Name: הדמיית סידן דו-פוטון של פעילות המוח הקדמי בדגי זברה בוגרים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-28T14:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: למדו הדמיית סידן דו-פוטון של פעילות המוח הקדמי בדגי זברה בוגרים. שיטה זו מאפשרת לחקור את השפעת המידע החושי על פעילות נוירונים בהקשרים התנהגותיים מורכבים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי המכון לביולוגיה מולקולרית, האקדמיה סיניקה והמועצה הלאומית למדע וטכנולוגיה, טייוואן. חנות המכונות במכון לפיזיקה, אקדמיה סיניקה סייעה לייצר חלקים שתוכננו בהתאמה אישית. אנו גם רוצים להודות לפ. ארגסט (מכון פרידריך מיישר למחקר ביו-רפואי, בזל, שוויץ) על תכנון מנגנון הנעילה המהירה של שלב הראש.

כל ההליכים בבעלי חיים אושרו ובוצעו בהתאם להנחיות הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של האקדמיה סיניקה. פירוט כלי המחקר ניתן למצוא בטבלת החומרים.
1. הכנת תא הקלטה
<ol><li>הכינו מכל חצי משושה, פלטת בסיס ובמת ראש (איור 1A; קבצים משלימים 1-3). שלב הראש מורכב משני עמודי מתכת המחוברים ללוח עגול. הצלחת העגולה מכילה חריצים שניתן לנעול על לוח הבסיס. לאחר שננעלו יחד, שלב הראש וצלחת הבסיס מונחים בתחתית המיכל המשושה למחצה.</li>
	<li>מניחים את המיכל המשושה למחצה על פלטפורמת הניסוי של המיקרוסקופ. הפלטפורמה אמורה להיות מסוגלת לנוע בכיווני X ו- Y מבלי לפגוע במגבלה של שלב התרגום.</li>
	<li>כוון את אור האינפרא-אדום (IR) ברזולוציית 810 ננומטר ואת המצלמה אל במת הראש לצורך הקלטה התנהגותית. ודא ששדה הראייה של המצלמה גדול מספיק כדי להתאים לדג זברה בוגר.<ol><li>כדי למנוע מהלייזר הדו-פוטוני ומהגירוי החזותי להפריע להקלטה התנהגותית, הגדירו מסנן מעבר קצר של 875 ננומטר ומסנן מעבר ארוך של 700 ננומטר מול המצלמה, בהתאמה.</li>
	</ol></li>
	<li>כדי להציג את הגירוי החזותי, חברו סרטי הקרנה אחוריים לצד הפנימי של שלושת הדפנות של המיכל המשושה-למחצה (איור 1A).</li>
	<li>כוון את שלושת המקרנים לשלושת המשטחים של המיכל. שלוש התמונות צריכות להיות מיושרות ליצירת סצנה חזותית רציפה. כדי למנוע מנורות המקרן לזהם את אות הפלואורסצנטיות של הסידן, מקם מסנן צפיפות נייטרלית ומסנן צבע אדום (600 ננומטר, מעבר ארוך) לפני כל מקרן, והצב מסנן פס (510/80 ננומטר) לפני שפופרת מכפיל האור (PMT).</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65526/65526fig1v8.jpg"> איור 1: מכשירים הדרושים לניתוחי ריסון ראש. (A) מנגנון הנעילה המהירה בין הלוח העגול של שלב הראש לבין לוחית הבסיס בתוך המיכל המשושה למחצה. קבצי תכנון בעזרת מחשב (CAD) של החלקים בהתאמה אישית ניתן למצוא בקבצים משלימים 1-4. (B) מוט ראש בצורת Ω לריסון הראש. (C) המיקרומניפולטור בעל שלושת הצירים המשמש למיקום מוט הראש לאתר החיבור. כניסה: כיוון מוט הראש בחימר. (D) תותח שיחזיק את הדג במהלך הניתוח. כניסה: התמצאות של דגים בתוך התותח. (E) מודול העמסת דגים והמיקרומניפולטור המשמש להעמסת הדג על במת הראש. כניסה: כיוון של דגים בתוך המודול. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65526/65526fig1v8large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
2. ניתוח ריסון ראש
<ol><li>הכינו מוט ראש בצורת Ω (איור 1B; קובץ משלים 4) לריסון ראש דג הזברה. כדי לעשות זאת, לחבר חתיכת חימר מודל מבוסס שמן מיקרומניפולטור שלושה צירים. ודא שהחימר מוצק מספיק כדי להחזיק את מוט הראש, אך רך מספיק כדי להתנתק ממוט הראש לאחר ריסון הראש.</li>
	<li>הכניסו זרוע של מוט הראש לתוך החימר וכוונו את מוט הראש אופקית (איור 1C). זה יבטיח שהחיבור המאוחר יותר של מוט הראש לדגי הזברה יהיה ישר. הערה: מוט הראש יכול להיות עשוי מטיטניום (24 מ"ג) או נירוסטה (43 מ"ג) וניתן לעשות בו שימוש חוזר למספר ניסויים. חומר מוט הראש אינו משפיע על התנהגותם של דגי זברה בוגרים (משקל נע בין 300-1,000 מ"ג) תחת משענת ראש.</li>
	<li>הכינו את התותח, צינור חלול להחזקת גוף הדג במקומו במהלך הניתוח (איור 1D).</li>
	<li>הכינו 0.03% ו-0.01% טריקאין מתאן-סולפונט (TMS; ראו טבלת חומרים) במי מכלי דגים. זה ישמש כדי להרדים ולשמור על הדג במצב טשטוש במהלך הניתוח.</li>
	<li>הכינו ארבעה מקלוני טישו כדי להסיר עודפי עור ומים מאתרי החיבור בגולגולת. כדי להכין כל מטוש, חותכים מגבת נייר לריבוע של 3 ס"מ ומקפלים לאורך האלכסון שלה כדי ליצור מבנה דמוי צינור. סובבו את קצות הצינור לנקודה עדינה. אתר ההתקשרות קטן מאוד, כך שנקודה עדינה מאפשרת שליטה עדינה יותר במטוש.</li>
	<li>הכינו מודול העמסת דגים עבור המיקרומניפולטור (איור 1E). הערה: המודול מורכב משני עמודי פלדה המוחזקים יחד על ידי מהדק עמוד ישר זווית. עמדה אחת מתחברת למיקרומניפולטור, ואילו העמדה השנייה מחזיקה מהדק עמוד מסתובב הנושא את הדג. המודול משמש למיקום הדג על במת הראש בשליטה עדינה. מהדק העמוד המסתובב משמש ככוונן גובה כדי לשנות את זווית המגרש של הדג.</li>
	<li>מרדימים את הדג עם 0.03% TMS במי מיכל דגים. במהלך השלבים הבאים, השתמש במזרק כדי להעביר 0.01% TMS במי מיכל דגים לפה בפולסים קצרים כל 90 שניות. זרימת המים מהזילוח אמורה לגרום לתנועת זימים. זה יאפשר לדגים לשרוד יותר מ -40 דקות במהלך הניתוח. הערה: Tg [neuroD:GCaMP6f] משמש בשל הביטוי הרחב של מחוון הסידן במוח הקדמי הן בשלב הזחל והן בשלב הבוגר10. הערה: לחלופין, השתמש בזילוח כוח הכבידה כדי לספק זרימת מים קבועה לפה בתקופות בניתוח שבהן שתי הידיים תפוסות.</li>
	<li>עטפו את הדג לתוך קפסולה (איור 2A) שמחזיקה את הדג בתוך התותח.<ol><li>עוטפים את הדג המורדם בפיסת נייר לחה החל מקצה הזנב ועד כ-1 מ"מ קאודלי עד הזמיר. ודאו שהעטיפה הדוקה כדי למנוע החלקה של הדג אל מחוץ לרקמה.</li>
		<li>עטפו צינור פלסטיק רך עם חריץ אורכי (למשל, צינור בינוני מתכווץ חום שנחתך) סביב רקמת הנייר כדי לכסות את הדג מקצה הזנב ועד כ-2 מ"מ קאודלי לזמיר. הצינורית מבטיחה שגוף הדג יישאר ישר לאורך כל הניתוח.</li>
		<li>עוטפים מגבת נייר סביב הצינור לקוטר דומה בערך לקוטר התותח.</li>
		<li>עוטפים צינור פלסטיק רך החתוך מנורה של פיפטת העברת פלסטיק סביב מגבת הנייר. זה מבטיח שניתן לטעון את הקפסולה בצורה חלקה לתוך התותח.</li>
		<li>מעמיסים את הדג לתוך התותח.</li>
	</ol></li>
	<li>השתמשו באזמל כדי להסיר את העור שמכסה את אתרי החיבור, שני אזורים משולשים של הגולגולת אל המוח הקטן ומעל הזימים (איור 2B), ואז הסירו את העור המכסה את האזור שבין אתרי החיבור. השתמש במקלוני רקמות כדי לייבש את אתרי החיבור ולנקות את העור שנותר.<ol><li>השתמש בפלטפורמה מתכווננת לתמיכה בראש במהלך הסרת העור, אך אסור שהפלטפורמה תבוא במגע עם העיניים כדי למנוע פגיעה בעיניים במהלך הניתוח. הערה: הסרה יסודית של העור באתרי החיבור חיונית להפחתת ארטיפקטים תנועתיים במהלך ההדמיה.</li>
	</ol></li>
	<li>יש למרוח טיפת דבק רקמות (ראו טבלת חומרים) במרכז כל אתר חיבור באמצעות קצה פיפטה של 10 μL. הערה: דבק רקמות מכסה את אתרי הקבצים המצורפים ומתייבש במהירות. דבק הרקמה מספק ממשק מליטה בין הגולגולת לבין הצמנט הדנטלי המשמש להדבקת מוט הראש, ומונע ממים מהזימים להגיע לאתר החיבור.</li>
	<li>הניחו את גוף הדג בתנוחה זקופה ומקמו את מוט הראש מעט מעל וקאודלי לאתרי החיבור כהכנה להדבקת מוט הראש.</li>
	<li>הכינו מלט דנטלי (ראו טבלת חומרים) והשתמשו בו מיד כדי להדביק את מוט הראש לגולגולת (איור 2C). ההליך הוא רגיש בזמן ויש לעשות אותו בתוך 45 שניות.<ol><li>מערבבים כף קטנה אחת של פולימר עם ארבע טיפות של מונומר מהיר וטיפה אחת של זרז V. מערבבים את התערובת באופן שווה במשך 15 שניות.</li>
		<li>השתמשו במיקרופיפטה ובקצה פיפטה של 10 מיקרוליטר כדי למרוח את התערובת על אתרי החיבור ועל האזור שבין האתרים. הימנעו מכיסוי הזימים והעיניים.</li>
		<li>לחץ בעדינות על מוט הראש על המלט באמצעות המיקרומניפולטור. מכסים את מוט הראש במלט שנותר.</li>
		<li>המתן 12 דקות כדי לאפשר ריפוי של מלט שיניים. יש להימנע ממגע מים עם המלט.</li>
	</ol></li>
	<li>כדי לשפר את הגישה האופטית למוח הקדמי לצורך הדמיית סידן, הסר את העור מעל הטלנספלון. הסרת עור יכולה להיעשות תוך 3 דקות עם חמישה חתכים באמצעות אזמל (איור 2D). יש להקפיד על הסרת טיפות שומנים הנצמדות לפני השטח של הגולגולות.</li>
	<li>לאחר הריפוי, להסיר את החימר מן מוט הראש.</li>
	<li>מעבירים את כל הקפסולה מהתותח לכוונון המגרש במודול טעינת הדגים של המיקרומניפולטור.</li>
	<li>השתמש micromanipulator כדי למקם את הדג. מוט הראש צריך להיות ממוקם על גבי עמודי המתכת של במת הראש. הגדילו מעט את זווית הגובה של הדג כך שפני השטח של המוח הקדמי יוכלו להיות מיושרים טוב יותר למישור האופטי במהלך דימות של שני פוטונים.</li>
	<li>הדביקו את מוט הראש לעמודי המתכת בדבק אולטרה סגול (UV) הניתן לריפוי. חשיפה של 15 שניות לקרינת UV מספיקה לריפוי.</li>
	<li>מוציאים את הדג מהקפסולה ונועלים את במת הראש על צלחת הבסיס בתוך המיכל המשושה למחצה.</li>
	<li>לטבול את החיה במי מיכל דגים. הדג צריך להתחיל לנשום ולהתאושש מהרדמה תוך 1-2 דקות. הערה: לחלופין, השתמש בזילוח מזרק כדי לספק מים מתוקים לפה.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65526/65526fig02.jpg"> איור 2: שלבים מרכזיים במהלך ניתוח ריסון ראש . (A) הרכב הקפסולה בתוך התותח. (B) אתרי התקשרות על הגולגולת (אדום). חיצים אדומים מציינים אתרי כלי דם. (C) למעלה: מוט ראש המחובר לגולגולת הדג. למטה: דגים טעונים על במת הראש. (D) חתכים הדרושים להסרת העור מעל המוח הקדמי. מספרים מציינים את רצף החיתוך. הימנע מהסרת עור באתר המסומן (ראש החץ) כדי למנוע דימום של החיה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65526/65526fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
3. הדמיה של שני פוטונים
<ol><li>הפעל את הלייזר והמתן 30 דקות עד שהכוח יתייצב. הגדר את אורך הגל ל- 920 ננומטר ואת ההספק לכ- 50 mW בדגימה. הערה: קרן הלייזר הנשלטת על ידי סורק התהודה נעה באיטיות בנקודות התפנית של נתיב הסריקה. כדי למנוע נזק לרקמות, תא פוקלס משמש להפחתת כוח הלייזר בנקודות המפנה.</li>
	<li>הניחו את תא ההקלטה המכיל את דגי הזברה מרוסני הראש על פלטפורמת הניסוי (איור 3A). הפלטפורמה אמורה להיות מסוגלת לנוע בכיווני X ו- Y מבלי לפגוע במגבלה של שלב התרגום.</li>
	<li>מקם את עדשת האובייקט קרוב ככל האפשר לפני השטח של המוח הקדמי. עדשת האובייקט צריכה להיות מכוונת לקצה הקדמי של האישון (איור 3B).</li>
	<li>פתחו את תריס הלייזר והפעילו את ה-PMT. הרימו בהדרגה את עדשת האובייקט (~1 מ"מ) עד שהמוח הקדמי הגבי מתגלה בתמונה הפלואורסצנטית (איור 3C).</li>
	<li>כדי להגדיל את מספר תאי העצב המוקלטים, השתמש במפעיל piezo כדי לקבל תמונות בעומקים מרובים (שישה מישורי תמונה, 15 מיקרומטר זה מזה). זה יגדיל את תפוקת הנתונים על חשבון קצב המסגרות. אפשר סריקה מהירה של ציר Z כדי לשלוט במפעיל piezo (מצב אחיד, מספר פרוסות = 6, גודל צעד = 15 מיקרומטר, צורת גל = שן מסורת, זמן טיסה לאחור = 4 אלפיות השנייה, השהיית מפעיל = 8 אלפיות השנייה).</li>
	<li>להקלטת התנהגות, הפעל את נוריות האינפרא-אדום (IR) של 810 ננומטר משני צידי המיכל. התאם את הזווית כדי להאיר את כל הגוף, אשר צריך להיות גלוי בבירור במצלמה.</li>
	<li>הפעל את המקרנים.</li>
	<li>התחל להקליט נתונים.</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65526/65526fig3v2.jpg"> איור 3: הגדרה לביצוע הדמיית סידן, הקלטת התנהגות ותצוגת גירוי חזותי. (A) שלושה מקרנים מציגים גירוי חזותי על דפנות המיכל המשושה למחצה. נורות IR בצד משמשות להאיר את גוף דג הזברה. (B) מיקום העדשה האובייקטיבית. משמאל: מבט קדמי. מימין: מבט מהצד. המרחק בין עדשת האובייקט 16x לבין אזור המטרה במוח הוא בסביבות 2.5 מ"מ. (C) תמונה לדוגמה של שני פוטונים. משמאל: הקרנה מקסימלית של כל המוח הקדמי הגבי ב-Tg [neuroD:GCaMP6f]. מימין: תמונה מוגדלת כדי לחשוף תאי עצב על פני אזורי מוח מרובים. כניסה: הגדלה גבוהה יותר מאזור אחר במוח. תמונות הן ממוצעים של 10 שניות של נתונים שהוקלטו ב- 5Hz. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65526/65526fig03large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

מעקב אחר התנהגות ודפוס פעילות עצבית במוח הקדמי של דגי הזברה

<ol><li>Grienberger, C., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+calcium+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging calcium in neurons.</a> Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).</li>
<li>Chow, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+three-photon+imaging+of+the+brain+in+intact+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Deep three-photon imaging of the brain in intact adult zebrafish.</a> Nature Methods. 17 (6), 605-608 (2020).</li>
<li>Mittmann, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+calcium+imaging+of+evoked+activity+from+L5+somatosensory+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Two-photon calcium imaging of evoked activity from L5 somatosensory neurons in vivo.</a> Nature Neuroscience. 14 (8), 1089-1093 (2011).</li>
<li>Friedrich, R. W., Jacobson, G. A., Zhu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circuit+neuroscience+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Circuit neuroscience in zebrafish.</a> Current Biology. 20 (8), R371-R381 (2010).</li>
<li>Kappel, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+recognition+of+social+signals+by+a+tectothalamic+neural+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visual recognition of social signals by a tectothalamic neural circuit.</a> Nature. 608 (7921), 146-152 (2022).</li>
<li>Bartoszek, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ongoing+habenular+activity+is+driven+by+forebrain+networks+and+modulated+by+olfactory+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Ongoing habenular activity is driven by forebrain networks and modulated by olfactory stimuli.</a> Current Biology. 31 (17), 3861-3874 (2021).</li>
<li>Valente, A., Huang, K. H., Portugues, R., Engert, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogeny+of+classical+and+operant+learning+behaviors+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Learning+%26+Memory%22%5BJournal%5D)">Ontogeny of classical and operant learning behaviors in zebrafish.</a> Learning & Memory. 19 (4), 170-177 (2012).</li>
<li>Buske, C., Gerlai, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+of+shoaling+behavior+is+accompanied+by+changes+in+the+dopaminergic+and+serotoninergic+systems+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Psychobiology%22%5BJournal%5D)">Maturation of shoaling behavior is accompanied by changes in the dopaminergic and serotoninergic systems in zebrafish.</a> Developmental Psychobiology. 54 (1), 28-35 (2012).</li>
<li>Huang, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+virtual+reality+system+to+analyze+neural+activity+and+behavior+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A virtual reality system to analyze neural activity and behavior in adult zebrafish.</a> Nature Methods. 17 (3), 343-351 (2020).</li>
<li>Rupprecht, P., Prendergast, A., Wyart, C., Friedrich, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remote+z-scanning+with+a+macroscopic+voice+coil+motor+for+fast+3D+multiphoton+laser+scanning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Remote z-scanning with a macroscopic voice coil motor for fast 3D multiphoton laser scanning microscopy.</a> Biomedical Optics Express. 7 (5), 1656-1671 (2016).</li>
<li>Papadopoulos, I. N., Jouhanneau, J. -S., Poulet, J. F. A., Judkewitz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scattering+compensation+by+focus+scanning+holographic+aberration+probing+%28F-SHARP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Photonics%22%5BJournal%5D)">Scattering compensation by focus scanning holographic aberration probing (F-SHARP).</a> Nature Photonics. 11 (2), 116-123 (2017).</li>
<li>Torigoe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+capable+of+generating+future+state+prediction+error+show+improved+active+avoidance+behavior+in+virtual+reality%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Zebrafish capable of generating future state prediction error show improved active avoidance behavior in virtual reality.</a> Nature Communications. 12 (1), 5712(2021).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול מפורט לריסון ראשם של דגי זברה בוגרים לצורך הדמיית סידן של שני פוטונים. ישנם שני שלבים קריטיים להשגת משענת ראש יציבה מספיק להדמיית סריקת לייזר. ראשית, מוט הראש צריך להיות מודבק לאתרי החיבור הספציפיים של הגולגולות. חלקים אחרים של הגולגולת הם לעתים קרובות דקים מכדי לספק יציבות מכנית ואף עלולים להישבר במהלך תנועות גוף חזקות. שנית, יש להסיר היטב את העור שמעל אתרי החיבור. יש לייבש היטב גם מים שיוריים. זה מאפשר לגולגולת להיקשר בחוזקה לדבק הרקמות. מובאת טבלה המפרטת בעיות פוטנציאליות, הגורמים להן והפת...

הדמיית סידן פלואורסצנטי עם אינדיקטורים מקודדים גנטית או צבעים סינתטיים הייתה שיטה רבת עוצמה למדידת פעילות עצבית בבעלי חיים מתנהגים, כולל פרימטים לא אנושיים, מכרסמים, ציפורים וחרקים1. את פעילותם של מאות תאים, עד כ-800 מיקרומטר מתחת לפני השטח של המוח, ניתן למדוד בו זמנית באמצעות דימות רב-פוטוני 2,3. ניתן למדוד את פעילותם של סוגי תאים מסוימים גם על ידי ביטוי מדדי סידן באוכלוסיות נוירונים מוגדרות גנטית. יישום שיטת ההדמיה עבור מודלים קטנים של בעלי חוליות פותח אפשרויות חדשות בתחום החישוב העצבי על פני אזורי מוח.
דגי זברה הם מערכת מודל נפוצה במחקר מדעי המוח. דגי זברה זחלים בסביבות 6 ימים לאחר ההפריה שימשו להדמיית סידן בשל מוחם המיניאטורי וגופם השקוף4. דגי זברה צעירים (בני 3-4 שבועות) משמשים גם לחקר המנגנונים העצביים העומדים בבסיס מסלולים סנסומוטוריים 5,6. עם זאת, רמת הביצוע המקסימלית עבור התנהגויות מורכבות, כולל למידה אסוציאטיבית והתנהגויות חברתיות, מושגת בגיל מבוגר יותר 7,8. לפיכך, נדרש פרוטוקול אמין כדי לחקור תפקודים קוגניטיביים מרובים במוחם של דגי זברה בוגרים באמצעות שיטות הדמיה. בעוד שזחלי זברה ודגי זברה צעירים יכולים להיות מוטמעים באגרוז להדמיית in vivo, דגי זברה בוגרים בגיל חודשיים ומעלה סובלים מהיפוקסיה בתנאים כאלה והם חזקים מדי פיזית מכדי להיות מרוסנים על ידי אגרוז. לכן, נדרש הליך כירורגי כדי לייצב את המוח ולאפשר לבעל החיים לנשום בחופשיות דרך הזימים.
כאן, אנו מתארים פרוטוקול ריסון ראש הכולל עיצוב חדשני של מוט ראש יחיד. זמן הניתוח המופחת של 25 דקות מהיר פי שניים מהשיטההקודמת 9. אנו מתארים גם את העיצוב של תא ההקלטה (מיכל חצי משושה), שלב הראש ומנגנון נעילה מהירה לשילוב שני החלקים9. לבסוף, מתואר גם המערך להצגת גירוי חזותי סוחף לחקר פעילות והתנהגויות מוחיות המופעלות על ידי ראייה. באופן כללי, ההליכים המתוארים כאן יכולים לשמש לביצוע דימות סידן של שני פוטונים באוכלוסיות תאים מוגדרות גנטית בדג זברה בוגר מרוסן ראש, המאפשר לחקור פעילויות מוחיות במהלך פרדיגמות התנהגותיות שונות.

<table><tbody><tr><td>כרטיס רכישה</td><td>MBF ביוסיינס</td><td>Vidrio vDAQ</td><td>מיקרוסקופ</td></tr><tr><td>סרט הקרנה אחורית</td><td>קימוטו</td><td>מסך דילנד - GSK</td><td>גירוי חזותי נוכחי</td></tr><tr><td>מסנן פס-מעבר (510/80 ננומטר)</td><td>כרומה</td><td>ET510/80m</td><td>מיקרוסקופ</td></tr><tr><td>פלטת בסיס למיכל החצי-משושה</td><td>בהתאמה אישית</td><td>ראו קבצים משלימים</td><td>תא הקלטות</td></tr><tr><td>פילטר מצלמה (< 875 מייל ימי)</td><td>אדמונד אופטיקס</td><td>#86-106</td><td>רישום התנהגות</td></tr><tr><td>פילטר מצלמה (>700 ננומטר)</td><td>אדמונד אופטיקס</td><td>#43-949</td><td>רישום התנהגות</td></tr><tr><td>עדשת מצלמה</td><td>Thorlabs</td><td>MVL50M23</td><td>רישום התנהגות</td></tr><tr><td>זיקית ויז'ן-ס</td><td>קוהרנטי</td><td>ויז'ן-ס</td><td>לייזר</td></tr><tr><td>לוח עגול לשלב הראשי</td><td>בהתאמה אישית</td><td>ראו קבצים משלימים</td><td>תא הקלטות</td></tr><tr><td>בקר למפעיל פיזו</td><td>Physik Instrumente&nbsp;</td><td>E-665. CR</td><td>מיקרוסקופ</td></tr><tr><td>מגבר זרם</td><td>Thorlabs</td><td>TIA60</td><td>מיקרוסקופ</td></tr><tr><td>אלידנט Q-6</td><td>רולנס אנטרפרייז</td><td>Q-6</td><td>ניתוח: מנורת UV</td></tr><tr><td>מסנן פליטה 510/80 ננומטר</td><td>כרומה</td><td>ET510/80m</td><td>מיקרוסקופ</td></tr><tr><td>מוט ראש</td><td>בהתאמה אישית</td><td>ראו קבצים משלימים</td><td>תא הקלטות</td></tr><tr><td>אור אינפרא-אדום</td><td>Thorlabs</td><td>M810L3</td><td>רישום התנהגות</td></tr><tr><td>מקרן LED</td><td>AAXA</td><td>מקרן P2B LED Pico</td><td>גירוי חזותי נוכחי</td></tr><tr><td>טישו נייר לח (Kimwipe)</td><td>מדעי קים-טק</td><td>34155</td><td>ניתוח: רקמת נייר לחה</td></tr><tr><td>שלב דגימה ממונע XY</td><td>זאבר</td><td>X-LRM050</td><td>מיקרוסקופ</td></tr><tr><td>פילטרים בצפיפות נייטרלית (50% העברה)</td><td>Thorlabs</td><td>NE203B</td><td>גירוי חזותי נוכחי</td></tr><tr><td>&Oslash; מחזיק עמוד 1/2"</td><td>ThorLabs</td><td>PH1.5V</td><td>ניתוח: צינור חלול לתותח</td></tr><tr><td>&Oslash; עמוד אופטי מפלדת אל-חלד 1/2"</td><td>ThorLabs</td><td>TR150/M</td><td>ניתוח: מודול העמסת דגים</td></tr><tr><td>עדשת אובייקטיבי 16x, 0.8NA</td><td>ניקון</td><td>CF175</td><td>מיקרוסקופ</td></tr><tr><td>חימר מודלינג מבוסס שמן</td><td>לי השין קליי</td><td>C4086</td><td>ניתוח: מחזיק מוט ראש</td></tr><tr><td>דבק אופטי</td><td>נורלנד פרודקטס</td><td>NOA68</td><td>ניתוח: דבק ריפוי UV</td></tr><tr><td>צינור פוטומולטיפלייר</td><td>המאמאצו</td><td>H11706P-40</td><td>מיקרוסקופ</td></tr><tr><td>מפעיל פיזו</td><td>Physik Instrumente&nbsp;</td><td>P-725.4CA PIFOC</td><td>מיקרוסקופ</td></tr><tr><td>תא פוקלס</td><td>קונופיטיקה</td><td>M350-80-LA-BK-02</td><td>מיקרוסקופ</td></tr><tr><td>פילטר Red Wratten (> 600 ננומטר)</td><td>אדמונד אופטיקס</td><td>#53-699</td><td>גירוי חזותי נוכחי</td></tr><tr><td>מערכת סריקה רזוננט-גלבו</td><td>INSS</td><td>RGE-02</td><td>מיקרוסקופ</td></tr><tr><td>מהדק בזווית ישרה עבור ואוסלאש; פוסט 1/2"</td><td>ThorLabs</td><td>RA90/M</td><td>ניתוח: מודול העמסת דגים</td></tr><tr><td>מהדק מסתובב עבור &Oslash; פוסט 1/2"</td><td>ThorLabs</td><td>SWC/M</td><td>ניתוח: מודול העמסת דגים</td></tr><tr><td>ScanImage</td><td>MBF ביוסיינס</td><td>גרסה בסיסית</td><td>מיקרוסקופ</td></tr><tr><td>מיכל חצי-משושה</td><td>בהתאמה אישית</td><td>ראו קבצים משלימים</td><td>תא הקלטות</td></tr><tr><td>סופר-בונד C& B Kit</td><td>סאן מדיקל קו.</td><td>סופר-בונד C& B</td><td>ניתוח: מלט דנטלי</td></tr><tr><td>טריקאין מתאנסולפונאט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>E10521</td><td>ניתוח: הרדמה</td></tr><tr><td>מצלמת USB</td><td>פליר</td><td>BFS-U3-13Y3M-C</td><td>רישום התנהגות</td></tr><tr><td>וטבונד</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td>ניתוח: דבק רקמה</td></tr></tbody></table>

הדמיית סידן דו-פוטון של פעילות המוח הקדמי בדגי זברה בוגרים

Two-Photon Calcium Imaging of Forebrain Activity in Behaving Adult Zebrafish

דגי זברה בוגרים (Danio rerio) מפגינים רפרטואר עשיר של התנהגויות לחקר תפקודים קוגניטיביים. יש להם גם מוח מיניאטורי שיכול לשמש למדידת פעילויות בין אזורי מוח באמצעות שיטות הדמיה אופטית. עם זאת, דיווחים על רישום פעילות מוחית בדגי זברה בוגרים היו נדירים. המחקר הנוכחי מתאר הליכים לביצוע הדמיית סידן של שני פוטונים במוח הקדמי הגבי של דגי זברה בוגרים. אנו מתמקדים בצעדים לריסון דגי זברה בוגרים מלהזיז את ראשם, מה שמספק יציבות המאפשרת הדמיה בלייזר של פעילות המוח. בעלי החיים המרוסנים לראש יכולים להזיז בחופשיות את חלקי גופם ולנשום ללא עזרים. מטרת ההליך היא לקצר את זמן ניתוח ריסון הראש, למזער את תנועת המוח ולמקסם את מספר תאי העצב שנרשמו. כאן מתוארת גם הגדרה להצגת סביבה חזותית אימרסיבית במהלך הדמיית סידן, שניתן להשתמש בה כדי לחקור קורלציות עצביות העומדות בבסיס התנהגויות המופעלות על ידי ראייה.

הפרוטוקול מורכב משני חלקים: ניתוח ריסון ראש והדמיית סידן בשני פוטונים של פעילות עצבית במוח הקדמי. הצלחת הניתוח מוגדרת על ידי הישרדות החיה ויציבות ריסון הראש. ניתן לשפר מאוד את שיעור ההישרדות על ידי זילוח תכוף של תמיסת TMS 0.01% דרך הפה במהלך הניתוח. דגים צריכים להתאושש מהרדמה ולנשום באופן פעיל תוך 1-2 דקות לאחר טבילתם במי מיכל הדגים. הדמיית סידן של שני פוטונים מאפשרת רישום פעילות של נוירונים בודדים במוח הקדמי הגבי בעומק של עד 200 מיקרומטר מפני השטח של המוח דרך גולגולות שלמות (~ 40 מיקרומטר עובי). טווח הדמיה זה מכסה אזורי...

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לביצוע הדמיית סידן של שני פוטונים במוח הקדמי הגבי של דגי זברה בוגרים.

Adult zebrafish (Danio rerio) exhibit a rich repertoire of behaviors for studying cognitive functions. They also have a miniature brain that can be used ...

המוח הקדמי של הדג מארח אזורים החשודים כהומולוגיים לאזורי מוח של יונקים המעורבים בהתנהגות מורכבת. אלה כוללים את ההיפוקמפוס, קליפת המוח והאמיגדלה. כיום אנו מנסים להבין את ההשפעה של מידע חושי על הפעילות של אזורי המוח האלה.המחקר הנוכחי במדעי המוח של דגי זברה משתמש בשני דימות סידן פוטונים של זחלים משותקים. בשילוב עם מאמרי התנהגות מבוססי מציאות מדומה, כדי לחקור עיבוד מוטורי חושי במוח. רוב המחקר על מוח דג הזברה נעשה על זחלים, אולם כמה התנהגויות מורכבות בדגים אינן מתפתחות במלואן עד לבגרות.הפרוטוקול שלנו מאפשר לחקור את פעילות המוח אצל המבוגר במהלך ההתנהגות. פרוטוקול זה קיצר את זמני הניתוח בחמישים אחוז בהשוואה לשיטה הקודמת. זוהי גישה יעילה יותר לריסון ראשו של דג זברה בוגר לקבלת תמונה טובה יותר.פרוטוקול ריסון ראש זה פתח הזדמנות לבצע ניסוי in vivo על מוח דג הזברה הבוגר. בנוסף לתמונת הסידן של שני פוטונים, ריסון הראש מאפשר מניפולציה אופטו-גנטית, אלקטרו-פיזיולוגיה ואפילו הדמיית אולטרסאונד של דגים חיים.

two-photon-calcium-imaging-forebrain-activity-behaving-adult

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

סרטון זה מדגים את השיטה לחקר זיהוי טרף חזותי בזחלי זברה טרנסגניים באמצעות הדמיה פלואורסצנטית מבוססת מחוון סידן כאשר תאי העצב שלהם מבטאים קומפלקסים של אינדיקטור סידן פלואורסצנטי.

ניתוח הפעילות העצבית המעוררת טרף בזחל דג זברה מהונדס

מקור: Schramm, P. et al. הדמיה in vivo של רקמת מוח פעילה לחלוטין בזחלים וצעירים של דג זברה ער על ידי הסרת גולגולת ועור. J. Vis. Exp. (2021)סרטון זה מדגים את ההדמיה in vivo של נוירונים במוח הקטן בזחלי דג זברה טרנסגניים, המבטאים חלבונים פלואורסצנטיים בנוירונים של פורקיניה. התהליך כולל הרדמת הזחלים, שיתוקם באגרוז והסרה זהירה של העור הפיגמנטי כדי לשפר את חדירת האור ועוצמת הקרינה. לבסוף, הדגימות המוכנות מצולמות תחת מיקרוסקופ קונפוקלי כדי לדמיין את הנוירונים המסומנים בבירור.

הדמיה in vivo של מוח זחל דג הזברה להדמיית נוירונים במוח הקטן

שיטה פשוטה להקליט פוטנציאלי שדה תאיים במוח הקדמי דג זברת הזחל מתוארת. השיטה מספקת...

הקלטת אלקטרו מוח קדמי בזחל דג זברה

מאמר זה מתאר כיצד יכול להיות משותק דג הזברה מבוגר, מחוברת לצינורות, ומשמש לניסויי in vivo אלקטרו לאפשר הקלטות ומניפולציה של פעילות עצבית בבעלי חיים בשלמותה.

הקלטת אלקטרו במוח של דג הזברה למבוגר שלמה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ablate של subpopulation שכותרתו גנטית של נוירונים על ידי לייזר שני הפוטונים מן דג זברה הזחלים.

אבלציה של אוכלוסיה עצביים באמצעות לייזר שני הפוטונים והערכה שלה באמצעות הדמיית סידן והקלטה התנהגותית הזחלים דג זברה

ב vivo הדמיה היא כלי רב עוצמה שניתן להשתמש בו כדי לחקור את המנגנונים הסלולריים בבסיס פיתוח מערכת העצבים. כאן אנו מתארים טכניקה לשימוש מיקרוסקופיה מיקוד הזמן כדי להמחיש מספר גדול של המוח ססגוניות באמצעות התווית בזמן אמת בתוך מערכת העצבים דג זברה המתפתח.

מדמיין את המוח המתפתח בחיים דגים באמצעות הברקשת וזמן-הדמיה קונמיקוד

כאן אנו מציגים שיטה לדימוי המוח העוברי של דג הזברה בשלבים של זחלים ונוער. הליך מיקרו-פולשני זה, המותאם מגישות אלקטרופיזיולוגיות, מספק גישה לפרטים תאיים ותת-תאיים של נוירון בוגר וניתן לשלבו עם אופטוגנטיקה ומחקרים נוירופרמקולוגיים לאפיון תפקוד המוח והתערבות תרופתית.

In vivo הדמיה של רקמת מוח פעילה לחלוטין בזחלי דגי זברה ערים וצעירים על ידי הסרת גולגולת ועור

מוצג כאן פרוטוקול להדמיית מוח שלם in vivo של דגי זברה זחלים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי תלת ממדי. הליך הניסוי כולל הכנת דגימה, רכישת תמונה והדמיה.

ב Vivo הדמיה מוחית שלמה של זחלי דגי זברה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי תלת מימדי

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לבחינת פעילות עצבית באזורי מוח של דגי זברה טרנסגניים המבטאים מדדי סידן GCaMP באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.

ב Vivo הדמיה פלואורסצנטית קונפוקלית של פעילות עצבית הנגרמת על ידי גירוי חושי בדג זברה זחל מרוסן חלקית

הסרטון הנוכחי מדגים שיטה אשר מנצל שילוב של electroporation ו מיקרוסקופיה confocal לבצע הדמיה לחיות על הפרט ובתאים עצבית forebrain דג הזברה מתפתח.

זמן לשגות הדמיה חיה של Related Clonally ובתאים עצבית של פיתוח דג הזברה forebrain

למדו הדמיית סידן דו-פוטון של פעילות המוח הקדמי בדגי זברה בוגרים. שיטה זו מאפשרת לחקור את השפעת המידע החושי על פעילות נוירונים בהקשרים התנהגותיים מורכבים.

הדמיית סידן דו-פוטון של פעילות המוח הקדמי בדגי זברה בוגרים

גלה סרטונים נוספים