92 (2), 133-135 (2003).</li>
<li>Peacock, H. M., Daems, M., Jones, E. A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemodynamic+control+of+endothelial+cell+fates+in+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiac+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Hemodynamic control of endothelial cell fates in development.</a> Cardiac and Vascular Biology. 8, 127-166 (2021).</li>
<li>Chong, D. C., Koo, Y., Xu, K., Fu, S., Cleaver, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stepwise+arteriovenous+fate+acquisition+during+mammalian+vasculogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Stepwise arteriovenous fate acquisition during mammalian vasculogenesis.</a> Developmental Dynamics. 240 (9), 2153-2165 (2011).</li>
<li>Jaffredo, T., Gautier, R., Eichmann, A., Dieterlen-Lièvre, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraaortic+hemopoietic+cells+are+derived+from+endothelial+cells+during+ontogeny%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Intraaortic hemopoietic cells are derived from endothelial cells during ontogeny.</a> Development. 125 (22), 4575-4583 (1998).</li>
<li>Zovein, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+Tracing+reveals+the+endothelial+origin+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Fate Tracing reveals the endothelial origin of hematopoietic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3 (6), 625-636 (2008).</li>
<li>Bertrand, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haematopoietic+stem+cells+derive+directly+from+aortic+endothelium+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development.</a> Nature. 464 (7285), 108-111 (2010).</li>
<li>Boisset, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+haematopoietic+cells+emerging+from+the+mouse+aortic+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of haematopoietic cells emerging from the mouse aortic endothelium.</a> Nature. 464 (7285), 116-120 (2010).</li>
<li>Adamo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomechanical+forces+promote+embryonic+haematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Biomechanical forces promote embryonic haematopoiesis.</a> Nature. 459 (7250), 1131-1135 (2009).</li>
<li>Diaz, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomechanical+forces+promote+blood+development+through+prostaglandin+E2+and+the+cAMP-PKA+signaling+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Biomechanical forces promote blood development through prostaglandin E2 and the cAMP-PKA signaling axis.</a> Journal of Experimental Medicine. 212 (5), 665-680 (2015).</li>
<li>North, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cell+development+is+dependent+on+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cell development is dependent on blood flow.</a> Cell. 137 (4), 736-748 (2009).</li>
<li>Lundin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((YAP+regulates+hematopoietic+stem+cell+formation+in+response+to+the+biomechanical+forces+of+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">YAP regulates hematopoietic stem cell formation in response to the biomechanical forces of blood flow.</a> Developmental Cell. 52 (4), 446.e5-460.e5 (2020).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mimicry+of+embryonic+circulation+enhances+the+hoxa+hemogenic+niche+and+human+blood+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Mimicry of embryonic circulation enhances the hoxa hemogenic niche and human blood development.</a> Cell Reports. 40 (11), 111339(2022).</li>
<li>Azzoni, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+onset+of+circulation+triggers+a+metabolic+switch+required+for+endothelial+to+hematopoietic+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">The onset of circulation triggers a metabolic switch required for endothelial to hematopoietic transition.</a> Cell Reports. 37 (11), 110103(2021).</li>
<li>Li, Y. S. J., Haga, J. H., Chien, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+the+effects+of+shear+stress+on+vascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of the effects of shear stress on vascular endothelial cells.</a> Journal of Biomechanics. 38 (10), 1949-1971 (2005).</li>
<li>Batsivari, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+hematopoietic+stem+cell+development+through+functional+correlation+of+their+proliferative+status+with+the+intra-aortic+cluster+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Understanding hematopoietic stem cell development through functional correlation of their proliferative status with the intra-aortic cluster architecture.</a> Stem Cell Reports. 8 (6), 1549-1562 (2017).</li>
<li>Canu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+endothelial-to-haematopoietic+transition+at+the+single+cell+level+identifies+cell+cycle+regulation+as+a+driver+of+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of endothelial-to-haematopoietic transition at the single cell level identifies cell cycle regulation as a driver of differentiation.</a> Genome Biology. 21 (1), 157(2020).</li>
<li>Luo, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arterialization+requires+the+timely+suppression+of+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Arterialization requires the timely suppression of cell growth.</a> Nature. 589 (7842), 437-441 (2020).</li>
<li>Yang, C. -T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+KLF1+enhances+the+differentiation+and+maturation+of+red+blood+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Activation of KLF1 enhances the differentiation and maturation of red blood cells from human pluripotent stem cells.</a> Stem Cells. 35 (4), 886-897 (2017).</li>
<li>Lopez-Yrigoyen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+iPSC+line+capable+of+differentiating+into+functional+macrophages+expressing+ZsGreen%3A+A+tool+for+the+study+and+in+vivo+tracking+of+therapeutic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">A human iPSC line capable of differentiating into functional macrophages expressing ZsGreen: A tool for the study and in vivo tracking of therapeutic cells.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1750), 20170219(2018).</li>
<li>Lopez-Yrigoyen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+characterization+of+human+macrophages+from+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Production and characterization of human macrophages from pluripotent stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments. 2020 (158), (2020).</li>
<li>Fidanza, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+analyses+and+machine+learning+define+hematopoietic+progenitor+and+HSC-like+cells+derived+from+human+PSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Single cell analyses and machine learning define hematopoietic progenitor and HSC-like cells derived from human PSCs.</a> Blood. 136 (25), 2893-2904 (2020).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li>
<li>North, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cell+development+is+dependent+on+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cell development is dependent on blood flow.</a> Cell. 137 (4), 736-748 (2009).</li>
<li>Nguyen, J., Lin, Y. Y., Gerecht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+next+generation+of+endothelial+differentiation%3A+Tissue-specific+ECs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">The next generation of endothelial differentiation: Tissue-specific ECs.</a> Cell Stem Cell. 28 (7), 1188-1204 (2021).</li>
<li>Petazzi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arterial+cells+support+the+development+of+human+hematopoietic+progenitors+in+vitro+via+secretion+of+IGFBP2%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Arterial cells support the development of human hematopoietic progenitors in vitro via secretion of IGFBP2.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
<li>Crosse, E. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-layered+spatial+transcriptomics+identify+secretory+factors+promoting+human+hematopoietic+stem+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Multi-layered spatial transcriptomics identify secretory factors promoting human hematopoietic stem cell development.</a> Cell Stem Cell. 27 (5), 822(2020).</li>
<li>Calvanese, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+human+haematopoietic+stem+cells+from+haemogenic+endothelium+to+birth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mapping human haematopoietic stem cells from haemogenic endothelium to birth.</a> Nature. 604 (7906), 534-540 (2022).</li>
<li>Zeng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracing+the+first+hematopoietic+stem+cell+generation+in+human+embryo+by+single-cell+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Tracing the first hematopoietic stem cell generation in human embryo by single-cell RNA sequencing.</a> Cell Research. 29 (11), 881-894 (2019).</li>
<li>Hwa, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+arterial-venous+fusions+and+fate+specification+in+mouse+embryos+lacking+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Abnormal arterial-venous fusions and fate specification in mouse embryos lacking blood flow.</a> Scientific Reports. 7 (1), 11965(2017).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

הפרוטוקול שאנו מתארים כאן מאפשר יצירה של תאי אנדותל רגישים למכנו מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים וחקר תגובתם לגירוי מכני המתווך על ידי לחץ גזירה מבוקר. פרוטוקול זה מבוסס כולו על ציטוקינים ותואם באופן מלא לריאגנטים GMP לתרגום פוטנציאלי לייצור תאים לטיפול תאי.
הנגזרת של hiPSCs מספקת למדענים מודל אינסטרומנטלי לשלבים המוקדמים של התפתחות עוברית, המאפשר לחקור תהליכים שאחרת קשה לחקור in vivo24. למעשה, רקמות עובריות אנושיות הזמינות למחקר נאספות מעוברים חסרי מחזור דם, ועשויה להיות לכך השפעה משמעותית על החתימה המולקולרית הנשלטת על ידי רמזים מכניים. הגישה המתוארת כאן מאפשרת הדמיה חיה ומחקר בזמן אמת של תגובת התא ללחץ גזירה. השילוב של hiPSCs עם פלואידיקה מספק מודל של מחקר המתגבר על הזמינות המוגבלת וחוסר הנגישות של רקמות העובר המתפתחות כאשר התחלת מחזור הדם מחדש ושולטת על הקמת מערכת הלב וכלי הדם 3,9,10,25.
מגבלה של הפרוטוקול היא שתאי האנדותל הנגזרים מפרוטוקול זה עשויים שלא לשקף את הזהויות השונות של תאי אנדותל שונים הקיימים ברקמות המתפתחות. כדי להתגבר על מגבלה זו, ייתכן שיהיה צורך בשילוב ספציפי של ציטוקינים במהלך תהליך ההתמיינות שקדם לגירוי הנוזלי כדי להשיג את הזהות הרצויה או פנוטיפ ספציפי לרקמה26. ניתן לקבל בידוד של תת-קבוצות אנדותל באמצעות אימונופנוטיפ מעודן יותר במהלך שלב הבידוד. פרוטוקול זה מבודד תאי אנדותל רק על סמך ביטוי CD34, ובכך מאפשר בידוד עמודות במקום מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FACS); זה מפחית מוות תאי ואת הסיכון של זיהום. יתר על כן, פרוטוקול זה תוכנן במיוחד כדי לחקור את התפקיד של מתח גזירה מתווך על ידי זרימה למינרית. יהיה צורך להשתמש בגישות פלואידיות חלופיות כדי לחקור את ההשפעה של רמזים מכניים אחרים, כגון מתיחה או דחיסה, או סוגים אחרים של זרימה כגון זרימה מופרעת או מופרעת.
הראינו בעבר כי תאי אנדותל שמקורם ב-iPSC מחקים את הזהויות התאיות העורקיות ההטרוגניות27 בדומה לזה שנצפה באבי העורקים הגבי העוברי28,29,30. יש לכך חשיבות מיוחדת בהקשר של התפתחות כלי הדם והאפיון התאי, הידוע כנשלט על ידי מחזור הדם. מחקרים במודלים שונים הראו כי חוסר זרימת דם גורם לשינוי מפרט עורקי11,14,31. המנגנונים המחברים רמזים מכניים עם מפרט התא עדיין אינם ידועים, והצנרת המתוארת כאן מאפשרת מחקרים פונקציונליים מעודנים שלא ניתן היה לבדוק in vivo.
צינור זה מתאר את הייצור והגירוי של תאי אנדותל שמקורם בתאי גזע גזעיים גבוהים באמצעות תעלות פלואידיות זמינות מסחרית, תוך הימנעות מהצורך ביציקת המכשירים כמו בהתקני פולידימתילסילוקסאן (PDMS) הנמצאים בשימוש נרחב12. יתר על כן, השימוש בשבבי PDMS הופך את איסוף התאים המגורה למאתגר במיוחד, בעוד שעם פרוטוקול זה, ניתן לשלוף את התאים בקלות מהערוץ. זה משפר באופן משמעותי את הכוח האנליטי המאפשר ניתוח עוקב כגון ניתוחים פרוטאומיים ו transcriptomic, ציטומטריה זרימה, ובדיקות פונקציונליות, אשר עשוי להזדקק תרבית נוספת או בדיקות in vivo .

במהלך ההתפתחות העוברית, הלב הוא האיבר הראשון שביסס פונקציונליות1, עם התכווצויות ניתנות לזיהוי מהשלב המוקדם ביותר של היווצרות צינור הלב2. זרימת הדם, יחד עם הרמזים המכניים המתווכים על ידי זרימת הדם בתוך כלי השיט, שולטת בהיבטים מכריעים רבים של התפתחות מוקדמת. לפני הקמת מחזור הדם העוברי, כלי הדם מאורגנים במקלעת נימים ראשונית; עם תפקוד הלב, מקלעת זו מתארגנת מחדש לכלי דם ורידיים ועורקיים3. תפקידם של רמזים מכניים באפיון העורקים משתקף על ידי ביטוי פאן-אנדותל של סמנים עורקיים וורידיים לפני תחילת זרימת הדם4.
כוחות המודינמיים לא רק שולטים על התפתחות כלי הדם עצמם, אלא גם ממלאים תפקיד בסיסי בשליטה על היווצרות תאי הדם. תאי גזע ותאי אב המטופויטיים (HSPCs) יוצאים מתאי אנדותל מיוחדים הנקראים אנדותל המוגן 5,6,7,8, הנמצאים באזורים אנטומיים שונים של העוברים אך ורק בשלב המוקדם של ההתפתחות. מודלים של מחסור בלב, יחד עם מודלים במבחנה, הוכיחו כי רמזים מכניים מורים ומגבירים את ייצור HSPC מהאנדותל ההמוגן 9,10,11,12,13,14.
סוגים שונים של דינמיקת זרימה הוכחו כשולטים באופן דיפרנציאלי במחזור התא15, הידוע כחשוב הן באנדותל המוגן 16,17 והן במפרט תאי עורקים18. בסך הכל, רמזים מכניים הם גורמים קריטיים לזהות התא ולתפקודו במהלך ההתפתחות. התקנים פלואידים חדשניים במבחנה מאפשרים לנו להתגבר על המגבלות הכרוכות בחקר מכנוביולוגיה התפתחותית במהלך התפתחות הדם האנושי in vivo.
המטרה הכוללת של הפרוטוקול בכתב יד זה היא לתאר, שלב אחר שלב, את צינור הניסוי לחקר ההשפעה של לחץ גזירה על תאי אנדותל אנושיים שמקורם במבחנה מתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (hiPSCs). פרוטוקול זה מכיל הוראות מפורטות על התמיינות של hiPSCs לתאי אנדותל וזריעתם לאחר מכן לתוך שבבים נוזליים עבור פרוטוקול הגירוי. באמצעות שימוש זה, תאי אנדותל שונים במבחנה יכולים להיבדק על יכולתם לחוש את לחץ הגזירה על ידי ניתוח האוריינטציה שלהם בתגובה לזרימה. זה יאפשר למעבדות אחרות לענות על שאלות לגבי התגובה ללחץ גזירה וההשלכות התפקודיות שלה על זהויות שונות של תאי אנדותל.

<table><tbody><tr><td>0.6 Luer שקופית לא מצופה</td><td>ibidi</td><td>IB-80186</td><td></td></tr><tr><td>25% BSA</td><td>Life Technologies</td><td>A10008-01</td><td></td></tr><tr><td>צלחות 6 בארות</td><td>Greiner Bio-one</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Life Technologies</td><td>A1110501</td><td>צוטט כמגיב דיסוציאציה</td></tr><tr><td>חומצה אסקורבית</td><td>Merck</td><td>A4544-100G</td><td></td></tr><tr><td>פיפטת שאיפה</td><td>Sardtedt</td><td>86.1252.011</td><td></td></tr><tr><td>תוסף B27</td><td>Life Technologies</td><td>17504044</td><td>מצוטט כתוסף תרבית תאים עצביים (50x)</td></tr><tr><td>BD FACS DIVA</td><td>BD Biosciences</td><td>גרסה 8.0.1</td><td>מצוטט כתוכנת ציטומטריית זרימה</td></tr><tr><td>BD LSR Fortessa 5 לייזר</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Life Technologies</td><td>PHG0021</td><td></td></tr><tr><td>CD34 ערכת מיקרו-חרוזים</td><td>Miltenyil Biotec</td><td>30-046-702</td><td></td></tr><tr><td>CD34 PE שיבוט 4H11</td><td>Invitrogen</td><td>12-0349-42</td><td></td></tr><tr><td>CD34 PerCP-eFluor 710 שיבוט 4H11</td><td>Invitrogen</td><td>44-0349-42</td><td></td></tr><tr><td>משטח דוחה תאים של Cellstar 6 בארות לוחות</td><td>Greiner Bio-one</td><td>657970</td><td>מצוטט כצלחת דוחה תאים</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Cayman Chemicals&nbsp;</td><td>13122-1mg-CAY</td><td></td></tr><tr><td>Cryostor CS10&nbsp; שימור הקפאה של תאים</td><td>Merck</td><td>C2874-100ML</td><td>צוטט כתמיסת שימור בהקפאה</td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד</td><td>VWR</td><td>200-664-3</td><td>צוטט כ-DMSO</td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Life Technologies</td><td>10565-018</td><td></td></tr><tr><td>DPB Ca2+ Mg2+</td><td>Life Technologies</td><td>14080055</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14200075</td><td></td></tr><tr><td>מסננת EASY 40 &mu; m</td><td>Greiner Bio-one</td><td>542040</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Life טכנולוגיות</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>מגיב חוסם FcR</td><td>Miltenyil Biotec</td><td>130-059-901</td><td></td></tr><tr><td>פיג'י</td><td></td><td>גרסה 1.53c</td><td></td></tr><tr><td>Flow Jo</td><td></td><td>גרסה 10.7.1</td><td>מצוטט כניתוח ציטומטריית זרימה של</td></tr><tr><td>FLT3L</td><td>Peprotech</td><td>300-19-10uG</td><td></td></tr><tr><td>יחידה נוזלית</td><td>ibidi</td><td>10903</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Life Technologies</td><td>35050038</td><td>צוטט כתוסף L-גלוטמין</td></tr><tr><td>Ham F-12&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11765054</td><td></td></tr><tr><td>Holo-transferrin</td><td>Merk</td><td>T0665-500MG</td><td></td></tr><tr><td>סרום אנושי אלבומין</td><td>Fujifilm UK Ltd</td><td>9988</td><td></td></tr><tr><td>Ibidi Pump System</td><td>ibidi</td><td>10902</td><td>מצוטט כמערכת משאבה</td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Life Technologies</td><td>12440053</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ הפוך</td><td>ioLight/Thisle Scientific</td><td>IOL-IO-INVERT</td><td>מצוטט כמיקרוסקופ אינקובטור הפוך</td></tr><tr><td>ליופיליזציה BSA&nbsp;</td><td>מפריד Merck</td><td>A2153-100G</td><td></td></tr><tr><td>MiniMACS</td><td>Miltenyil Biotec</td><td>130-042-102</td><td>מצוטט כמפריד מגנטי</td></tr><tr><td>עמודות MS</td><td>Miltenyil Biotec</td><td>130-042-201</td><td>מצוטט כעמודה מגנטית</td></tr><tr><td>MTG</td><td>Merck</td><td>M6145-25ML</td><td></td></tr><tr><td>N2 תוספת</td><td>Life Technologies</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>מחברת למערכת משאבה</td><td>ibidi</td><td>10908</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde 37-41%</td> <td>Fisher Chemicals</td><td>F/1501/PB15</td><td></td></tr><tr><td>Pastette</td><td>Greiner Bio-one</td><td>612398</td><td></td></tr><tr><td>עט/סטרפטוקוק</td><td>Gibco</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>סט זלוף צהוב/ירוק: 50 ס"מ, מזהה 1.6 מ"מ, מאגרים של 10 מ"ל</td><td>Ibidi</td><td>IB-10964</td><td>מצוטט כסט זלוף</td></tr><tr><td>פוליסטירן צינורות תחתונים עגולים</td><td>פלקון</td><td>352008</td><td>מצוטט כצינורות ציטומטריית זרימה</td></tr><tr><td>פריזמה 9</td><td></td><td>Verison 9.4.0</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת בקרת משאבה</td><td>ibidi</td><td>גרסה 1.6.1</td><td>מצוטט כתוכנת משאבה</td></tr><tr><td>ReLeSR</td><td>טכנולוגיות תאי גזע</td><td>5872</td><td>מצוטט כפתרון ניתוק</td></tr><tr><td>rhBMP4</td><td>R& D</td><td>314-BP-010</td><td></td></tr><tr><td>rhEPO</td><td>R& D</td><td>287-TC-500</td><td></td></tr><tr><td>rhIGF1</td><td>Peprotech</td><td>100-11-100uG</td><td></td></tr><tr><td>rhIL11</td><td>Peprotech</td><td>200-11-10uG</td><td></td></tr><tr><td>rhIL3</td><td>Peprotech</td><td>200-03-10uG</td><td></td></tr><tr><td>rhIL6</td><td>R& D</td><td>206-IL-010</td><td></td></tr><tr><td>rhLaminin-521</td><td>Life technologies</td><td>A29248</td><td>מצוטט כ-Laminin</td></tr><tr><td>rhSCF</td><td>Life Technologies</td><td>PHC2111</td><td></td></tr><tr><td>rhTPO</td><td>R& D</td><td>288-TPN-025</td><td></td></tr><tr><td>rhVEGF</td><td>R& D</td><td>293-VE-010</td><td></td></tr><tr><td>RLT מאגר ליזה</td><td>Qiagen</td><td>79216</td><td></td></tr><tr><td>מחבר טורי עבור &micro;-שקופיות: סטרילי, סטרילי</td><td></td><td>ibidi IB-10830</td><td></td></tr><tr><td>StemPro-CD34 SFM מדיה</td><td>Life Technologies</td><td>10639011</td><td>צוטט כמדיה נטולת סרום עבור תאי CD34+ (SFM-34)</td></tr><tr><td>תוסף תזונה StemPro-CD34&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>10641-025</td><td>מצוטט כ-34 תוספי תזונה</td></tr><tr><td>StemPro hESC SFM</td><td>Life Technologies</td><td>A1000701</td><td>מצוטט כמדיה תרבותית&nbsp;</td></tr><tr><td>תוסף StemPro</td><td>Life Technologies</td><td>A10006-01</td><td></td></tr><tr><td>Vitronectin (VTN-N) חלבון אנושי רקומביננטי</td>, <td>Invitrogen</td><td>A31804</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 דיהידרוכלוריד</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td>מצוטט כ-iRock</td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td></td></tr></tbody></table>

במבחנה מודל של כלי דם אנושיים עובריים על שבב לחקר מכנוביולוגיה התפתחותית

In Vitro Model of Fetal Human Vessel On-chip to Study Developmental Mechanobiology

הלב הוא האיבר הראשון שהוקם תפקודית במהלך ההתפתחות, ובכך מתחיל את זרימת הדם בשלב מוקדם מאוד בהריון. מלבד הובלת חמצן וחומרים מזינים כדי להבטיח את גדילת העובר, זרימת הדם העוברית שולטת באירועים התפתחותיים חיוניים רבים המתרחשים בתוך שכבת האנדותל באמצעות רמזים מכניים. אותות ביומכניים גורמים לשינויים מבניים בכלי הדם, קובעים מפרט עורקי ושולטים בהתפתחות תאי גזע המטופויטיים. חוסר הנגישות של הרקמות המתפתחות מגביל את הבנת תפקיד המחזור בהתפתחות האנושית המוקדמת; לכן, מודלים במבחנה הם כלים מרכזיים לחקר מכנוביולוגיה של כלי שיט. מאמר זה מתאר פרוטוקול להבדיל תאי אנדותל מתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם וזריעתם לאחר מכן לתוך מכשיר נוזלי כדי לחקור את תגובתם לרמזים מכניים. גישה זו מאפשרת תרבית ארוכת טווח של תאי אנדותל תחת גירוי מכני ולאחר מכן שליפה של תאי האנדותל לצורך אפיון פנוטיפי ופונקציונלי. מודל ה- in vitro שהוקם כאן יהיה חיוני להבהרת המנגנונים המולקולריים התוך-תאיים המתמרים את האיתות בתיווך רמזים מכניים, אשר בסופו של דבר מתזמרים את התפתחות כלי הדם במהלך חיי העובר האנושי.

אנו מתארים כאן פרוטוקול להתמיינות ולגירוי מכנו של תאי אנדותל שמקורם בתאי גזע גזעיים גבוהים המאפשר לחקור את התגובה שלהם לרמזים מכניים (איור 1). פרוטוקול זה גורם לייצור תאי אנדותל בעלי רגישות תפקודית. אנו מספקים כאן תוצאות מייצגות ומתארים את הפנוטיפ הצפוי כדי להעריך כיצד התאים מגיבים לגירוי הציטוקינים במהלך ההתמיינות.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65492/65492fig01v2.jpg"> איור 1: סכמה של פרוטוקול התמיינות וגירוי מכני. סכמה של פרוטוקול התמיינות המראה את העיתוי של תערובות שונות של ציטוקינים, בידוד תאים CD34+ , זריעת שבב נוזלי, וניתוח סופי של תאים מעוררים מכנית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/65492fig01largev2.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
תרבות של hiPSCs חשוב להתחיל את הפרוטוקול מ-hiPSCs שגדלים נכון בתנאי התחדשות עצמית. אינדיקציה טובה לאיכות התרבות היא מהירות צמיחתם. לאחר ההפשרה, התאים עשויים להזדקק 2-3 שבועות כדי להגיע לשלב הנכון של הצמיחה שיבטיח התמיינות טובה. כאשר ניתן להעביר את התאים פעמיים בשבוע ביחס של 1:6 ולהגיע למפגש כמעט מלא, זה הזמן שבו הם מוכנים להתמיין באותו יום שבו הם צריכים לעבור.
התמיינות של hiPSCs לתאי אנדותל השלב הראשון של ההתמיינות, המורכב מהיווצרות גופים עובריים (EBs), תלוי בקו התא ועשוי להזדקק לאופטימיזציה מסוימת עבור קו התאים הספציפי שבשימוש. הדיסוציאציה המתוארת בשלבי פרוטוקול 1.3.2.2-1.3.2.4 ניתנת לשינוי על ידי צמצום או הרחבה של הדגירה עם מגיב הדיסוציאציה והדיסוציאציה שלאחר מכן עם פיפטת פסטר. יתר על כן, ריאגנטים דיסוציאציה אחרים יכולים לשמש לשלב זה בנוסף לדיסוציאציה פיזית של המושבות עם כלי חיתוך או קצה פיפטה P100. EBs באיכות טובה מראים קצה מוגדר ביום השני של ההתמיינות ונראים ברורים ובהירים כאשר הם נצפים באמצעות מיקרוסקופ; אזורים כהים יותר עשויים להצביע על מוות תאי בתוך EBs (איור 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65492/65492fig2v3.jpg"> איור 2: מורפולוגיה של גופים עובריים. (A) גופים עובריים ביום 2 המראים קצוות חיצוניים מוגדרים היטב וגודל עקבי. (B) יום 2 גופים עובריים באיכות ירודה המראים מוות תאי נרחב המוביל לפירוק המבנה. סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/65492fig02large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
ביום השני, הוספת CHIR99021 ל-EBs מעכבת את החלבון GSK-3 וכתוצאה מכך מופעלת מסלול Wnt. לקווי תאים שונים יש תגובות שונות לטיפול ב-CHR, ויש לבדוק זאת על-ידי כימות מספר תאי CD34+ המתקבלים ביום 8 באמצעות ריכוזים שונים (איור 3).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65492/65492fig3v3.jpg"> איור 3: התמיינות תאי אנדותל עם טיפולי CHIR שונים. מחויבות תאי אנדותל כומתה על ידי ציטומטריית זרימה ביום 8 להתמיינות על ידי ביטוי קרום CD34, לאחר טיפול CHIR ביום 2 ב (A) 3 μM, (B) 5 μM, ו (C) 7 μM. נתוני ציטומטריית זרימה התקבלו באמצעות ציטומטרים של חמישה לייזרים ותוכנה ייעודית (ראה טבלת חומרים). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/65492fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
בידוד תאים CD34+ חשוב לוודא כי העשרת CD34+ באמצעות החרוזים המגנטיים מספקת לפחות 80% CD34+ לאחר ביטול העמודה. כדי להבטיח טוהר מספיק, ניתן לנתח אליציטוט של תאים המתקבלים מהבידוד המגנטי על ידי ציטומטריית זרימה תוך הקפדה על שימוש בשיבוט נוגדנים שונה מזה המשמש להעשרה המגנטית. כאן, נעשה שימוש בשיבוט 4H11 ו~85% טוהר הושג לאחר העשרה (איור 4).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65492/65492fig4v3.jpg"> איור 4: ביטוי ממברנה של CD34 לפני ואחרי העשרה באמצעות מיון מגנטי. יום 8 גופים עובריים מנותקים (אפור) ותאים לאחר העשרה מגנטית (ירוק) הוכתמו לביטוי CD34 ונותחו על ידי ציטומטריית זרימה, מה שהדגים מיון מוצלח לאחר העשרה. נתוני ציטומטריית זרימה התקבלו באמצעות ציטומטרים של חמישה לייזרים ותוכנה ייעודית (ראה טבלת חומרים). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/65492fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
זריעת תאים לתעלה הנוזלית בעת זריעת התאים בתעלה הפלואידית, חיוני לעקוב אחר ההידבקות וההתרבות של תאי האנדותל. לאחר הזריעה, לוקח לתאים ~5 שעות להיצמד באופן מלא לתעלה (איור 5A). ניתן לבדוק גם פתרון ציפוי חלופי לשיפור ההדבקה בשלב זה. כדי לוודא שהתאים שנבדקו רגישים למכנו ולכן מסוגלים להגיב לגירוי מכני, ניתן לבדוק את כיוון התא לאורך זמן. תאים לפני הגירוי מראים אוריינטציה אקראית (איור 5A ואיור 5C) והם מכוונים מחדש במקביל לכיוון הזרימה (איור 5B,C). הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר לאסוף את התאים מהתעלה כדי לבצע אנליזה במורד הזרם, לדוגמה, ציטומטריית זרימה, לחקר האימונופנוטיפ של הממברנה שלהם, ומספק את הזהות האנדותלית של התאים המגוריים (איור 5D,E).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65492/65492fig5v3.jpg"> איור 5: Mechanoresponsiveness של תאי אנדותל שמקורם ב-hiPSCs . (A) שכבה משולבת של תאי CD34+ מבודדים 48 שעות לאחר הזריעה. (B) שכבה מכוונת מחדש של תאי אנדותל 3 ימים תחת תרבית דינמית. (C) ניתוח אוריינטציה של תאי אנדותל לאחר 5 ימים של תרבית דינמית. (D) פרופיל ביטוי CD34 של תאים בתרבית תחת זרימה במשך 5 ימים. (E) אחוז תאי CD34+ של אוכלוסיית תאים שנלקחו מהתעלה הנוזלית. התמונות צולמו באמצעות מיקרוסקופ אינקובטור הפוך; נתוני ציטומטריית זרימה התקבלו באמצעות ציטומטרים של חמישה לייזרים ותוכנה ייעודית (ראה טבלת חומרים). פסי קנה מידה = 100 מיקרומטר (A,B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/65492fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>ריאגנטים</td>
			<td>ריכוז מלאי</td>
			<td>נפח נוסף</td>
			<td>ריכוז סופי</td>
		</tr><tr><td>המדיום של Dulbecco של Iscove (IMDM)</td>
			<td>-</td>
			<td>333 מ"ל</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>תערובת F-12 של Ham's Nutrient (F-12)</td>
			<td>-</td>
			<td>167 מ"ל</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>תוסף N-2 (100x)</td>
			<td>פי 100</td>
			<td>5 מ"ל</td>
			<td>1x</td>
		</tr><tr><td>תוסף B-27 (50x)</td>
			<td>פי 50</td>
			<td>10 מ"ל</td>
			<td>1x</td>
		</tr><tr><td>חומצה אסקורבית</td>
			<td>10 מ"ג/מ"ל</td>
			<td>1.25 מ"ל</td>
			<td>25 מיקרוגרם/מ"ל</td>
		</tr><tr><td>α-מונותיוגליצרול (MTG)</td>
			<td>11.5 מ'</td>
			<td>19.5 מיקרוליטר</td>
			<td>448.5 מיקרומטר</td>
		</tr><tr><td>אלבומין בסרום אנושי</td>
			<td>100 מ"ג/מ"ל</td>
			<td>2.5 מ"ל</td>
			<td>0.5 מ"ג/מ"ל</td>
		</tr><tr><td>הולו-טרנספרין</td>
			<td>100 מ"ג/מ"ל</td>
			<td>0.75 מ"ל</td>
			<td>150 מיקרוגרם/מ"ל</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 1: הרכב ומתכון עבור 500 מ"ל של מדיום בידול ללא סרום (SFD).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>ימים של בידול</td>
			<td>תערובת ציטוקינים</td>
			<td>ציטוקין</td>
			<td>ריכוז סופי</td>
		</tr><tr><td>יום 0 - 2</td>
			<td>ערבוב 1</td>
			<td>BMP4</td>
			<td>20 נ"ג/מ"ל</td>
		</tr><tr><td>יום 2</td>
			<td>מיקס 2</td>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>7 מיקרומטר</td>
		</tr><tr><td>מהיום השלישי ואילך</td>
			<td rowspan="2">מערבבים 3 ו-4</td>
			<td>VEGF</td>
			<td>15 נ"ג/מ"ל</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>bFGF</td>
			<td>5 נ"ג/מ"ל</td>
		</tr><tr><td>מהיום השישי ואילך</td>
			<td rowspan="8">ערבוב 4</td>
			<td>IL6</td>
			<td>10 נ"ג/מ"ל</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>FLT3L</td>
			<td>10 נ"ג/מ"ל</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>IGF1</td>
			<td>25 נ"ג/מ"ל</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>IL11</td>
			<td>5 נ"ג/מ"ל</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>SCF</td>
			<td>50 נ"ג/מ"ל</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>EPO</td>
			<td>3 U/מ"ל</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>TPO</td>
			<td>30 נ"ג/מ"ל</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>IL3</td>
			<td>30 נ"ג/מ"ל</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 2: תערובות של ציטוקינים המשמשים להתמיינות תאי אנדותל, ימים שבהם הם מתווספים למדיום SFD וריכוז סופי.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>לחץ גזירה (dyn/cm2)</td>
			<td>זמן (ח)</td>
		</tr><tr><td>0.5</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>1.5</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>2</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>2.5</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>3</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>3.5</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>4</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>4.5</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>5</td>
			<td>עד סוף הניסוי</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 3: ערכי לחץ גזירה עבור התרבות הדינמית ואורך היישום שלהם.
איור משלים S1: גיאומטריה ומידות השבב והצנרת המשמשים לפרוטוקול זה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/SF1.pdf" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
איור משלים S2: מדריך שלב אחר שלב עבור התוכנה השולטת במשאבת האוויר עם תיאור של כל שלב. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/65492_Supp%20Figure%20S2%20FINAL.pdf" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
איור משלים S3: מדריך לניתוח כיוון באמצעות FIJI המציג את ציור צורת התא, התאמה אליפטית ומדידה סופית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/65492_SF3.pdf" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
טבלה משלימה S1: גודל יחידה, נפח תרחיף וריכוזי מלאי עבור ציטוקינים המשמשים בפרוטוקול התמיינות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/Ventura%20et%20al,%202023%20-%20Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>

מתואר כאן תהליך עבודה פשוט להבדיל בין תאי אנדותל לתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים ואחריו פרוטוקול מפורט לגירוי המכני שלהם. זה מאפשר לחקור את המכנוביולוגיה ההתפתחותית של תאי אנדותל. גישה זו תואמת לבדיקות במורד הזרם של תאים חיים שנאספו משבב התרבית לאחר גירוי מכני.

The heart is the first organ to be functionally established during development, thus initiating blood circulation very early in gestation. Besides ...

המחקר שלנו בוחן כיצד רמזים מכניים מנחים את גורלם של תאי אנדותל במהלך ההתפתחות, ולשם כך אנו משלבים התמיינות תאי גזע פלוריפוטנטית הנגרמת על ידי אדם עם גירוי מכני בתיווך פלואיד. תאי אנדותל חשופים כל הזמן לתנועת הדם, ולכן אותות חשובים מתפספסים בתרבית סטטית, מה שהופך את זה לאתגר העיקרי בחקר ביולוגיה של תאי אנדותל באמצעות מערכות תרבית מסורתיות. רמזים מכניים, למעשה, מפעילים מסלולי איתות חיוניים רבים שניתן להתעלם מהם בתאים שגודלו בתרבית בתנאים סטטיים.הפרוטוקול שלנו מספק מדריך קל, שלב אחר שלב, כיצד להבדיל ולעורר באופן מכני תאי אנדותל פלוריפוטנטיים המושרים שמקורם בתאי גזע. זה יעזור למעבדות רבות לאמץ תרבית תרמית כדי לענות בקלות על שאלות על התנהגות תאי אנדותל בזמן זרימה.

in-vitro-model-fetal-human-vessel-on-chip-to-study-developmental

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

כאן אנו מתארים מתודולוגיה להעביר חוט האדם הנגזרות דם אנדותל מושבת תאים יוצרי (ECFCs) ו מח עצם שמקורם בתאי גזע mesenchymal (MSCs), מוטבע ג'ל קולגן / פיברונקטין, תת עורי לעכברים immunodeficient. שילוב זה תא / ג'ל יוצרת רשת כלי דם האדם מתחבר עם vasculature העכבר.

האדם Bioengineering רשתות כלי הדם של עכברים Immunodeficient

פלטפורמת microchannels-on-a-chip פותחה על ידי שילוב של טכניקת photolithographic reflowable photoresist, ליטוגרפיה הרכה, ומיקרופלואידיקה. פלטפורמת microchannels endothelialized מחקה את הגיאומטריה (3D) תלת ממדית של in vivo microvessels, פועלת תחת זרימת זלוף רציפה מבוקרת, מאפשרת הדמיה באיכות גבוהה ובזמן אמת, ויכולה להיות מיושמת למחקר כלי הדם.

הליך הפיתוח של Multi-עגול עומק חתך Endothelialized microchannels-on-a-chip

תאי אנדותל וריד טבורי אנושיים ראשוניים (HUVECs) גודלו למפגש בתוך מכשיר רשת מיקרופלואידי. צומת תאי האנדותל והתפלגות ה-F-actin הודגמו והשינויים בריכוז הסידן התוך-תאי וייצור תחמוצת החנקן בתגובה לאדנוזין טריפוספט (ATP) כומתו בזמן אמת ברמות תאים בודדים.

פיתוח ואפיון של<em&gt; במבחנה</em&gt; כלי דם קטן רשת מדידות כמותיות של האנדותל [Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt;]<sub&gt; i</sub&gt; וייצור Nitric Oxide

פרוטוקולים ללמוד העורקים מאתר של הלידה באמצעות ויוו ניתוח המשובטים, מיפוי הגורל, אבי העורקים explants שריר חלק מבודד התאים מפורטים כאן. גישות מגוונות אלה לקדם את חקירת מורפוגנזה של אבי העורקים של הלידה בהתפתחות נורמלית, בפתוגנזה של המחלה.

באמצעות In Vivo , רקמות, תאים Explant גישות ללמוד מורפוגנזה ו פתוגנזה של הלידה של אבי העורקים

הושלתי האנדותל שנגזר מתאי גזע המושרה ביותר (iPSC-EPs) יש את הפוטנציאל לחולל מהפכה לטיפולי מחלות לב וכלי דם ולאפשר יצירת מודלים נאמנים יותר של מחלות לב וכלי דם. בזאת, כימוס של iPSC-EPs בתלת מימדי (3D) קולגן מיקרוסביבה וניתוח כמותי של הפוטנציאל הגלום בתאים אלה מתוארים.

מודל תלת מימד וצינור חישוב מתורבת לכמת את הפוטנציאל הוושלתי של iPSC-נגזר של התגובה האנטי-מגנטית

כאן, אנו מספקים שבב microfluidic ומערכת מיקרופלואידית במחזור מבוקרת ויעילה מאוד באופן אוטומטי, כי מסכם את microenvironment הראשונית של neovascularization, המאפשר לתאי אנדותל (ECs) להיות מגורה על ידי מתח גזירה זוהר גבוה, רמה פיזיולוגית של זרימה transendothelial, גורם צמיחה אנדותל כלי דם שונים (VEGF) הפצה בו זמנית.

מודל מיקרופלואידי לחקות אירוע ראשוני של ניאו-סקולריזציה

בדיקה זו משתמשת בתאי גזע עובריים של עכברים המתמיינים לגופי עובר בתרבית בג'ל קולגן תלת-ממדי כדי לנתח את התהליכים הביולוגיים השולטים באנגיוגנזה נובטת במבחנה. הטכניקה יכולה להיות מיושמת לבדיקת תרופות, מידול מחלות, ולחקר גנים ספציפיים בהקשר של מחיקות קטלניות עוברית.

במבחנה בדיקת הנבטה תלת מימדית של אנגיוגנזה באמצעות תאי גזע עובריים של עכבר לצורך מידול מחלות כלי דם ובדיקות סמים

כאן פיתחנו מודל של איבר על-שבב של תאי שריר חלקים באבי העורקים כדי לשכפל את הזן הביומכני in vivo של תאי שריר חלקים בדופן אבי העורקים האנושי.

בניית מודל של איבר-על-שבב של תא שריר חלק של אבי העורקים לשחזור זן ביומכני בדופן אבי העורקים

כאן אנו מציגים פרוטוקול לבניית מערכת איבר-על-שבב (OOC) שנועדה לחקות כריתת ריאות. מערכת זו חוקרת את המתאם הפוטנציאלי בין פגיעה בגליקוקליקס לסיבוכים לאחר כריתת ריאות.

מידול הגליקוקליקס האנדותל לאחר כריתת ריאות בשבב נוזלי תלת מימדי - גישה לייצור מערכת איבר-על-שבב מבוססת כלי דם

מאמר זה מתאר שיטה ליצירת פגיעה מכנית בכלי דם בעוברי דג זברה. מודל פציעה זה מספק פלטפורמה לחקר המוסטזיס, דלקת הקשורה לפציעה וריפוי פצעים באורגניזם המתאים באופן אידיאלי למיקרוסקופיה בזמן אמת.

פגיעה כלי מכאנית בעוברי דג הזברה

למדו הפרדת תאי אנדותל מגזעיות פלוריפוטנטיות אנושיות וגירוי מכני בסביבה מבוקרת. שיטה זו מאפשרת חקר מכנוביולוגיה של כלי דם עובריים בצורה מדויקת ושחזורית.

במבחנה מודל של כלי דם אנושיים עובריים על שבב לחקר מכנוביולוגיה התפתחותית

גלה סרטונים נוספים