Name: הפלה ממוקדת של גנים במקלעת הכורואיד (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-16T14:10:00.000+00:00
Duration: 4 min 43 s
Description: חקור שיטות להפלה ממוקדת של ביטוי גנים במקלעת הכורואיד באמצעות זריקות ICV ו-Cre recombinase בעכברים. גילויים אלה מציעים אסטרטגיה טיפולית חדשה לטיפול בטרשת נפוצה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים בהכרת תודה על תמיכתן של הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מענק מס '31800903, שהוענק ל- W. Zheng) ופרויקט המדע והטכנולוגיה של וונג'ואו (מס 'Y2020426, הוענק ל- Y. Y. Weng) על עבודה זו.

כל ההליכים בבעלי חיים המתוארים במחקר זה נערכו בהתאם להנחיות המפורטות במדריך NIH לטיפול ושימוש בחיות מעבדה ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטה הרפואית וונג'ואו.
1. בעלי חיים
<ol><li>רכשו עכברי C57BL/6 זכרים בגילאי 8-12 שבועות ובמשקל 20-22 גרם.</li>
	<li>השג את קו העכבר המהונדס Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato (Ai9), ואת עכברי A2AR flox/flox זכרים.</li>
	<li>הקצו את העכברים באופן אקראי לשתי קבוצות ושוכנו בכלובים, עם מקסימום חמישה עכברים בכל כלוב, תחת מחזור סטנדרטי של 12 שעות אור / 12 שעות חושך למשך שבוע אחד.</li>
	<li>לספק את העכברים עם מספיק מזון ומים ולשמור אותם בטמפרטורה קבועה ב 25 °C (75 °F).</li>
</ol>2. הפלת ChP ספציפית של A2ARs עם AAV2/5-shRNA
<ol><li>שקול כל עכבר ורשום את הערכים.</li>
	<li>מרדימים את העכברים תוך צפקית עם 1% נתרן pentobarbital במינון של 6-8 מ"ל / ק"ג שווה ערך 60-80 מ"ג / ק"ג pentobarbital, ומניחים את העכבר על כרית חימום כדי לשמור על חום. הערה: חיוני לתת את המינון הנכון של נתרן pentobarbital בהתאם למשקל העכבר כדי להבטיח ניתוח מוצלח. ההרדמה לא צריכה להיות עמוקה מדי, כפי שהוא עלול לגרום לתמותה, אבל לא צריך להיות רדוד מדי, כמו העכבר עלול להתעורר במהלך ההליך, פוטנציאל להשפיע על האפקטיביות של הזרקת הנגיף. בדוק את מינון ההרדמה הנכון על ידי צביטת הבוהן וודא שהעכברים אינם מגיבים.</li>
	<li>השתמש במכונת גילוח עכבר מיוחדת כדי לקצץ את השיער העליון של העכברים המורדמים.</li>
	<li>מרחו משחת עיניים על שתי העיניים כדי למנוע התייבשות, וקיבעו את העכברים על מכשיר סטריאוטקסי כדי לשתק את המוח. מכסים את החיה בשפריץ סטרילי.</li>
	<li>לעקר ביסודיות את העור של הראש והצוואר של העכברים עם שלושה סבבים של חיטוי יודופור ו 75% אלכוהול כדי להפחית את הזיהום לאחר הניתוח. לאחר מכן להחיל 1% לידוקאין מקומי על הקרקפת של עכברים ולעשות חתך קטן לחשוף באופן מלא את הגולגולת תחת מיקרוסקופ. הערה: השתמש במכשירים סטריליים לאורך כל ההליך.</li>
	<li>הכינו שני מזרקים של 10 μL: אחד עם AAV2/5-A 2A R-shRNA שנרכש (titer: 6.27 × 10 9 vg/μL) והשני עם AAV2/5-Scramble שנרכש (titer:6.21× 109 vg/μL). הערה: בעת השימוש במזרק, יש לחבר את הקצה הקדמי לנימי זכוכית, וניתן לקבל טווח של 10 μL על ידי שליטה באורך נימי הזכוכית.</li>
	<li>השתמש במיקרוסקופ כדי לאתר את הברגמה והלמדא וקבע את נקודת הקואורדינטות (AP: -0.58; מ"ל: ±1.10; DL: -2.20) על מזרק 10 μL (איור 1). נקודת הקואורדינטות מבוססת על האטלס הסטריאוטקסי של מוח העכבר15.</li>
	<li>קדח חור קטן בגולגולת בנקודת הקואורדינטות המותאמת. הערה: תחת המיקרוסקופ, הקידוח מתבצע באמצעות מיקרו-מקדח סטרילי כנגד פני הגולגולת. לאחר הקידוח, על ידי הסרת קרומי המוח המכסים את המוח וחשיפת פרנכימה במוח הבסיסית, נמנעת פגיעה בכלי הדם. שלב זה מונע את שבירת קצה נימי הזכוכית על ידי קרומי המוח. קוטר החור שנקדח צריך להיות מספיק כדי לאפשר לקצה המחט להיכנס לרקמת המוח.</li>
	<li>מתן 2 μL של נגיף AAV2/5-A2AR-shRNA לחדר המוח באמצעות הזרקה לרוחב בקצב קבוע של 100 nL/min. שמור את המחט במקום במשך 10 דקות לפני הנסיגה. יש לציין כי הנגיף ניתן בזריקה חד צדדית.</li>
	<li>אטמו את העור הפגוע באמצעות דבק ביופיברין רפואי באופן מיידי כדי למנוע אובדן וירוסים, אשר ניתן לשטוף עם CSF לאחר הסרת המחט אם הדבק אינו נמרח במהירות. כמו כן, אין להשתמש בצמר גפן כדי לנגב את CSF, כפי שהוא עלול גם לגרום לאובדן וירוסים.</li>
	<li>כדי להקל על ההתאוששות, הנח את העכבר על כרית חימום כדי לשמור על טמפרטורת הגוף ב 37.0 ± 0.5 מעלות צלזיוס, ומרח 1% לידוקאין מקומי על קרקפת העכבר. אפשרו לעכברים להתאושש במשך שבועיים לפני השראת מודל EAE, מכיוון שתקופה זו נחוצה לביטוי נגיף AAV2/5-A 2A R-shRNA ולאחר מכן להפלה של A2AR.</li>
</ol>3. הפלת ChP ספציפית של A2AR עם Cre/locus של מערכת X-overP1 (Cre/LoxP)
הערה: ניתן להשיג את ההליכים הבאים באמצעות השיטה שתוארה קודם לכן. עיין בשלבים 2.1-2.11 לקבלת שיטות הזרקה מפורטות.
<ol><li>הזריקו 2 μL של רקומבינאז CRE-TAT לכל חדר צדדי של עכבר Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato כקבוצת הניסוי ו-2 μL של מלח סטרילי חוצץ פוספט (PBS) כקבוצת הביקורת. באמצעות אותו פרוטוקול כמו לעיל (סעיף 2), הזריקו 2 μL של רקומבינאז CRE-TAT לכל אחד מהחדרים הצדיים של עכברי A2AR flox/flox יחד עם 2 μL של PBS סטרילי כקבוצת ביקורת.</li>
	<li>הכינו קטעי רקמות קפואות ובצעו צביעה גרעינית שבועיים לאחר הזרקת רקומבינאז CRE-TAT. עיין בשלבים 4.1-4.3 לקבלת מידע נוסף.</li>
</ol>4. זילוח קרום הלב בעכברים
<ol><li>לתת 60-80 מ"ג / ק"ג נתרן pentobarbital כדי להרדים עמוק את העכברים. אשר את מישור ההרדמה על ידי צביטת בוהן ובצע זילוח transcardial באמצעות 40 מ"ל של תמיסת PBS סטרילית ואחריה 20 מ"ל של 4% paraformaldehyde (PFA). הערה: זילוח מוצלח מסומן על ידי צבע לבן בכבד, בעוד נוכחות של ריאות מוגדלות או PBS החוצה מהפה במהלך זילוח מרמז על כישלון של ההליך.</li>
	<li>חלץ במהירות את מוח העכבר והבטיח פירוק חלבון מינימלי.</li>
	<li>השקיעו את מוח העכבר ב-4% PFA/PBS למשך הלילה לצורך קיבוע שלאחר הקיבוע, ולאחר מכן החליפו בתמיסת PB של 30% סוכרוז למשך 72 שעות. הערה: זה קריטי כדי למנוע התייבשות מוגזמת של רקמת המוח, כך המוח לא צריך להישאר בתמיסת PB סוכרוז במשך זמן רב מדי.</li>
</ol>5. חתך רקמות קפואות והכתמה
<ol><li>הטמע את מוח העכבר שהתייבש בעבר בדבק טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT), הקפיא את המוח המשובץ והשתמש במיקרוטום מחליק כדי לחתוך קטעי עטרה בעובי של 20 מיקרומטר.</li>
	<li>הניחו את חלקי המוח על מגלשת הזכוכית. ברגע שחלקי המוח יבשים, אחסנו אותם במקרר בטמפרטורה של -20°C לניסויים הבאים.</li>
	<li>הניחו כל שקופית זכוכית בתוך מארז מסגרת והטביעו את המסגרת במיכל מלא PBS כדי לשטוף היטב את המגלשה. שטפו בעדינות את מגלשות המוח בתמיסת PBS שלוש פעמים, במשך 10 דקות בכל פעם. הערה: יש לנקוט משנה זהירות כדי למנוע מחלקי המוח ליפול ממגלשת הזכוכית.</li>
	<li>הכתימו את המוח מחליק בתמיסת 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) למשך 10 דקות.</li>
	<li>שטפו את מגלשות המוח בתמיסת PBS במשך 5 דקות.</li>
	<li>יש למרוח טיפה אחת של מדיום הרכבה נגד דהייה על חלקי המוח.</li>
	<li>הניחו את הכיסוי על חלקי המוח, אטמו את הכיסוי בלק ונתחו את המקטעים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונבנציונלי.</li>
</ol>6. אינדוקציה EAE
הערה: בצע השראת EAE לאחר שבועיים של הזרקת shRNA או CRE-TAT רקומבינאז11.
<ol><li>צור תמיסה מימית על ידי ערבוב 2.5 מ"ג מיאלין אוליגודנדרוציטים גליקופרוטאין (MOG35-55) עם 2 מ"ל של PBS. הכינו תמיסת שמן אדג'ובנט שלמה של Freunds (CFA) על ידי ערבוב M . tuberculosis (H37Ra) עם אדג'ובנט Freunds לא שלם (IFA).</li>
	<li>מערבבים את תמיסות המים והשמן ביחס של 1:1. השתמשו בצינור טי כדי להקציף את התערובת למצב שמן במים. הערה: צינור הטי נקרא גם צינור תלת-כיווני. זהו צינור פלסטיק שיכול לשלוט בכיוון התמיסה הזורמת כדי לערבב באופן מלא את MOG35-55 ו- CFA.</li>
	<li>השתמש הומוגנייזר במהירות גבוהה כדי להפוך את תחליב האנטיגן MOG עבור מודל EAE בתנאי אמבט קרח.</li>
	<li>מרדימים את העכברים תוך צפקית עם 1% נתרן pentobarbital במינון של 6-8 מ"ל / ק"ג שווה ערך 60-80 מ"ג / ק"ג pentobarbital.</li>
	<li>הזריקו תת עורית את תחליב האנטיגן MOG לארבע נקודות שונות (צוואר, גב, ירכיים שמאליות וימניות) בנפח של 10 מ"ל/ק"ג ובסך הכל ארבע זריקות כל אחת. הערה: חשוב לבחור בקפידה את אתר ההזרקה, שכן לאתרים שונים עשויות להיות השפעות שונות על התחלואה והתמותה של עכברים. בנוסף, זריקות MOG חוזרות ונשנות יכולות להוביל לסבילות חיסונית, ולכן צוות המחקר בחר שיטת הזרקה אחת כדי למנוע בעיה פוטנציאלית זו.</li>
	<li>יש להזריק מיד 500 נ"ג/מ"ל של רעלן שעלת (PT) תוך צפקי במינון של 5 מ"ג/ק"ג לאחר הזרקת MOG. הערה: PT מגביר את החדירות של מחסום הדם-מוח (BBB) ומקל על חדירת תאי T למוח.</li>
	<li>לאחר 48 שעות, תוך פריטוניאלי להזריק את תמיסת PT באותו נפח.</li>
</ol>7. ציון גירעון נוירולוגי
<ol><li>הערך ודרג את העכברים מדי יום באמצעות סולם דירוג 16 הנע בין 0 ל -15 כדי להעריך את ההיארעות והחומרה של EAE על פי הליקויים הנוירולוגיים הבאים: זנב: 0 מציין שאין סימנים, 1 מציין זנב משותק למחצה ו-2 מציין זנב משותק לחלוטין. גפיים: 0 מציין שאין סימנים, 1 מייצג הליכה חלשה או שונה, 2 מציין פרזיס, ו-3 מייצג איבר משותק לחלוטין.</li>
	<li>הקצו לבעל חיים מרובע בעל שיתוק מלא ציון 12, והקצו לתמותה ציון 15.</li>
</ol>8. צביעת Hematoxylin-eosin (H&E)
<ol><li>קח את מוח העכבר המיובש והטמע אותו בפרפין מותך. תנו לגוש הפרפין להתקרר ולהתגבש לשימוש מאוחר יותר. הערה: בלוק הפרפין צריך להיות יבש לחלוטין וקריר כדי למנוע נזק לרקמות.</li>
	<li>חתכו את גוש הפרפין במוח העכבר לשקופיות בעובי 5 מיקרומטר. מניחים את אזור המוח של עכבר הפרפין על מגלשת זכוכית ומייבשים אותו בתנור של 60 מעלות צלזיוס למשך 3 שעות.</li>
	<li>יש לטבול את המגלשות ברצף בתמיסת קסילן I למשך 10 דקות, תמיסת קסילן II למשך 10 דקות, 100% אלכוהול I למשך 3 דקות, 100% אלכוהול II למשך 3 דקות, 95% אלכוהול למשך 3 דקות, 90% אלכוהול למשך 3 דקות, 80% אלכוהול למשך 3 דקות, 70% אלכוהול למשך 3 דקות ומים מזוקקים למשך דקה.</li>
</ol>9. ניתוח תגובת שרשרת פולימראז כמותי (qPCR)
<ol><li>לאחר ערבוב העכברים עם PBS, להסיר את ChP מן החדרים לחלץ RNA עם Trizol. סנתז את ה- cDNA באמצעות ערכת סינתזת cDNA הראשונה של גדיל.</li>
	<li>בצע ניתוח qPCR באמצעות Premix Ex Taq SYBR-green ומערכת PCR בזמן אמת. השתמש בפריימרים הבאים של A2AR: קדימה - GCCATCCCATTCGCCATCA; הפוך - GCAATAGCCAAGAGGCTGAAGA.</li>
</ol>

השתקת גנים סלקטיבית במקלעת הכורואיד

<ol><li>Damkier, H. H., Brown, P. D., Praetorius, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebrospinal+fluid+secretion+by+the+choroid+plexus%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Cerebrospinal fluid secretion by the choroid plexus.</a> Physiological Reviews. 93 (4), 1847-1892 (2013).</li>
<li>Lun, M. P., Monuki, E. S., Lehtinen, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+functions+of+the+choroid+plexus-cerebrospinal+fluid+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Development and functions of the choroid plexus-cerebrospinal fluid system.</a> Nature Reviews: Neuroscience. 16 (8), 445-457 (2015).</li>
<li>Wolburg, H., Paulus, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choroid+plexus%3A+biology+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Choroid plexus: biology and pathology.</a> Acta Neuropathologica. 119 (1), 75-88 (2010).</li>
<li>Solar, P., Zamani, A., Kubickova, L., Dubovy, P., Joukal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choroid+plexus+and+the+blood-cerebrospinal+fluid+barrier+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+Barriers+CNS%22%5BJournal%5D)">Choroid plexus and the blood-cerebrospinal fluid barrier in disease.</a> Fluids Barriers CNS. 17 (1), 35(2020).</li>
<li>Marques, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+choroid+plexus+in+health+and+in+disease%3A+dialogues+into+and+out+of+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">The choroid plexus in health and in disease: dialogues into and out of the brain.</a> Neurobiology of Disease. 107, 32-40 (2017).</li>
<li>Myung, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+choroid+plexus+is+an+important+circadian+clock+component%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The choroid plexus is an important circadian clock component.</a> Nature Communications. 9 (1), 1062(2018).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transgenic+FOXJ1-Cre+system+for+gene+inactivation+in+ciliated+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A transgenic FOXJ1-Cre system for gene inactivation in ciliated epithelial cells.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 36 (5), 515-519 (2007).</li>
<li>Johansson, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+Otx2+regulates+choroid+plexus+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The transcription factor Otx2 regulates choroid plexus development and function.</a> Development. 140 (5), 1055-1066 (2013).</li>
<li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choroid+plexus+NKCC1+mediates+cerebrospinal+fluid+clearance+during+mouse+early+postnatal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Choroid plexus NKCC1 mediates cerebrospinal fluid clearance during mouse early postnatal development.</a> Nature Communications. 12 (1), 447(2021).</li>
<li>Spatazza, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choroid-plexus-derived+Otx2+homeoprotein+constrains+adult+cortical+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Choroid-plexus-derived Otx2 homeoprotein constrains adult cortical plasticity.</a> Cell Reports. 3 (6), 1815-1823 (2013).</li>
<li>Zheng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choroid+plexus-selective+inactivation+of+adenosine+A2A+receptors+protects+against+T+cell+infiltration+and+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Choroid plexus-selective inactivation of adenosine A2A receptors protects against T cell infiltration and experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Journal of Neuroinflammation. 19 (1), 52(2022).</li>
<li>Steffensen, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cotransporter-mediated+water+transport+underlying+cerebrospinal+fluid+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Cotransporter-mediated water transport underlying cerebrospinal fluid formation.</a> Nature Communications. 9 (1), 2167(2018).</li>
<li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Klotho+controls+the+brain-immune+system+interface+in+the+choroid+plexus%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Klotho controls the brain-immune system interface in the choroid plexus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (48), E11388-E11396 (2018).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+serotypes+of+adeno-associated+virus+vector-+and+lentivirus-mediated+tropism+in+choroid+plexus+by+intracerebroventricular+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Different serotypes of adeno-associated virus vector- and lentivirus-mediated tropism in choroid plexus by intracerebroventricular delivery.</a> Human Gene Therapy. 31 (7-8), 440-447 (2020).</li>
<li>Konsman, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+brain+in+stereotaxic+coordinates%5BTitle%5D)+AND+%22Psychoneuroendocrinology%22%5BJournal%5D)">The mouse brain in stereotaxic coordinates.</a> Psychoneuroendocrinology. 6 (28), 827-828 (2003).</li>
<li>Weaver, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+elevated+matrix+metalloproteinase+%28MMP%29+in+an+animal+model+of+multiple+sclerosis+is+protective+by+affecting+Th1%2FTh2+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">An elevated matrix metalloproteinase (MMP) in an animal model of multiple sclerosis is protective by affecting Th1/Th2 polarization.</a> FASEB J. 19 (12), 1668-1670 (2005).</li>
<li>Kertser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corticosteroid+signaling+at+the+brain-immune+interface+impedes+coping+with+severe+psychological+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Corticosteroid signaling at the brain-immune interface impedes coping with severe psychological stress.</a> Science Advances. 5 (5), 4111(2019).</li>
<li>Kaiser, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MEIS-WNT5A+axis+regulates+development+of+fourth+ventricle+choroid+plexus%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">MEIS-WNT5A axis regulates development of fourth ventricle choroid plexus.</a> Development. 148 (10), (2021).</li>
<li>Compston, A., Coles, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Multiple sclerosis.</a> Lancet. 372 (9648), 1502-1517 (2008).</li>
<li>Reboldi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-C+chemokine+receptor+6-regulated+entry+of+TH-17+cells+into+the+CNS+through+the+choroid+plexus+is+required+for+the+initiation+of+EAE%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">C-C chemokine receptor 6-regulated entry of TH-17 cells into the CNS through the choroid plexus is required for the initiation of EAE.</a> Nature Immunology. 10 (5), 514-523 (2009).</li>
<li>Jovanova-Nesic, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choroid+plexus+connexin+43+expression+and+gap+junction+flexibility+are+associated+with+clinical+features+of+acute+EAE%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Choroid plexus connexin 43 expression and gap junction flexibility are associated with clinical features of acute EAE.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1173, 75-82 (2009).</li>
<li>Jovanova-Nesic, K., Jovicic, S., Sovilj, M., Spector, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+brain+stimulation+upregulates+adhesion+and+prevents+Eae%3A+MMP-2%2C+ICAM-1%2C+and+VCAM-1+in+the+choroid+plexus+as+a+target%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Magnetic brain stimulation upregulates adhesion and prevents Eae: MMP-2, ICAM-1, and VCAM-1 in the choroid plexus as a target.</a> International Journal of Neuroscience. 119 (9), 1399-1418 (2009).</li>
<li>Mills, J. H., Alabanza, L. M., Mahamed, D. A., Bynoe, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+adenosine+signaling+induces+CX3CL1+expression+in+the+brain+to+promote+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Extracellular adenosine signaling induces CX3CL1 expression in the brain to promote experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Journal of Neuroinflammation. 9, 193(2012).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים או גילויים אחרים להצהיר.

המחקר הציג שתי גישות שונות להפלה ממוקדת של גנים ChP. הגישה הראשונה כללה הזרקת ICV של CRE-TAT, המכיל Cre recombinase, לעכברי A2AR flox/flox. הגישה השנייה כללה הזרקת ICV של AAV2/5 הנושא shRNA של A2AR. על ידי שימוש בשתי אסטרטגיות אלה, העבודה השיגה את ההפלה הסלקטיבית של A 2A R בתוך ChP והצליחה להדגים את ההשפעות המגינות של עיכוב איתות A2AR ב- ChP על פתולוגיה של EAE. יש לציין כי פרוטוקול זה כולל שני שלבים מכריעים. ראשית, פעולת הלוקליזציה הסטריאוטקסית היא חיונית, וסטייה משמ...

מקלעת הכורואיד (ChP) נחשבה לעתים קרובות כמסייעת בשמירה על הומאוסטזיס תפקודי במוח על ידי הפרשת נוזל מוחי שדרתי (CSF) וגורם נוירוטרופי מוחי (BDNF)1,2. מחקר הולך וגובר בשלושת העשורים האחרונים גילה כי ChP מייצג מסלול ברור לחדירת תאי מערכת החיסון למערכת העצבים המרכזית (CNS).
הצמתים הצפופים (TJs) של ChP, המורכבים מאפיתל ChP חד-שכבתי, שומרים על הומאוסטזיס חיסוני על ידי מניעת כניסת מקרומולקולות ותאי חיסון למוח3. עם זאת, בתנאים פתולוגיים מסוימים, רקמת ChP מזהה ומגיבה לדפוסים מולקולריים הקשורים לסכנה (DAMPs) ב- CSF ובדם, מה שמוביל לחדירה חיסונית חריגה ולתפקוד לקוי של המוח 4,5. למרות תפקידו הקריטי, גודלו הקטן של ה-ChP ומיקומו הייחודי במוח מקשים על חקר תפקודו מבלי להשפיע על אזורי מוח אחרים. לכן, מניפולציה של ביטוי גנים במיוחד ב- ChP היא גישה אידיאלית להבנת תפקידו.
בתחילה, קווים טרנסגניים של אנזים רקומבינציה מחזורית (Cre), המבטאים Cre תחת שליטתם של מקדמים ספציפיים לגנים המבוטאים ב- ChP, שימשו בדרך כלל למחיקת גני מטרה על ידי רבייה עם גנים מועמדים floxed 6,7,8. לדוגמה, גורם השעתוק תיבת Forkhead J1 (FoxJ1) מתבטא באופן בלעדי באפיתל ChP של מוח העכבר לפני הלידה7. לפיכך, קו FoxJ1-Cre שימש לעתים קרובות למחיקת גנים הממוקמים ChP 6,9. עם זאת, ההצלחה של אסטרטגיה זו מסתמכת במידה רבה על הספציפיות של המקדם. בהדרגה התגלה כי דפוס הביטוי של FoxJ1 אינו ייחודי מספיק, שכן FoxJ1 היה נוכח גם בתאי אפיתל ריסניים בחלקים אחרים של המוח והמערכת ההיקפית7. כדי להתגבר על מגבלה זו, בוצעה הזרקה תוך-מוחית (ICV) של Cre recombinase כדי להעביר רקומבינאז לחדרים של קווים טרנסגניים פלוקסים. אסטרטגיה זו הראתה ספציפיות גבוהה, כפי שמעידה נוכחות של פלואורסצנטיות tdTomato אך ורק ברקמת ChP10,11. עם זאת, שיטה זו עדיין מוגבלת על ידי הזמינות של קווי עכבר טרנסגניים floxed. כדי לטפל בבעיה זו, חוקרים השתמשו בהזרקת ICV של וירוס הקשור לאדנו (AAV) כדי להשיג הפלה ספציפית ל- ChP או ביטוי יתר של גני מטרה12,13. הערכה מקיפה של סרוטיפים שונים של AAV עבור זיהום ChP גילתה כי AAV2/5 ו- AAV2/8 מפגינים יכולות זיהום חזקות ב- ChP, בעוד שאינם מדביקים אזורי מוח אחרים. עם זאת, AAV2/8 נמצא כמדביק את האפנדימה סביב החדרים, בעוד שקבוצת AAV2/5 לא הראתה זיהום14. שיטה זו יש את היתרון של התגברות על המגבלות של רכישת בעלי חיים טרנסגניים floxed.
מאמר זה מתאר פרוטוקול שלב אחר שלב להפלה גנטית ב- ChP באמצעות שתי שיטות: ICV של AAV2/5 הנושא shRNA של קולטן אדנוזין A 2A (A 2A R) וחלבון Cre recombinase המורכב מרקומבינאז רצף TAT (CRE-TAT) כדי להשיג הפלה ספציפית ל- ChP של A2A R. ממצאי המחקר מצביעים על כך שהפלת A2AR ב- ChP יכולה להקל על אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית (EAE). פרוטוקול מפורט זה מספק הדרכה שימושית למחקרי תפקוד ChP ולפירוק הספציפי של גנים ב- ChP.

<table><tbody><tr><td>A2ARflox/flox עכברים</td><td>מעבדת מפתח המדינה לרפואת עיניים, אופטומטריה ומדעי הראייה, האוניברסיטה</td><td></td><td></td>הרפואית וונג'ואו</tr><tr><td>AAV2/5-A2AR-ShRNA וירוס</td><td>שנחאי Heyuan ביוטכנולוגיה ושות' בע"מ</td><td>pt-4828</td><td></td></tr><tr><td>antifade הרכבה בינונית</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>נימי זכוכית בורוסיליקט</td><td>בייג'ינג Meiyaxian טכנולוגיה ושות' בע"מ</td><td>B100-50-10</td><td></td></tr><tr><td>מכשיר סטריאוטקסי מוח</td><td>RWD, שנזן</td><td>69100</td><td></td></tr><tr><td>C57BL / 6 עכברים</td><td>בייג'ינג ויטל נהר צ'ארלס מעבדה בעלי חיים טכנולוגיה חברה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CRE-TAT רקומבינאז</td><td>Millipore</td><td>SCR508</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>אבסין</td><td>B25A031</td><td></td></tr><tr><td>מכונת חיתוך קפואה</td><td>Leica</td><td>CM1950</td><td></td></tr><tr><td>H37Ra</td><td>Becton Dickinson וחברה</td><td>231141</td><td></td></tr><tr><td>מזרק המילטון</td><td>המילטון,</td><td>אמריקאי P/N:&nbsp; 86259</td><td></td></tr><tr><td>לא שלם Freunds adjuvant</td><td>Sigma</td><td>F5506</td><td></td></tr><tr><td>לייזר קונפוקלי מיקרוסקופ</td><td>Zeiss</td><td>LSM900</td><td></td></tr><tr><td>MOG35-55</td><td>Suzhou Qiangyao ביוטכנולוגיה ושות', בע"מ</td><td>4010006243</td><td></td></tr><tr><td>OCT דבק</td><td>Epredia</td><td>6502p</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldehyde</td><td>צ'נגדו קלונג כימי ריאגנט חברה</td><td>30525-89-4</td><td></td></tr><tr><td>פנטוברביטל נתרן</td><td>Boyun Biotech</td><td>PC13003</td><td></td></tr><tr><td>אקדח פיפטה</td><td>Eppendorf</td><td>N45014F</td><td></td></tr><tr><td>PrimeScript ערכת סינתזה cDNA גדיל 1</td><td>Takara</td><td>&nbsp; 6110A</td><td></td></tr><tr><td>מערכת PCR בזמן אמת</td><td>BioRad</td><td>CFX96</td><td></td></tr><tr><td>Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdעכברי עגבניות</td><td>סוכרוז מעבדת</td><td></td><td></td>ג'קסון</tr><tr><td></td><td>סנגון ביוטק</td><td>A502792-0500</td><td></td></tr><tr><td>הומוגנייזר סופר מהיר</td><td>IKA</td><td>3737025</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת</td> <td>קסילןחברת ריאגנטים כימיים צ'נגדו קלונג</td><td>1330-20-7</td><td></td></tr></tbody></table>

הפלה ממוקדת של גנים במקלעת הכורואיד

Targeted Knockdown of Genes in the Choroid Plexus

מקלעת הכורואיד (ChP) משמשת שער קריטי לחדירת תאי מערכת החיסון למערכת העצבים המרכזית (CNS) בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים כאחד. מחקרים אחרונים הראו כי ויסות פעילות ChP עשוי להציע הגנה מפני הפרעות במערכת העצבים המרכזית. עם זאת, חקר התפקוד הביולוגי של ChP מבלי להשפיע על אזורי מוח אחרים הוא מאתגר בשל המבנה העדין שלו. מחקר זה מציג שיטה חדשנית להפלה גנטית ברקמת ChP באמצעות וירוסים הקשורים לאדנו (AAVs) או חלבון רקומבינאז רקומבינאז (Cyclization recombination enzyme (Cre) המורכב מרצף TAT (CRE-TAT). התוצאות מראות כי לאחר הזרקת AAV או CRE-TAT לחדר הצידי, הפלואורסצנטיות התרכזה באופן בלעדי ב- ChP. באמצעות גישה זו, המחקר הפיל בהצלחה את קולטן אדנוזין A 2A (A2A R) ב- ChP באמצעות הפרעותRNA (RNAi) או Cre/locus של מערכות X-overP1 (Cre/LoxP), והראה כי הפלה זו יכולה להקל על הפתולוגיה של אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית (EAE). טכניקה זו עשויה להיות השלכות חשובות על מחקר עתידי על תפקיד ChP בהפרעות CNS.

ChP-specific A2AR knockdown על ידי הזרקת ICV של AAV2/5-shRNA או CRE-TAT תפקידו של A2AR ב- ChP כמווסת רב עוצמה של מידע עצבי בפתוגנזה של EAE נותר לא ברור. הפלת ביטוי A 2A R ספציפי ל-ChP יכולה לשפוך אור על ההשפעות הרגולטוריות של A2AR על מערכת החיסון המרכזית ב-EAE ודלקות אחרות במערכת העצבים. מחקר זה השתמש בהזרקת ICV של CRE-TAT כדי להפחית ביטוי A 2A R ב- ChP של עכברי A2AR flox/flox. כדי להבטיח את הספציפיות של ChP, הזרקנו תחילה CRE...

במאמר זה אנו מתארים שיטה לשינוי סלקטיבי של ביטויי גנים במקלעת הכורואידים, תוך הימנעות מכל השפעה באזורים אחרים במוח.

The choroid plexus (ChP) serves as a critical gateway for immune cell infiltration into the central nervous system (CNS) under both physiological and ...

מטרת מחקר זה היא לחקור את הטכניקות למניפולציה של ביטוי גנים במקלעת הכורואידים. המחקר שלנו הציג את שתי השיטות המאפשרות טכניקה אך ורק במקלעת הכורואיד ללא כל השפעה ניכרת על אזורים אחרים. הממצאים שלנו עשויים לשפר מחקרי תפקוד עתידיים של מקלעת הכורואיד במדעי המוח.המחקר שלנו סקר כי עיכוב חדירת תאי T דרך מקלעת הכורואיד באמצעות נעילה סלקטיבית של אדנוזין לקולטן מספיק כדי להגן על עכברים מפני פתולוגיה של EAE. ממצא זה תומך ברעיון כי גילוי פעילות השער במקלעת הכורואיד יכול להציג אסטרטגיה חדשה ומבטיחה לטיפול בטרשת נפוצה. מחקר זה מציג שתי שיטות חלופיות למניפולציה של ביטוי גנים במקלעת הכורואידים.הזרקת ICV של Cre recombinase לעכברים טרנסגניים אלה או הזרקת ICV של AAV2/5, או שזה SHI ממוקד בעכברי WT. שיטות אלה מתגברות על בעיות בקידום ספציפיות וגידול עכברים טרנסגנטי.

targeted-knockdown-of-genes-in-the-choroid-plexus

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

שיטה א 'תנאי מציאה ביטוי חלבון המטרה ברשתית דג הזברה מבוגר מתואר, הכוללת הזרקת intravitreally morpholinos antisense ו electroporating אותם לתוך הרשתית. החלבון המתקבל הוא הפיל במשך כמה ימים, אשר מאפשר בדיקת תפקידו של החלבון או התחדשות הרשתית ללא פגע.

ב electroporation vivo של Morpholinos לתוך הרשתית דג הזברה למבוגרים

בסרטון זה, אנו מדגימים שיטה לביצוע התמרה של וקטורים לנטי-ויראליים של shRNA כדי להשיג קווי תאים יציבים בתאי גזע ותאי אב המטופויטיים אימורטליים (iHSPCs).

הפלה גנטית בתיווך RNA קצר ב- iHSPCs In Vitro: מערכת ביטוי shRNA מבוססת לנטיוירוס העוברת ל- iHSPCs להפלה של ביטוי גנים ספציפי

אנחנו מדגימים את טכניקה פולשנית המכונית electroporation האזור subventricular ילוד. הטכניקה מורכבת של הזרקת DNA פלסמיד לתוך חדרי לב לרוחב של גורים ילודים ויישום זרם חשמלי כדי לספק ולתפעל גנטיים תאי גזע...

Electroporation האזור Subventricular ילודים

במאמר זה, אנו מדגימים שיטה למניפולציה של ביטוי גנים בתאי חדריות של telencephalon דג הזברה המבוגר באמצעות oligonucleotides morpholino antisense. אנו מציגים שיטה זו כפרוטוקול יעיל ומהיר שיכול לשמש למחקרים תפקודיים במוח החולייתנים המבוגר.

מיקרומניפולציה של ביטוי גנים במוח דג הזברה למבוגר באמצעות Microinjection Cerebroventricular של oligonucleotides morpholino

שורות תאי כתב להציע אמצעים כדי להמחיש, לעקוב ובודד תאים של ריבית מאוכלוסיות הטרוגניות. עם זאת, באמצעות רקומבינציה הומולוגית קונבנציונלית בתאי גזע עובריים אנושיים מיקוד הגן הוא מאוד לא יעיל. בזאת, אנו מתארים מיקוד מוקד PITX3 CNS המוח התיכון ספציפי גורם שעתוק עם EGFP באמצעות רקומבינציה הומולוגית המשופרת nuclease אבץ האצבע.

ג&#39;ין משופר Nuclease אבץ אצבע מיקוד בתאי גזע עוברי האנושי

Periventricular קשרי הטרוטופיה (PNH) היא הצורה הנפוצה ביותר של מום ההתפתחות בקליפת המוח (MCD) בבגרות אבל את הבסיס הגנטי שלה אינו ידוע במקרים ספורדיים ביותר. לאחרונה פיתחנו אסטרטגיה לזיהוי גנים מועמדים חדשניים עבור MCDs וכדי לאשר ישירות שלהם תפקיד סיבתי בתוך vivo.

אסטרטגיה רומן המשלב מערך-CGH, רצף שלם-exome and בתוך הרחם אלקטרופורציה בחולדות לזיהוי גנים סיבתי של מומים המוח

פרוטוקול זה מספק זרימת עבודה על כיצד לשלב מלאכותי בתיווך microRNA RNA הפרעה optogenetics לעורר במיוחד presynaptic עם העיתון ons עם ביטוי מופחתת של gene (s) סלקטיבי בתוך מעגלים עצביים ללא פגע.

שילוב Optogenetics עם מיקרו Rna מלאכותי כדי לאפיין תופעות נוקאאוט גנטי על פונקציה Presynaptic בתוך מעגלים עצביים ללא פגע

במחקר הנוכחי, הביטוי מופל משני מרכיבי איתות במורד הזרם של מסלול PERK, הקלצינוירין הציטופרוטקטיבי וה- CHOP הפרו-אפופטוטי, באמצעות shRNA ספציפי. בדרכים הפוכות, אלה מווסתים את הרגישות של נוירונים קליפת המוח הראשוניים לניוון עצבי לאחר השראת מתח רשתית אנדופלסמית.

אפנון מולקולרי על ידי shRNA ספציפי המועבר על ידי לנטיוירוס בנוירונים סטרס ברשתית האנדופלסמית

פיתחנו גישה חדשנית של אובדן תפקוד הכוללת החדרה ואינטגרציה גנומית של רצפי מיקרו-רנ"א מלאכותיים לעוברי אפרוחים באמצעות אלקטרופורציה ומערכת טרנספוזון Tol2. טכניקה זו מספקת מתודולוגיית פירוק גנים חזקה ויציבה לחקר תפקוד גנים במהלך ההתפתחות.

גישת אובדן תפקוד ברשתית הגוזל העוברי באמצעות ביטוי טרנסגני בתיווך Tol2 של מיקרו-רנ"א מלאכותי

אלקטרופורציה של אורגנואידים מוחיים של פרימטים מספקת גישה מדויקת ויעילה להחדרת שינויים גנטיים חולפים לסוגי אבות ונוירונים שונים במערכת מודל הקרובה להתפתחות ניאו-קורטקס פיזיולוגי של פרימטים (פתו). זה מאפשר את המחקר של תהליכים נוירו-התפתחותיים ואבולוציוניים והוא יכול להיות מיושם גם עבור מודלים המחלה.

מיקרו-הזרקה ממוקדת ואלקטרופורציה של אורגנואידים מוחיים פרימטים לשינוי גנטי

כאן, אנו מציגים את המניפולציה הגנטית החריפה של אורגנואידים קורטיקליים אנושיים חתוכים על ידי אלקטרופורציה. מודלים אלה של אורגנואידים בקליפת המוח נוחים במיוחד להזרקה מכיוון שניתן לזהות בקלות מבנים דמויי חדרים לאחר החיתוך, מה שמאפשר חקירה תפקודית של התפתחות קליפת המוח האנושית, הפרעות נוירו-התפתחותיות ואבולוציה קליפת המוח.

אלקטרופורציה של אורגנואידים קורטיקליים אנושיים פרוסים לחקר תפקוד גנים

חקור שיטות להפלה ממוקדת של ביטוי גנים במקלעת הכורואיד באמצעות זריקות ICV ו-Cre recombinase בעכברים. גילויים אלה מציעים אסטרטגיה טיפולית חדשה לטיפול בטרשת נפוצה.

הפלה ממוקדת של גנים במקלעת הכורואיד

גלה סרטונים נוספים