הערכת ציטוטוקסיות מהירה במבחנה של קולטן אנטיגן כימרי Jurkat באמצעות הדמיה פלואורסצנטית
27 באוקטובר 2023
פרוטוקול להערכת הרג כמותי של תאי גידול על ידי תאי Jurkat המבטאים קולטן אנטיגן כימרי (CAR) המכוון לאנטיגן גידול יחיד. פרוטוקול זה יכול לשמש כפלטפורמת סינון לאופטימיזציה מהירה של מבני צירי CAR לפני אישור בתאי T היקפיים שמקורם בדם.
תאי CAR T משתפרים ללא הרף כדי להשיג תגובות טובות יותר בניסויים קליניים בבני אדם. אנו מזהים דרכים להעריך זאת במעבדה שלנו באמצעות שיטת תפוקה גבוהה בלתי משוחדת, כגון שימוש בהדמיה פלואורסצנטית כדי לסנן שילובים הפועלים בצורה הטובה ביותר. ישנם מספר שילובים של מבנים שניתן לתכנן עבור כל מקטע משתנה שרשרת יחיד על ידי שינוי הגיאומטריה של תחום החוץ תאי והציר.
תכננו פרוטוקול זה כדי לזהות את השילובים עם היעילות הטובה ביותר בחיסול תאי מטרה באמצעות תאי Jurkat. זהו פרוטוקול מהיר בתפוקה גבוהה לסינון מבני CAR המבוססים על ציטוטוקסיות תאי היעד שלו באמצעות תאי Jurkat, אשר מאומתים לאחר מכן עם תאי T קונבנציונליים. ניתן לבדוק תריסר מבני CAR שונים בלוח 96 בארות בו זמנית באמצעות טכניקה זו.
כאן במעבדת אקהואן, אנו מכמתים במספרים מוחלטים את הציקלוזיס הישיר של תאי המטרה על ידי CAR המבטא תאי Jurkat באופן תפוקה גבוהה כדי לסנן מבני CAR מרובים. המטרה העיקרית של המעבדה שלנו היא לשפר את התרגום הקליני של טיפול CAR T-cell נגד גידולי מוח בדרגה גבוהה. אנו ממנפים מסכי תרופות בתפוקה גבוהה כשיטה אחת לשיפור ציטוטוקסיות תאי T של CAR, כמו גם התמקדות במיקרו-סביבה של הגידול.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מפרט שיטה בעלת תפוקה גבוהה להערכת הציטוטוקסיות של תאי Jurkat המבטאים CAR כנגד תאי גידול. הוא מאפשר סריקה מהירה של מבני CAR שונים כדי לזהות את השילובים היעילים ביותר לטרגט של אנטיגנים ספציפיים של גידולים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- אימונולוגיה
- ביולוגיה של הסרטן
- תרפיה תאית
רקע
- תאי CAR T עוברים שכלול לשיפור התוצאות הקליניות.
- שיטות סריקה בעתקת נתונים גבוהה (High-throughput screening) הן חיוניות לאופטימיזציה של מבני CAR.
- תאי Jurkat משמשים כמודל להערכת יעילות ה-CAR.
- מחקר זה מתמקד בציטוטוקסיות של מבני CAR כנגד תאי מטרה.
מטרת המחקר
- פיתוח פרוטוקול לסריקה יעילה של מבני CAR.
- כימות ההשפעות הציטוטוקסיות של תאי Jurkat המבטאים CAR.
- זיהוי תצורות CAR אופטימליות לסימון אנטיגנים גידוליים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- דימוי פלואורסצנטי לסריקה בתוספת גבוהה (high-throughput screening).
- הערכה של מבני CAR מרובים בפורמט של פלטת 96 בארות.
- כימות של הרג תאי מטרה על ידי תאי Jurkat המבטאים CAR.
- השוואה לתגובות T cell קונבנציונליות לצורך תיקוף.
תוצאים עיקריים
- זיהוי מבני CAR יעילים להריגת תאי גידול.
- הדגמת יכולות סריקה בתפוקה גבוהה (high-throughput) באמצעות תאי Jurkat.
- הערכה כמותית של ציטוטוקסיות במבנים שונים.
- פוטנציאל לאופטימיזציה מהירה של עיצובי CAR לפני יישום קליני.
מסקנות
- הפרוטוקול מאפשר סריקה יעילה של מבני CAR.
- תאי Jurkat מספקים מודל מהימן להערכת יעילות ה-CAR.
- גישה זו עשויה להאיץ את הפיתוח של טיפולים בתאי CAR T.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הערכה מהירה ובספיקה גבוהה של ציטוטוקסיות עבור מבני CAR בתאי Jurkat מאפשרת הפחתת סיכונים בשלב מוקדם ותיעדוף של עיצובי CAR לפני תיקוף של תאי T ראשוניים, התהליך הדורש משאבים רבים. פלטפורמה זו מאיצה את הזיהוי של מבני CAR שעברו אופטימיזציה של ה-hinge עם יכולת הריגה עדיפה של תאי מטרה, ובכך תומכת במיון יעיל של פורטפוליו בקווי פיתוח של טיפולים תאיים באונקולוגיה. באמצעות כימות הציטוטוקסיות של מספר מבנים במקביל, צוויות יכולים לקבל החלטות מבוססות נתונים בנקודות מפנה קריטיות בתהליך הגילוי.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בדיקה מהירה של פרמוטציות של מבני CAR לצורך תיקוף פונקציונלי של המטרה.
- תומך בהפחתת סיכונים מנגנונית על ידי כימות ציטוטוקסיות ישירה במערכת מבוקרת.
- מסייע בביטחון חיזוי בבחירת המבנה לפני הנדסת T cells ראשונית.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- מכין מערכות CAR-Jurkat שעברו תיקוף עבור תהליכי סינון בקיבולת גבוהה (high-throughput screening) בהמשך השלב.
- מבצע סטנדרטיזציה של בדיקות ציטוטוקסיות באמצעות פלטי דימוי פלואורסצנטי כמותי.
- מאפשר הערכה הדירה, ניתנת לשחזור וניתנת להרחבה של מספר מבני CAR במקביל.
- תומך בהערכה אמינה של תרכובות או מבנים בפורמט של פלטת 96 בארות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מסנכרן נתונים מוקדמים של ציטוטוקסיות עם יעדים תרגומיים על ידי אישור הממצאים בתאי T המופקים מ-PBMC.
- מספק רצף משלב אופטימיזציית התוֹצֵר (construct) בשלב הגילוי ועד לשלבי התיקוף הפרה-קליניים.
- מפחית את הסיכון לנשירה בשלבים מאוחרים באמצעות סינון מוקדם של תכנוני CAR שאינם אופטימליים.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
פלטפורמה זו לבדיקת ציטוטוקסיות בתפוקה גבוהה משתלבת בממשק שבין השלבים המוקדמים של הגילוי לזיהוי מובילים (lead identification), ומגשרת בין תכנון הקונסטרוקט לוולידציה פרה-קלינית. היא מאפשרת בדיקה מהירה של היפותזות ומיון של קונסטרוקטים לפני המעבר למחקרים ראשוניים בתאי T או למחקרים in vivo, הדורשים משאבים רבים.
- ביולוגיה של תגליות: תומך בהערכה מונחית-השערה של שינויים במבנה הציר (hinge) ובדומיין החוץ-תאי לטובת יעילות ה-CAR.
- סריקה: מספק נתונים כמותיים וניתנים לשחזור של ציטוטוקסיות לצורך השוואה ודירוג של מבנים (constructs).
- אנליטיקה: מספק ספירות תאים מוחלטות ופלט סטטיסטי (למשל, one-way ANOVA) לצורך קבלת החלטות.
- מחקר תרגומי: מאשש את ביצועי המבנה בתאי T המופקים מ-PBMC, ובכך תומך ברציפות התרגומית.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה ניתנת להרחבה ולשימוש חוזר עבור קמפיינים מתמשכים של אופטימיזציה של מבני CAR.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בבחירת מבנה CAR.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה והרחבה של הערכת ציטוטוקסיות, מה שמאפשר הקצאה יעילה של משאבים.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת החלטות go/no-go ואת יעילות ההון על ידי סינון מבנים בשלב מוקדם.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכון ובקידום של מועמדי CAR.
שיקולים ליישום
- נדרשת מומחיות בתכנון מבני CAR ובהעברה לנטיוויראלית של תאי Jurkat.
- נדרשת גישה למכשור דימוי פלואורסצנטי ולתוכנה אנליטית לקבלת קריאות כמותיות.
- נדרש סטנדרטיזציה בין-צוותית של הגדרות הבדיקה ופרמטרי ניתוח הנתונים.
- התאמה למודלים תאיים אחרים או לאנטיגנים אחרים עשויה לדרוש אופטימיזציה של הפרוטוקול.
- תלוי בניתוח סטטיסטי חסון (למשל, ANOVA) לצורך השוואת המבנים.
שאלות נפוצות בביו-פארמה
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:42
Plating CFSE‐Labelled Tumor Cells and Co‐Culturing CAR‐Expressing Jurkats for In Vitro Cytotoxicity Evaluation
5:19
Preparation of Plate for Fluorescent Imaging and Cell Viability Assessment in CAR‐Jurkat Co‐Culture with CFSE‐Labeled Tumor Cells
![הדמיה דינמית של תאי T קולטן אנטיגן כימרי עם [18F]טטרפלואורובורט טומוגרפיה של פליטת פוזיטרונים/טומוגרפיה ממוחשבת](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F62334.jpg%3Fv%3D2026-07-08T02%253A24%253A38.282Z&w=384&q=75)
