הערכת ציטוטוקסיות מהירה במבחנה של קולטן אנטיגן כימרי Jurkat באמצעות הדמיה פלואורסצנטית
27 באוקטובר 2023
פרוטוקול להערכת הרג כמותי של תאי גידול על ידי תאי Jurkat המבטאים קולטן אנטיגן כימרי (CAR) המכוון לאנטיגן גידול יחיד. פרוטוקול זה יכול לשמש כפלטפורמת סינון לאופטימיזציה מהירה של מבני צירי CAR לפני אישור בתאי T היקפיים שמקורם בדם.
תאי CAR T משתפרים ללא הרף כדי להשיג תגובות טובות יותר בניסויים קליניים בבני אדם. אנו מזהים דרכים להעריך זאת במעבדה שלנו באמצעות שיטת תפוקה גבוהה בלתי משוחדת, כגון שימוש בהדמיה פלואורסצנטית כדי לסנן שילובים הפועלים בצורה הטובה ביותר. ישנם מספר שילובים של מבנים שניתן לתכנן עבור כל מקטע משתנה שרשרת יחיד על ידי שינוי הגיאומטריה של תחום החוץ תאי והציר.
תכננו פרוטוקול זה כדי לזהות את השילובים עם היעילות הטובה ביותר בחיסול תאי מטרה באמצעות תאי Jurkat. זהו פרוטוקול מהיר בתפוקה גבוהה לסינון מבני CAR המבוססים על ציטוטוקסיות תאי היעד שלו באמצעות תאי Jurkat, אשר מאומתים לאחר מכן עם תאי T קונבנציונליים. ניתן לבדוק תריסר מבני CAR שונים בלוח 96 בארות בו זמנית באמצעות טכניקה זו.
כאן במעבדת אקהואן, אנו מכמתים במספרים מוחלטים את הציקלוזיס הישיר של תאי המטרה על ידי CAR המבטא תאי Jurkat באופן תפוקה גבוהה כדי לסנן מבני CAR מרובים. המטרה העיקרית של המעבדה שלנו היא לשפר את התרגום הקליני של טיפול CAR T-cell נגד גידולי מוח בדרגה גבוהה. אנו ממנפים מסכי תרופות בתפוקה גבוהה כשיטה אחת לשיפור ציטוטוקסיות תאי T של CAR, כמו גם התמקדות במיקרו-סביבה של הגידול.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מפרט שיטה בעלת תפוקה גבוהה להערכת הציטוטוקסיות של תאי Jurkat המבטאים CAR כנגד תאי גידול. הוא מאפשר סריקה מהירה של מבני CAR שונים כדי לזהות את השילובים היעילים ביותר למיקוד באנטיגנים ספציפיים של גידולים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- אימונולוגיה
- ביולוגיה של הסרטן
- תרפיה תאית
רקע
- תאי CAR T עוברים תהליכי שיפור להשגת תוצאות קליניות טובות יותר.
- שיטות סריקה בספיקת גבוהה (High-throughput screening) הן חיוניות לאופטימיזציה של מבני CAR.
- תאי Jurkat משמשים כמודל להערכת יעילות ה-CAR.
- מחקר זה מתמקד בציטוטוקסיות של מבני CAR כנגד תאי מטרה.
מטרת המחקר
- פיתוח פרוטוקול לסריקה יעילה של מבני CAR.
- כימות ההשפעות הציטוטוקסיות של תאי Jurkat המבטאים CAR.
- זיהוי תצורות CAR אופטימליות לטרגט של אנטיגנים גידוליים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- דימוג פלואורסצנטי לסריקה בשפיעות גבוהה.
- הערכה של מבני CAR מרובים בפורמט של פלטת 96 בארות.
- כימות של הרג תאי מטרה על ידי תאי Jurkat המבטאים CAR.
- השוואה לתגובות T cell קונבנציונליות לצורך תיקוף.
תוצאות עיקריות
- זיהוי מבני CAR יעילים להריגת תאי גידול.
- הדגמת יכולות לסריקה בסריקה גבוהה (high-throughput) באמצעות תאי Jurkat.
- הערכה כמותית של ציטוטוקסיות על פני מבנים שונים.
- פוטנציאל לאופטימיזציה מהירה של עיצובי CAR לפני יישום קליני.
מסקנות
- הפרוטוקול מאפשר סריקה יעילה של מבני CAR.
- תאי Jurkat מספקים מודל מהימן להערכת יעילות ה-CAR.
- גישה זו יכולה להאיץ את הפיתוח של טיפולי תאי CAR T.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למס로ע**
הערכה מהירה ובעלת תפוקה גבוהה של ציטוטוקסיות עבור מבני CAR בתאי Jurkat מאפשרת הפחתת סיכונים בשלבים מוקדמים ותיעדוף של עיצובי CAR לפני תיקוף משאבי-אינטנסיבי בתאי T ראשוניים. פלטפורמה זו מאיצה את הזיהוי של CARs בעלי hinge אופטימלי עם יכולת הריגה עדיפה של תאי המטרה, ובכך תומכת במיון יעיל של פורטפוליו בקווי ייצור של טיפולים תאיים באונקולוגיה. על ידי כימות הציטוטוקסיות של מספר מבנים בו-זמנית, צוותים יכולים לקבל החלטות מבוססות נתונים בנקודות ציון קריטיות של תהליך הגילוי.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פרמצבטיים
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה מהירה של פרמוטציות של מבני CAR לצורך תיקוף פונקציונלי של המטרה.
- תומך בהסרת סיכונים מנגנוניים על ידי כימות ציטוטוקסיות ישירה במערכת מבוקרת.
- מסייע בביסוס ביטחון חזוי בבחירת המבנה לפני הנדסת תאי T ראשונית.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מכין מערכות CAR-Jurkat מתוקפות עבור תהליכי סריקה רחבי-הסריקה (high-throughput) המשכיים.
- מנרמל בדיקות ציטוטוקסיות עם פלטים של דימוי פלואורסצנטי כמותי.
- מאפשר הערכה הדירה, ניתנת לשחזור וניתנת להרחבה של מספר מבני CAR במקביל.
- תומך בהערכה מהימנה של תרכובות או מבנים בפורמט של פלטות בעלות 96 בארות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה נתוני ציטוטוקסיות מוקדמים למטרות תרגומיות באמצעות אישור ממצאים בתאי T המופקים מ-PBMC.
- מספקת רציפות משלב אופטימיזציית המבנה בשלב הגילוי ועד לשלבי תיקוף פרה-קליניים.
- מפחיתה את הסיכון לנשירה בשלבים מאוחרים על ידי סינון עיצובי CAR שאינם אופטימליים בשלב מוקדם.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
פלטפורמה זו לבדיקת ציטוטוקסיות בסביקת עובד גבוהה ממוקמת בממשק שבין שלבי הגילוי המוקדמים לזיהוי מובילים (lead identification), ובכך היא מגשרת בין תכנון הקונסטרקט לבדיקה פרה-קלינית. היא מאפשרת בדיקה מהירה של השערות ומיון קונסטרקטים לפני המעבר למחקרים ראשוניים של תאי T או למחקרי in vivo הדורשים משאבים רבים.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בהערכה מונחית-השערה של שינויים בציר ה-hinge ובדומיין החוץ-תאי עבור יעילות ה-CAR.
- סריקה: מספקת נתונים כמותיים וניתנים לשחזור של ציטוטוקסיות לצורך השוואה ודירוג של מבני ה-CAR.
- אנליטיקה: מספקת ספירות תאים מוחלטות ותוצרי סטטיסטיקה (למשל, one-way ANOVA) כדי לסייע בקבלת החלטות.
- מחקר תרגומי: מאשרת את ביצועי המבנה בתאי T המופקים מ-PBMC, ובכך תומכת ברצף התרגומי.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה ניתנת להרחבה ולשימוש חוזר עבור קמפיינים שוטפים של אופטימיזציה למבני CAR.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בבחירת מבנה ה-CAR.
- ערך תפעולי: מנרמל ומקנה קנה מידה להערכת ציטוטוקסיות, מה שמאפשר הקצאה יעילה של משאבים.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת החלטות ה-go/no-go ואת יעילות ההון על ידי סינון מבנים בשלב מוקדם.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם סיכונים ובקידום מועמדי CAR.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בתכנון מבנה CAR ובהעברה לנטיוויראלית של תאי Jurkat.
- נדרשת גישה למכשור דימוי פלואורסצנטי ותוכנה אנליטית לקבלת תוצאות כמותיות.
- נדרש תקינה חוצת-צוותים של הגדרות המערך לניסוי ושל פרמטרי ניתוח הנתונים.
- התאמה למודלים תאיים אחרים או לאנטיגנים אחרים עשויה לדרוש אופטימיזציה של הפרוטוקול.
- תלוי בניתוח סטטיסטי חסון (למשל, ANOVA) לצורך השוואת המבנים.
שאלות נפוצות בביו-פארמה
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:42
Plating CFSE‐Labelled Tumor Cells and Co‐Culturing CAR‐Expressing Jurkats for In Vitro Cytotoxicity Evaluation
5:19
Preparation of Plate for Fluorescent Imaging and Cell Viability Assessment in CAR‐Jurkat Co‐Culture with CFSE‐Labeled Tumor Cells
![הדמיה דינמית של תאי T קולטן אנטיגן כימרי עם [18F]טטרפלואורובורט טומוגרפיה של פליטת פוזיטרונים/טומוגרפיה ממוחשבת](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F62334.jpg%3Fv%3D2026-07-08T02%253A24%253A38.282Z&w=384&q=75)
