Name: RNA פלואורסצנטי באתרו הכלאה ללוקליזציה ארוכה של RNA לא מקודד בתאי אוסטאוסרקומה אנושיים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 27 s
Description: למד את פרוטוקול RNA FISH לאיתור lncRNA בתאי אוסטאוסרקומה אנושיים. השיטה מציגה הליך ניסויי מקיף לאיתור SNHG6 בציטופלזמה ומספקת מסגרת ייחוס למחקרי סרטן.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכת על ידי מענקים מ (1) תוכנית המו"פ הלאומית של סין (2020YFE0201600); (2) הקרן הלאומית למדעי הטבע (81973877 ו-82174408); (3) מרכז שנגחאי לחדשנות שיתופית של טרנספורמציה תעשייתית של הכנת TCM בבית חולים; (4) פרויקטים מחקריים במסגרת תקציב אוניברסיטת שנגחאי לרפואה סינית מסורתית (2021LK047).

עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים על כל החומרים, הריאגנטים והמכשירים המשמשים בפרוטוקול זה. איור 1 מראה את הפרוטוקול הכולל של דגי RNA; טבלה 1 מכילה את ההרכב של כל הפתרונות וטבלה 2 מכילה את רצפי הפריימר המשמשים בפרוטוקול זה.
1. הכנת בדיקה
<ol><li>זהה ורכוש את רצף FASTA של lncRNA יעד של עניין, למשל, מ GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). בעקבות האינדיקציות באתר, עצבו את הגשושיות ISH באינטרנט19, ועיינו בהצעות של אלגוריתם העיצוב לרשום את הגשושיות שיש להזמין עם תווית Cy3.</li>
	<li>יש לדגור על מאגר ההכלאה בטמפרטורה של 37°C למשך שעתיים מראש.</li>
	<li>יש להמיס 4 בדיקות בצפיפות אופטית (OD) ב-160 מיקרוליטר של דיאתילפירוקרבונט (DEPC) המטופל ב-ddH2O בריכוז של 1 מ"ג/מ"ל הרחק מהאור. הערה: צפיפות אופטית (OD) מייצגת את יחידת המידה של DNA ו-RNA. בדרך כלל, 1 יחידת OD = 33 מיקרוגרם / מ"ל DNA.</li>
	<li>הכינו 200 μL של תערובת הבדיקה עבור כל באר (1.2 μL-10 μL של בדיקה, 70 μL של חיץ הכלאה, להשלים את הנפח עם ddH2O עד 200 μL מטופל DEPC), ולהגדיר סדרה של 50 מיקרוגרם / מ"ל, 25 מיקרוגרם / מ"ל, 12.5 מיקרוגרם / מ"ל ו 6 מיקרוגרם / מ"ל. הערה: ריכוז הגשושית צריך להיחקר באופן ניסיוני מראש. ריכוז בדיקה גבוה יוביל לקשירה לא ספציפית של lncRNAs, בעוד שריכוז בדיקה נמוך יוביל לזיהוי לא רגיש או כושל של lncRNAs.</li>
	<li>נטרל את תערובת הבדיקה ב 73 ° C במשך 5 דקות. הערה: אם בדיקת הדנ"א המסומנת ב-Cy3 היא דו-גדילית, יש לפרק את הגשושית לדנ"א חד-גדילי בטמפרטורה של 95°C למשך 5 דקות, ואז לקרר במהירות למשך 2 דקות על קרח.</li>
</ol>2. הכנת תאים
<ol><li>זרעו 50,000 תאי 143B לבאר על כיסויי זכוכית סטריליים בצלחת תרבית תאים של 12 בארות ודגרו עליהם במשך 24 שעות (37°C, 5% CO2) ב-DMEM. הערה: מספר התאים הספציפי שנזרע כאן משתנה בהתאם לגודל התא, המתאים לתאי הזרע להגיע למפגש של 50% לאחר הדגירה במשך 24 שעות. כיסויי הזכוכית הסטריליים עגולים כדי להתאים לצלחת 12 בארות.</li>
	<li>הסר את המדיום ושטוף במשך 2 x 5 דקות עם 1x מי מלח חוצצים פוספט (PBS). הערה: הכן PBS 1x עם ddH2O. PBS ללא טיפול DEPC לא ניתן להשתמש מכיוון שהוא מכיל RNase. בצע את כל השלבים הבאים בתנאים נטולי RNase.</li>
	<li>הסר PBS 1x והוסף 200 μL של 100% אתנול בכל באר כדי לתקן במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>מוציאים את האתנול, מוסיפים 200 μL של 0.1% Triton X-100 (ב-1x PBS) בכל באר, ודגרים במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. הערה: הזמן צריך להיות נשלט בקפידה עם חדירות Triton X-100 ולא יכול להיות ארוך מדי.</li>
	<li>יש להסיר 0.1% Triton X-100 ולשטוף 2 x 5 דקות עם 1x PBS. הערה: אם יש להשהות את הפרוטוקול כאן, החלף את PBS באתנול 70% (דילול של 100% אתנול עם ddH2O נטול RNase) ואחסן את הדגימה ב- 4 ° C למשך עד 3 חודשים.</li>
	<li>הסר 1x PBS, הוסף 200 μL של 2x סודיום ציטראט מלח (SSC) חיץ (דילול של 20x SSC עם ddH2O ללא RNase) לתוך כל באר, ודגרה במשך 30 דקות ב 37 ° C.</li>
	<li>יש להסיר 2x SSC buffer, להוסיף 200 μL של 70% אתנול לתוך כל באר, ולדגור במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>יש להשליך את 70% האתנול, להוסיף 200 μL של 85% אתנול (דילול של 100% אתנול עם ddH2O נטול RNase) לתוך כל באר, ולדגור במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>יש להשליך את 85% האתנול, להוסיף 200 μL של 100% אתנול לכל באר, ולדגור במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>לספוג ולהשליך 100% אתנול; תנו לבארות להתייבש.</li>
</ol>3. הכלאה פלואורסצנטית באתרו (FISH)
<ol><li>הוסיפו 200 מיקרוליטר של תערובת בדיקה (מפורקת כמו בשלב 1.5) לכל באר ודגרו בטמפרטורה של 37°C למשך הלילה (16-18 שעות). הערה: קיים מתאם חיובי חזק בין טמפרטורת ההכלאה לבין ריכוז הבדיקה; לכן, כדי לייעל את הרקע, יש להפחית הן את טמפרטורת ההכלאה והן את ריכוז הבדיקה.</li>
	<li>למחרת, להוציא דגימות מ 37 מעלות צלזיוס ולהשליך את תערובת הבדיקה. יש להוסיף 200 μL של 0.4x SSC/0.3% Tween-20 buffer לכל באר (שחומם מראש ב-65°C) ולשטוף במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>הסר את מאגר 0.4x SSC/0.3% Tween-20, הוסף 200 μL של חיץ 2x SSC/0.1% Tween-20 לכל באר ושטוף במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>יש להסיר 2x SSC/0.1% Tween-20 buffer, להוסיף 200 μL של תמיסת צביעה 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (1 מיקרוגרם/מ"ל), ולהכתים למשך 20 דקות הרחק מאור.</li>
	<li>יש להשליך את תמיסת הצבע DAPI ולשטוף עם PBS אחד למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>הוסף 50 μL של אמצעי הרכבה המכיל מסטיק על המגלשה והנח את מכסה הזכוכית על המגלשה כדי לתקן. הערה: הקפד למקם את תלוש הכיסוי על השקופית כשצד התא כלפי מטה.</li>
	<li>התבוננו תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. הערה: השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי או במיקרוסקופ קונפוקלי לייזר; האחרון מייצר רגישות גבוהה יותר הדמיה בהירות.</li>
</ol>

FISH ללוקליזציה ארוכה של RNA לא מקודד בתאי אוסטאוסרקומה אנושיים

<ol><li>Djebali, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Landscape+of+transcription+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Landscape of transcription in human cells.</a> Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).</li>
<li>Li, C. H., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insight+into+the+role+of+long+noncoding+RNA+in+cancer+development+and+progression%5BTitle%5D)+AND+%22International+Review+of+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Insight into the role of long noncoding RNA in cancer development and progression.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 326, 33-65 (2016).</li>
<li>Pan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((lncRNA+FBXL19-AS1+regulates+osteosarcoma+cell+proliferation%2C+migration+and+invasion+by+sponging+miR-346%5BTitle%5D)+AND+%22OncoTargets+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">lncRNA FBXL19-AS1 regulates osteosarcoma cell proliferation, migration and invasion by sponging miR-346.</a> OncoTargets and Therapy. 11, 8409-8420 (2018).</li>
<li>Jia, D., Niu, Y., Li, D., Liu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((lncRNA+C2dat1+promotes+cell+proliferation%2C+migration%2C+and+invasion+by+targeting+miR-34a-5p+in+osteosarcoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology+Research%22%5BJournal%5D)">lncRNA C2dat1 promotes cell proliferation, migration, and invasion by targeting miR-34a-5p in osteosarcoma cells.</a> Oncology Research. 26 (5), 753-764 (2018).</li>
<li>Liu, Y., Wang, D., Ji, Q., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LncRNA+MATN1-AS1+for+prediction+of+prognosis+in+osteosarcoma+patients+and+its+cellular+function%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">LncRNA MATN1-AS1 for prediction of prognosis in osteosarcoma patients and its cellular function.</a> Molecular Biotechnology. 64 (1), 66-74 (2022).</li>
<li>Luo, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+study+long+noncoding+RNA+biology+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Methods to study long noncoding RNA biology in cancer.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 927, 69-107 (2016).</li>
<li>Zhao, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((lncRNA+TUSC7+inhibits+osteosarcoma+progression+through+the+miR-181a%2FRASSF6+axis%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">lncRNA TUSC7 inhibits osteosarcoma progression through the miR-181a/RASSF6 axis.</a> International Journal of Molecular Medicine. 47 (2), 583-594 (2021).</li>
<li>Tong, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LncRNA+RUSC1-AS1+promotes+osteosarcoma+progression+through+regulating+the+miR-340-5p+and+PI3K%2FAKT+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Aging%22%5BJournal%5D)">LncRNA RUSC1-AS1 promotes osteosarcoma progression through regulating the miR-340-5p and PI3K/AKT pathway.</a> Aging. 13 (16), 20116-20130 (2021).</li>
<li>Qi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ceRNA+in+cancer%3A+possible+functions+and+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Genetics%22%5BJournal%5D)">ceRNA in cancer: possible functions and clinical implications.</a> Journal of Medical Genetics. 52 (10), 710-718 (2015).</li>
<li>Tripathi, V., Fei, J., Ha, T., Prasanth, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+fluorescence+in+situ+hybridization+in+cultured+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">RNA fluorescence in situ hybridization in cultured mammalian cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1206, 123-136 (2015).</li>
<li>Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+single+RNA+transcripts+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Visualization of single RNA transcripts in situ.</a> Science. 280 (5363), 585-590 (1998).</li>
<li>Thomsen, R., Nielsen, P. S., Jensen, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dramatically+improved+RNA+in+situ+hybridization+signals+using+LNA-modified+probes%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Dramatically improved RNA in situ hybridization signals using LNA-modified probes.</a> RNA. 11 (11), 1745-1748 (2005).</li>
<li>Player, A. N., Shen, L. P., Kenny, D., Antao, V. P., Kolberg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-copy+gene+detection+using+branched+DNA+%28bDNA%29+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Single-copy gene detection using branched DNA (bDNA) in situ hybridization.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 49 (5), 603-612 (2001).</li>
<li>Hazra, R., Spector, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+visualization+of+RNA+transcripts+and+proteins+in+whole-mount+mouse+preimplantation+embryos+using+single-molecule+fluorescence+in+situ+hybridization+and+immunofluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Simultaneous visualization of RNA transcripts and proteins in whole-mount mouse preimplantation embryos using single-molecule fluorescence in situ hybridization and immunofluorescence microscopy.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 986261(2022).</li>
<li>Xu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((lncRNA+SNHG6+regulates+EZH2+expression+by+sponging+miR-26a%2Fb+and+miR-214+in+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hematology+%26+Oncology%22%5BJournal%5D)">lncRNA SNHG6 regulates EZH2 expression by sponging miR-26a/b and miR-214 in colorectal cancer.</a> Journal of Hematology & Oncology. 12 (1), 3(2019).</li>
<li>Yan, K., Tian, J., Shi, W., Xia, H., Zhu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LncRNA+SNHG6+is+associated+with+poor+prognosis+of+gastric+cancer+and+promotes+cell+proliferation+and+EMT+through+epigenetically+silencing+p27+and+sponging+miR-101-3p%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Physiology+and+Biochemistry%3A+International+Journal+of+Experimental+Cellular+Physiology%2C+Biochemistry%2C+and+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">LncRNA SNHG6 is associated with poor prognosis of gastric cancer and promotes cell proliferation and EMT through epigenetically silencing p27 and sponging miR-101-3p.</a> Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 42 (3), 999-1012 (2017).</li>
<li>Zhu, X., Yang, G., Xu, J., Zhang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+of+SNHG6+induced+cell+autophagy+by+targeting+miR-26a-5p%2FULK1+signaling+pathway+in+human+osteosarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell+International%22%5BJournal%5D)">Silencing of SNHG6 induced cell autophagy by targeting miR-26a-5p/ULK1 signaling pathway in human osteosarcoma.</a> Cancer Cell International. 19, 82(2019).</li>
<li>Birgani, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+non-coding+RNA+SNHG6+as+a+potential+biomarker+for+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Pathology+Oncology+Research%3A+POR%22%5BJournal%5D)">Long non-coding RNA SNHG6 as a potential biomarker for hepatocellular carcinoma.</a> Pathology Oncology Research: POR. 24 (2), 329-337 (2018).</li>
<li>Nielsen, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+lncRNA+by+LNA-based+in+situ+hybridization+in+paraffin-embedded+cancer+cell+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Detection of lncRNA by LNA-based in situ hybridization in paraffin-embedded cancer cell spheroids.</a> Methods in Molecular Biology. 2348, 123-137 (2021).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+noncoding+RNA+SNHG6+regulates+p21+expression+via+activation+of+the+JNK+pathway+and+regulation+of+EZH2+in+gastric+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Long noncoding RNA SNHG6 regulates p21 expression via activation of the JNK pathway and regulation of EZH2 in gastric cancer cells.</a> Life Sciences. 208, 295-304 (2018).</li>
<li>Traylor-Knowles, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization+techniques+for+paraffin-embedded+adult+coral+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization techniques for paraffin-embedded adult coral samples.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e57853(2018).</li>
<li>Wang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+molecule+RNA+FISH+%28smFISH%29+in+whole-mount+mouse+embryonic+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Single molecule RNA FISH (smFISH) in whole-mount mouse embryonic organs.</a> Current Protocols in Cell Biology. 83 (1), 79(2019).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

פרוטוקול RNA FISH זה יכול לא רק לזהות לוקליזציה של lncRNA בתאים, אלא גם לזהות את הקולוקליזציה של RNAs אחרים, DNA, או חלבונים בתאים, אשר יכול לשמש גם כדי לזהות את המיקום של lncRNA ברקמות משובצות פרפין. עם זאת, הפרוטוקול הספציפי במקרים כאלה שונה מכיוון שהרקמות המשובצות בפרפין צריכות להיות בשעווה21. הליך ניסיוני זה יכול להיות מיושם בצלחות של 48 או 96 בארות, אך צלחות 384 בארות קטנות מכדי שניתן יהיה להשתמש בהן כאן.
יש לציין מספר שלבים קריטיים של שיטה זו, כולל הסביבה נטולת RN...

הבנתנו את הגנום האנושי הורחבה מאוד על ידי ההתקדמות האחרונה בטכנולוגיית הגנום השלם. כ-93% מהגנום האנושי ניתן לשעתוק לרנ"א, אך רק 2% מהרנ"א ניתן לתרגם לחלבונים; 98% הנותרים של RNA שאין להם פונקציית תרגום חלבונים נקראים RNA לא מקודד (ncRNA)1. כקבוצה של רנ"א לא מקודד (ncRNAs), ncRNA ארוך (lncRNAs), המכיל מעל 200 נוקלאוטידים2, משכו תשומת לב גוברת בשל מעורבותם בתהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים רבים של התאים, כגון התמיינות, בקרת מחזור, אפופטוזיס, הגירה ופלישה 3,4,5. LncRNA ממלאים את תפקידם באמצעות מנגנונים שונים, כגון ויסות מבנה הכרומטין וביטוי גנים גרעיניים, שליטה בתהליך השחבור mRNA, ושינוי לאחר שעתוק6. LncRNAs מווסתים את ההתרחשות, ההתפתחות והגרורות של ממאירויות הן ברמת השעתוק והן ברמת השעתוק שלאחר השעתוק. ויסות השעתוק מתממש בגרעין על ידי השפעה על שעתוק RNA באמצעות קשירה למבנים הכרומוזומליים, בעוד שהוויסות שלאחר השעתוק מתממש בציטופלסמה על ידי שליטה בגני המטרה באמצעות מנגנון RNA תחרותי אנדוגני(ceRNA) 5,7,8. CeRNA חשפה מנגנון חדש של אינטראקציית RNA, כלומר ש-lncRNA יכול לשמש כספוג כדי לספוח miRNA ולעכב את הפירוק בתיווך miRNA של גני מטרה קשורים9. לכן, המידע לגבי לוקליזציה תת-תאית של lncRNAs, האם lncRNA מסוים ממוקם בציטופלסמה או בגרעין, חשוב כדי לסייע בזיהוי הפונקציות הביולוגיות שלהם.
כיום, לוקליזציה של lncRNA מזוהה בעיקר על ידי שתי שיטות, האחת היא על ידי בדיקת בידוד שברים גרעין/ציטופלסמה, והשנייה היא על ידי RNA FISH. בראשון, RNAs בשברים הציטופלזמיים והגרעיניים מופקים בהתאמה, ולאחר מכן הגברה PCR מבוצעת עם פריימרים ספציפיים lncRNA כדי לזהות את היחס של lncRNA בציטופלסמה ובגרעין. היתרון של שיטה זו הוא יעילות הזמן, בעוד החיסרון הוא כי לוקליזציה lncRNA בפועל אינו משתקף ישירות על ידי החלק היחסי של lncRNA בציטופלסמה ובגרעין. RNA FISH יכול לזהות לוקליזציה של lncRNA בתאים באמצעות תכנון רצפי שרשרת אנטיסנס ספציפיים ל-lncRNA ולאחר מכן תיוג בצבעים פלואורסצנטיים10. שיטות RNA FISH שופרו עם התקדמות בטכניקות בדיקה ושיטות זיהוי, כולל ערכות בדיקה מרובות אוליגו11 המסומנות בפלואורופור, בדיקות LNA 12 ובדיקות DNA מסועף (bDNA)13. RNA FISH יכול לא רק לזהות לוקליזציה של lncRNA, אלא גם לזהות את הלוקליזציה של RNAs אחרים, DNA, או חלבונים באמצעות צבע כפול או צבעוני immunofluorescence14.
בעבודה זו, כללנו את פרוטוקול זיהוי הלוקליזציה התוך-תאי המפורט של lncRNA גן מארח גרעין קטן RNA 6 (SNHG6) בתאי אוסטאוסרקומה (143B) על ידי RNA FISH כדוגמה. SNHG6 הוא lncRNA נוקלאוטיד 600-730 בצורתו השחבור הבוגר ומזוהה כאונקוגן חדשני במגוון סוגי סרטן אנושיים, כולל סרטן המעי הגס, סרטן קיבה, קרצינומה של תאים צלולים בשחלות, אוסטאוסרקומה וקרצינומה הפטוצלולרית15,16,17,18. מחקרים אישרו את מעורבותו של SNHG6 בהתנהגויות ביולוגיות של תאים סרטניים, כגון התפשטות, EMT ואוטופגיה, והראו לוקליזציה ציטופלזמית של SNHG6 שם הוא עשוי להשפיע על גני המטרה על ידי קשירה (ספוג) של miRNA15,16,17. פרוטוקול זיהוי מפורט זה של לוקליזציה תוך-תאית SNHG6 על ידי RNA FISH מוצג כאן.

<table><tbody><tr><td>מונה תאים אוטומטי</td><td>שנחאי Simo Biological Technology Co., Ltd</td><td>IC1000</td><td>ספירת תאים</td></tr><tr><td>צלחת תרבית תאים-12</td><td>שנחאי YueNian ביוטכנולוגיה ושות', בע"מ</td><td>3513, קורנינג</td><td>הנח את הכיסויים בצלחת</td></tr> <tr><td>&nbsp; קו תאים (143B)</td><td>בנק התאים של האקדמיה הסינית למדעים</td><td>CRL-8303</td><td>אוסטאוסרקומה סרטן קו תאים</td></tr><tr><td>צינור צנטריפוגה (15 מ"ל, 50 מ"ל)</td><td>שנחאי YueNian ביוטכנולוגיה ושות', בע"מ</td><td>&nbsp; 430790,</td><td>צנטריפוגה קורנינג התאים</td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>שנחאי YueNian ביוטכנולוגיה ושות', בע"מ</td><td>abs7026</td><td>התאים נזרעים על הכיסויים</td></tr><tr><td>Cy3 תווית-SNHG6 בדיקת DNA</td><td>שנחאי GenePharma ושות', בע"מ</td><td>A10005</td><td>זיהוי SNHG6</td></tr><tr><td>מיקום DMEM מדיה</td><td>שנחאי YueNian ביוטכנולוגיה ושות', בע"מ</td><td>LM-E1141</td><td>תרבית תאים בינונית</td></tr><tr><td>חממת</td> <td>אמבטיה יבשההיימן קיילין-בל מעבדה מכשירים ושות', בע"מ</td><td>DKT200-2&nbsp;</td><td>דגירה בטמפרטורות גבוהות שונות</td></tr><tr><td>אתנול 100%&nbsp;</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10009218</td><td>התייבשות</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי</td><td>שנחאי Waihai ביוטכנולוגיה ושות', בע"מ</td><td>אולימפוס BX43 מצויד במצלמה של Olympus U-TV0.5XC-3 (SN:5J01719), תצפית אולימפוס</td><td>ומיצוב</td></tr><tr><td>חממת</td><td>שנחאי Yiheng Scientific Instrument Co., LTD</td><td>DHP-9051</td><td>הדגימות הודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>הרכבה בינונית</td><td>סנגון ביוטק (שנחאי) ושות', בע"מ</td><td>E675004</td><td>חבר את הכיסויים לשקופית</td></tr><tr><td>שייקר</td><td>היימן קיילין-בל מעבדה מכשירים ושות', בע"מ</td><td>TS-8S</td><td>כביסה מדגם</td></tr><tr><td>שקופית</td><td>שנחאי YueNian ביוטכנולוגיה ושות', בע"מ</td><td>188105</td><td>הכיסויים מונחים על השקופית</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td><td>A600198</td><td>קרום חדיר וממברנה גרעינית</td></tr><tr><td>&nbsp; טריפסין (0.25%)</td><td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td><td>25200056, Gibco</td><td>טריפסין טיפול בתאים</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td><td>חומר ניקוי</td> <td>A600560</td></tr></tbody></table>

rna פלואורסצנטי באתרו הכלאה ללוקליזציה ארוכה של rna לא מקודד בתאי אוסטאוסרקומה אנושיים

RNA Fluorescence In Situ Hybridization for Long Non-Coding RNA Localization in Human Osteosarcoma Cells

התפקידים החשובים של RNA ארוך שאינו מקודד (lncRNAs) בסרטן נחקרו, כגון ויסות ההתפשטות, מעבר אפיתל-מזנכימלי (EMT), הגירה, חדירה ואוטופגיה של תאים סרטניים. זיהוי לוקליזציה של lncRNA בתאים יכול לספק תובנה לגבי תפקודיהם. על ידי תכנון רצף שרשרת האנטיסנס הספציפי ל-lncRNA ואחריו תיוג בצבעים פלואורסצנטיים, ניתן ליישם הכלאה פלואורסצנטית באתרו של RNA (FISH) כדי לזהות את הלוקליזציה התאית של lncRNAs. יחד עם התפתחות המיקרוסקופ, טכניקות RNA FISH מאפשרות כעת אפילו הדמיה של lncRNA מבוטא בצורה גרועה. שיטה זו יכולה לא רק לזהות לוקליזציה של lncRNA לבד, אלא גם לזהות את הלוקליזציה של RNA אחרים, DNA, או חלבונים באמצעות צבע כפול או multicolor immunofluorescence. כאן, כללנו את הליך הפעולה הניסויי המפורט ואת אמצעי הזהירות של RNA FISH באמצעות lncRNA גרעין קטן RNA מארח גן 6 (SNHG6) בתאי אוסטאוסרקומה אנושיים (143B) כדוגמה, כדי לספק התייחסות לחוקרים שרוצים לבצע ניסויים RNA FISH, במיוחד lncRNA דגים.

מוצגות תמונות מייצגות של דגי SNHG6 בתאי אוסטאוסרקומה אנושיים (איור 2). השליטה השלילית מטופלת עם בדיקת Ctrl שלילית; בקרה חיובית מטופלת עם U6 probe 20. בדיקת SNHG6 וגשושית U6 מסומנות ב- Cy3, הפולט פלואורסצנטיות אדומה. DAPI הוא צבע שמכתים את הדנ"א, אשר פולט פלואורסצנטיות כחולה. תוצאה זו מראה כי SNHG6 הוא מקומי בעיקר בציטופלסמה, ומידע זה יכול לספק כיוון חשוב למחקר נוסף של SNHG6.
אם משתמשים בריכוז גבוה מאוד של בדיקה, ניתן לראות צבע רקע תחת המיקר...

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה של הכלאה פלואורסצנטית באתרו של RNA כדי למקם את lncRNA בתאי אוסטאוסרקומה אנושיים.

RNA פלואורסצנטי באתרו הכלאה ללוקליזציה ארוכה של RNA לא מקודד בתאי אוסטאוסרקומה אנושיים

The important roles of long non-coding RNAs (lncRNAs) in cancer have been studied, such as regulating the proliferation, epithelial-mesenchymal transition ...

היקף המחקר שלנו הוא לספק פרוטוקול מפורט של RNA FISH המספק התייחסות למדענים שרוצים לבצע ניסויים ב- RNA FISH. המחקר שלנו קבע כי RNA FISH יכול לשמש כדי למקם lncRNA בתאי אוסטאוסרקומה אנושיים. הפרוטוקול שלנו סיפק הליך ניסיוני מקיף ואת אמצעי הזהירות עבור דגי RNA באמצעות lncRNA-SNHG6 בתאי אוסטאוסרקומה אנושיים כהפניה.

rna-fluorescence-situ-hybridization-for-long-non-coding-rna

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

הדמיה ב-RNA לוקליזציה Xenopus ביציות

פרוטוקול זה משמש בהצלחה כמותית לזהות רמות ודפוסים מרחביים של ביטוי mRNA של מספר סוגי רקמות על פני בעלי החוליות. השיטה יכולה לזהות תעתיקי שפע נמוך ומאפשר עיבוד של מאות שקופיות בו זמנית. אנו מציגים את הפרוטוקול באמצעות פרופיל הביטוי של היווצרות העופות המוח העוברי כדוגמה.

רדיואקטיבי באתרו הכלאה לזיהוי תבניות ביטוי מגוונות גנים רקמות

כאן אנו מתארים שלם הר...

הר כולו RNA פלורסנט<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים

RNA in situ hybridization (ISH) מאפשר הדמיה של RNA בתאים וברקמות. כאן אנו מראים כיצד ניתן להשתמש בהצלחה בשילוב של RNAscope ISH עם אימונוהיסטוכימיה או צבעים היסטולוגיים כדי לזהות mRNAs הממוקמים באקסונים בחלקים של מוחות עכברים ובני אדם.

איתור של Axonally המותאם למקום mRNAs בסעיפי מוח באמצעות ברזולוציה גבוהה<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה

כאן, אנו מתארים בחיי עיר הכלאה assay המאפשרת זיהוי רגיש וספציפי של רצפי קצר ככל נוקלאוטידים 50 עם רזולוציה נוקלאוטיד יחיד ברמת תא בודד. וזמינותו, אשר יכול להתבצע באופן ידני או אוטומטי, באפשרותך לאפשר ויזואליזציה של גרסאות splice, רצפים קצרים מוטציות בתוך ההקשר רקמות.

וריאציות גנטיות להמחיש מטרות קצרות, מוטציות נקודה בהקשר רקמות מורפולוגי עם RNA בחיי עיר Assay הכלאה

Reproducibly לספור את המספרים של mRNAs ב oocytes בודדים, מולקולה בודדת RNA פלורסצנטיות באתרו הכלאה (RNA-דג) היה אופטימיזציה עבור תאים שאינם מחסידי. Oocytes נאספו, hybridized עם הגששים ספציפית התעתיק, לכמת באמצעות תוכנה כימות של התמונה.

השימוש יחיד מולקולה פלורסנט ב באתרו הכלאה (SM-דג) כדי mRNAs Quantify ו Localize ב Oocytes מאתר

הפרוטוקול מתאר בדיקת הכלאה אימונופלואורסצנטית טנדם עם רקמה משובצת פרפין קבועה בפורמלין כדי לזהות ולכמת מיקרו-RNA וחלבונים מרובים בו זמנית.

הגברה וזיהוי של מיקרו-RNA באמצעות הכלאה נעולה של חומצת גרעין-באתרה כשיטת זיהוי וכימות חדשה

פרוטוקול זה מספק גישה מפורטת להערכת רמות שינוי m6A של RNA ספציפי באמצעות MeRIP-qPCR.

מבחן MeRIP-qPCR לזיהוי שינויים ברמות m6A של RNA ספציפי בתאי אוסטאוסרקומה

פרוטוקול ניסויי זה מספק שיטה יציבה, חסכונית ויעילה המשלבת הפלת lncRNA עם בדיקות ליצירת מושבות כדי לכמת את השפעת ה-lncRNA על התרבות תאי האוסטאוסרקומה.

בדיקת היווצרות מושבה לזיהוי יכולת ההתרבות של תאי האוסטאוסרקומה שנגרמו ל-LncRNA

הנוכחות של תאי גזע סרטניים (CSCS) ב סרקומות עצם נקשר לאחרונה בפתוגנזה שלהם. במאמר זה, אנו מציגים את הבידוד של CSCS מתרבויות תא ראשוניים המתקבלות ביופסיות אדם של אוסטאוסרקומה קונבנציונלי (OS) באמצעות היכולת של CSCS לגדול בתנאי nonadherent.

הקמת סרטן גזע תא תרבויות מן האדם הקונבנציונלי אוסטאוסרקומה

למד את פרוטוקול RNA FISH לאיתור lncRNA בתאי אוסטאוסרקומה אנושיים. השיטה מציגה הליך ניסויי מקיף לאיתור SNHG6 בציטופלזמה ומספקת מסגרת ייחוס למחקרי סרטן.

RNA פלואורסצנטי באתרו הכלאה ללוקליזציה ארוכה של RNA לא מקודד בתאי אוסטאוסרקומה אנושיים

גלה סרטונים נוספים