Name: שימוש בדימות STED של תאים חיים כדי להמחיש את מבנה העל של הממברנה הפנימית של המיטוכונדריה במודלים של תאים עצביים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-30T14:25:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: חקור את מבנה המיטוכונדריה ברזולוציה ננומטרית באמצעות מיקרוסקופיית STED בתאי SH-SY5Y ונוירונים היפוקמפיים. שיטה זו מאפשרת ניתוח דינמי של ארכיטקטורת הכריסטאה בחיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

תאי עצב ראשוניים בהיפוקמפוס של חולדות סופקו על ידי ד"ר ג'ורג' ליקוטראפיטיס ושיג'ו גו מהמחלקה להנדסה ביו-רפואית באוניברסיטת קונטיקט (סטורס, קונטיקט, ארה"ב). מכשיר ה-Abberior STED השוכן במתקן המתקדם למיקרוסקופיית אור במרכז למשאבי מחקר וציוד פתוח נרכש במענק NIH S10OD023618 שהוענק לכריסטופר או'קונל. מחקר זה מומן על ידי R01AG065879 המענקים של NIH שהוענקו לנתן נ. אלדר.

חשיפת מבנה העל המיטוכונדריאלי בתאי עצב באמצעות מיקרוסקופ STED

למחברים אין מה לחשוף.

פרוטוקול זה מציג את השימוש בקו תאי נוירובלסטומה אנושיים SH-SY5Y ונוירונים ראשוניים בהיפוקמפוס של חולדות עם צבע PKMO חדשני ממוקד IMM עבור דימות STED של תאים חיים. בשל החידוש של PKMO, יש כיום מעט שפורסם באמצעות צבע זה עבור הדמיה STED חי. שימוש בסוגי תאים אלה להדמיית STED מציב אתגרים, במיוחד מכיוון שלתאים עצביים יש מיטוכונדריה צרה יותר. מגבלה אחת של פרוטוקול זה היא צבע PKMO בשימוש, כפי שהוא יכול להיות רעיל לתאים. תאים וקווי תאים שונים מגיבים באופן שונה לצבע, ולכן ייתכן שיידרשו התאמות לריכוז הצבע ולזמן הדגירה כדי למטב את התוצאות לקבלת אות חזק מבלי לפגוע בתאים. פתרון מוצע הוא להוריד את הריכוז ולהגדיל את זמן הצביעה63; עם זאת, זה עלול לגרום לכתמים גרועים יותר מבלי להגדיל את כדאיות התא.
בדומה ל-PKMO, גם הצבע המסחרי Live Orange mito (Table of Materials) מציג רעילות מסוימת של תאים. צבע זה שימש למגוון תאים בתרבית, אך לא הצליח להציג צביעה דומה בתאי SH-SY5Y ממוינים RA בהצלחה עם אותם פרמטרים כמו עמיתיהם הבלתי ממוינים (התצפיות שלנו שלא פורסמו). עם זאת, פרוטוקולי צביעה מקובלים עשויים להיות ממוטבים עבור בדיקה זו וסוגי תאים נבחרים. עם צבע זה נעשה שימוש בזמני גלאי של 1-1.05 עד 7-7.05 ns, כאשר כל שאר הפרמטרים בטבלה 1 נותרו זהים. באופן כללי, צביעת תאים עם מיטו כתום חי של 200-250 ננומטר במשך 45 דקות הניבה תוצאות דומות כפי שהראו תוצאות PKMO. צביעה בריכוז גבוה יותר למשך פחות זמן או צביעה בריכוז נמוך יותר למשך אותה כמות זמן או מעט יותר יכולה להניב תוצאות שונות ועשויה להיות חיובית לסוגי תאים אחרים או לתנאי גדילה אחרים.
הדמיה של תאי עצב ראשוניים בהיפוקמפוס של חולדה שונה מתאים אימורטליים בשל אופי הקרנות האקסון והדנדריט, כמו גם התפלגות המיטוכונדריה בזמן ההדמיה. קושי אחד בחלק זה של הפרוטוקול הוא שצפיפות הזריעה קובעת אם התרבויות הראשוניות יוכלו להיצמד ולגדול בצורה בריאה, ובצפיפות גבוהה יותר, התחזיות נוטות לגדול יתר על המידה על ידי DIV 10. לכן, המיטוכונדריה המצולמים מתאי עצב ראשוניים אלה יגיעו ככל הנראה מגוף התא ולא מההקרנות; עם זאת, צמיחה מוצלחת מצפיפות תאים התחלתית נמוכה יותר מניבה תוצאות הדמיה טובות יותר בזמני גידול מאוחרים יותר. המפתח הוא להבטיח רקע חלש ואור מחוץ למיקוד כדי לקבל את הניגודיות הטובה ביותר עבור STED. כדי לטפל בחששות לגבי אוכלוסיית התאים, תרבית תאי היפוקמפוס ראשוניים במצע גדילה של נוירונים בתוספת B27 מונעת צמיחה של תאי גלייה, והמקור מדווח כי <5% מהתאים הם אסטרוציטים והיעדר תוסף NbActiv1 במצע הגידול מפחית את מספר האסטרוציטים בתרביות ל -<2% 87. הן עבור תאי SH-SY5Y בתרבית והן עבור תאי עצב ראשוניים בהיפוקמפוס של חולדה, ציפוי PDL המשמש לגדילה תורם לאובך רקע בתמונות. מספיק אות לרעש מתבצע עם ההגדרות המדווחות ב- (טבלה 1) ודה-קונבולוציה מסירה את רוב הרקע שנצפה.
בנוסף לדימות המכוסה כאן, ניתן גם להוסיף טיפולים או מתח לתאים לפני או במהלך ההדמיה. לדוגמה, הוספת טרט-בוטיל מי חמצן (tBHP) גורמת לעקה חמצונית, וניתן לעקוב אחר שינויים במיטוכונדריה לאורך זמן לאחר ההוספה. הוספת β עמילואיד (Aβ) עם תג פלואורסצנטי מאפשרת מעקב אחר התפלגות הפפטיד ביחס למיטוכונדריה וכן אחר המבנה המיטוכונדריאלי לאורך זמן. בריאות המיטוכונדריה מעורבת מאוד באלצהיימר, וקיימת תמיכה נרחבת בכך שהיא ממלאת תפקיד ברעילות Aβ 43,71,72. יש לציין כי מצב ההתמיינות של תאי SH-SY5Y משפיע על לוקליזציה85 של קודמן חלבון Aβ (AβPP), ויש לבנות בזהירות ניסויים באמצעות AβPP.
כדוגמה לאופן שבו פרוטוקול זה יכול להיות מותאם, ניתן לראות כי ניתן להוסיף את הגרסה הפלואורסצנטית Aβ(1-42)-HiLyte 647 לתאים מוכתמים ב-PKMO 15 דקות לפני ההדמיה (איור משלים 1). פרמטרי ההדמיה דומים (טבלה משלימה 2), כאשר ההבדל העיקרי הוא שיש צורך בחור סיכה קטן יותר בעת הדמיה של מיטוכונדריה צרה יותר. הדמיה Aβ-HiLyte647 עם STED דורשת פחות עירור כללי (6%-8%) ודלדול STED (10%-12%) עוצמת לייזר ופחות הצטברות (שש). גלאי gating הוא גם מורחב מ 0.1 ל 10 ns. למרות שרזולוציית STED של Aβ אינה הכרחית, יחס האות לרעש הכולל וגודל חלקיקי Aβ של STED גולמי היו טובים יותר מאלה של התמונות הקונפוקליות, וניתן לבצע גם דה-קונבולוציה לאחר מכן. איסוף תמונות STED והקרנות STED z-stack גולמיות של Aβ נראות שימושיות במיוחד בעת מיזוג עם תמונות STED גולמיות או תמונות STED מפותלות של כתם PKMO (איור משלים 1B,C). שני הערוצים נאספו בשלב פריים אחד. מדידות של לוקליזציה תלוית זמן, בדומה לאלה המפורטות באיור 2 ומוצגות באיור 5, היכן שרלוונטי, והבדלים בארכיטקטורה של cristae ניתן לקבל לאחר טיפול במאמץ או תוספות אחרות.
שיטות אפשריות אחרות לתיוג כפול בתאי STED חיים של מיטוכונדריה שלא דווחו כאן אך דווחו על ידי אחרים כוללות שימוש בחלבונים המתויגים ב- SNAP93, חלבונים המתויגים ב- Halo, ושימוש בצבעים חדירים אחרים לתאים עם מטרות גנריות, כגון mtDNA63. יש לציין כי אסטרטגיית התיוג של תיוג SNAP ו-Halo משפיעה על עוצמת האות הפלואורסצנטי המתקבל ועל תוחלת החיים בעת הדמיה94. בנוסף, בעוד פרוטוקול זה מציג מספר דוגמאות של ניתוחים שניתן ליישם על מיטוכונדריה מקוטעת, ישנם ניתוחים רבים אחרים שחבילות תוכנה יכולות לבצע על תמונות אלה.

מיטוכונדריה הם אברונים אאוקריוטים ממקור אנדוסימביוטי האחראים לוויסות מספר תהליכים תאיים מרכזיים, כולל חילוף חומרים מתווך וייצור ATP, הומאוסטזיס יונים, ביוסינתזה של שומנים ומוות תאי מתוכנת (אפופטוזיס). אברונים אלה מורכבים טופולוגית, ומכילים מערכת ממברנות כפולה שיוצרת תת-תאים מרובים1 (איור 1A). הממברנה המיטוכונדריאלית החיצונית (OMM) מתממשקת עם הציטוזול ויוצרת מגעים ישירים בין אברונים 2,3. הממברנה המיטוכונדריאלית הפנימית (IMM) היא קרום חוסך אנרגיה השומר על שיפועי יונים המאוחסנים בעיקר כפוטנציאל קרום חשמלי (ΔΨm) כדי להניע סינתזת ATP ותהליכים אחרים הדורשים אנרגיה 4,5. ה-IMM מחולק גם לקרום הגבול הפנימי (IBM), אשר מדוכא באופן הדוק ל-OMM, ולמבנים בולטים הנקראים cristae הקשורים על ידי קרום ה-cristae (CM). קרום זה תוחם את תא המטריצה הפנימי ביותר מהמרחב התוך-קריסטלי (ICS) ומהמרחב הבין-קרום (IMS).
למיטוכונדריה יש מורפולוגיה דינמית המבוססת על תהליכים מתמשכים ומאוזנים של ביקוע ואיחוי הנשלטים על ידי מכנואנזימים ממשפחת הדינמינים6. היתוך מאפשר קישוריות מוגברת ויצירת רשתות רשתיות, ואילו הביקוע מוביל לפיצול מיטוכונדריה ומאפשר הסרת מיטוכונדריה פגומה על ידי מיטופגיה7. המורפולוגיה של המיטוכונדריה משתנה לפי סוג הרקמה8 והשלב ההתפתחותי9 ומווסתת כדי לאפשר לתאים להסתגל לגורמים הכוללים צרכים אנרגטיים 10,11 וגורמי סטרס 12. תכונות מורפומטריות סטנדרטיות של מיטוכונדריה, כגון מידת היווצרות הרשת (מקושרת לעומת מקוטעת), היקף, שטח, נפח, אורך (יחס גובה-רוחב), מעוגלות ומידת הסתעפות, ניתנות למדידה ולכימות במיקרוסקופ אופטי סטנדרטי מכיוון שהגדלים של תכונות אלה גדולים מגבול העקיפה של האור (~200 ננומטר)13.
ארכיטקטורת Cristae מגדירה את המבנה הפנימי של המיטוכונדריה (איור 1B). ניתן לסווג באופן רחב את מגוון מורפולוגיות הקריסטות כשטוחות (למלריות או דיסקואידיות) או צינוריות-שלפוחיתיות14. כל ה-cristae מתחברים ב-IBM דרך מבנים צינוריים או דמויי חריצים המכונים צמתים cristae (CJs) שיכולים לשמש למידור ה-IMS מה-ICS וה-IBM מה-CM15. המורפולוגיה של Cristae מווסתת על ידי קומפלקסים חלבוניים מרכזיים של IMM, כולל (1) אתר המגע המיטוכונדריאלי ומערכת ארגון cristae (MICOS) השוכנת ב- CJs ומייצבת מגעי IMM-OMM 16, (2) ניוון אופטי 1 (OPA1) GTPase המווסת שיפוץ cristae17,18,19, ו- (3) F1FO ATP סינתאז היוצר מכלולים אוליגומריים מייצבים בקצות cristae (CTs)20, 21. בנוסף, ה- IMM מועשר בפוספוליפידים שאינם דו-שכבתיים, פוספטידיל-אתנולאמין וקרדיוליפין המייצבים את IMM22 המעוקל מאוד. כריסטות הן גם דינמיות, ומדגימות שינויים מורפולוגיים בתנאים שונים, כגון מצבים מטבוליים שונים 23,24, עם מצעי נשימה שונים 25, תחת רעב ועקה חמצונית 26,27, עם אפופטוזיס28,29, ועם הזדקנות 30. לאחרונה הוכח כי cristae יכול לעבור אירועי שיפוץ גדולים על ציר זמן של שניות, מדגיש את הטבע הדינמי שלהם31. ניתן לכמת מספר מאפיינים של cristae, כולל ממדים של מבנים בתוך cristae בודדים (למשל, רוחב CJ, אורך ורוחב cristae) ופרמטרים המקשרים crista בודדים למבנים אחרים (למשל, מרווח intra-cristae וזווית אירוע cristae ביחס ל- OMM)32. פרמטרים אלה של cristae הניתנים לכימות מראים מתאם ישיר עם פונקציה. לדוגמה, היקף ייצור ה-ATP במיטוכונדריה קשור באופן חיובי לשפע של cristae, מכומת כצפיפות cristae או מספר cristae מנורמל לתכונה אחרת (למשל, cristae לכל אזור OMM)33,34,35. מכיוון שמורפולוגיה של IMM מוגדרת על ידי תכונות ננומטריות, היא כוללת אולטרה-מבנה מיטוכונדריאלי, הדורש טכניקות הדמיה המספקות רזולוציה גדולה ממגבלת עקיפת האור. כפי שיתואר להלן, טכניקות אלה כוללות מיקרוסקופ אלקטרונים ומיקרוסקופ סופר ברזולוציה (ננוסקופיה).
התאים העצביים ותאי הגליה של מערכת העצבים המרכזית (CNS) מסתמכים במיוחד על תפקוד המיטוכונדריה. בממוצע, המוח מהווה רק 2% ממשקל הגוף הכולל, אך מנצל 25% מכלל הגלוקוז בגוף ומהווה 20% מצריכת החמצן בגוף, מה שהופך אותו לפגיע לליקויים בחילוף החומרים האנרגטי36. מחלות נוירודגנרטיביות מתקדמות (NDs), כולל מחלת אלצהיימר (AD), טרשת אמיוטרופית צידית (ALS), מחלת הנטינגטון (HD), טרשת נפוצה (MS) ומחלת פרקינסון (PD), הן חלק מהפתולוגיות הנחקרות ביותר עד כה, עם מאמצי מחקר החל מהבנת היסודות המולקולריים של מחלות אלה ועד לחיפוש מניעה והתערבויות טיפוליות פוטנציאליות. NDs קשורים לעקה חמצונית מוגברת שמקורה בחלקה במיני חמצן תגובתי (ROS) הנוצרים על-ידי שרשרת הובלת האלקטרונים במיטוכונדריה (ETC)37, כמו גם שינוי בטיפול בסידן מיטוכונדריאלי 38 ומטבוליזם שומנים מיטוכונדריאלי39. שינויים פיזיולוגיים אלה מלווים בפגמים בולטים במורפולוגיה של המיטוכונדריה הקשורים ל-AD 40,41,42,43,44, ALS45,46, HD47,48,49, MS50 ו-PD 51,52,53. פגמים מבניים ותפקודיים אלה יכולים להיות משולבים על ידי יחסי סיבה ותוצאה מורכבים. לדוגמה, בהתחשב בכך שמורפולוגיית הקריסטה מייצבת אנזימי OXPHOS54, ROS מיטוכונדריאלי לא רק נוצר על ידי ETC, אלא הם גם פועלים לפגוע בתשתית שבה שוכן ה-ETC, ומקדמים מחזור ROS מזין קדימה המשפר את הרגישות לנזק חמצוני. יתר על כן, הוכח כי חוסר ארגון של cristae מעורר תהליכים כגון שחרור DNA מיטוכונדריאלי (mtDNA) ומסלולים דלקתיים הקשורים להפרעות אוטואימוניות, מטבוליות והקשורות לגיל55. לכן, ניתוח המבנה המיטוכונדריאלי הוא המפתח להבנה מלאה של NDs והיסודות המולקולריים שלהם.
שיטות פופולריות לצפייה בקריסטה, כולל מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת, טומוגרפיית אלקטרונים וטומוגרפיית קריו-אלקטרונים (cryo-ET), וטומוגרפיית רנטגן, במיוחד טומוגרפיית רנטגן קריו-רכה, חשפו ממצאים חשובים ועבודה עם מגוון סוגי דגימות 56,57,58,59,60 . למרות ההתקדמות האחרונה לקראת תצפית טובה יותר של אולטרה-מבנה אברוני, שיטות אלה עדיין מגיעות עם האזהרה של דרישת קיבוע דגימה, ולכן אינן יכולות ללכוד דינמיקה בזמן אמת של cristae ישירות. מיקרוסקופ פלואורסצנטי ברזולוציית על, במיוחד בצורות של מיקרוסקופ תאורה מובנה (SIM), מיקרוסקופ שחזור אופטי סטוכסטי (STORM), מיקרוסקופ לוקליזציה פוטואקטיבי (PALM), מיקרוסקופ הרחבה (ExM) ומיקרוסקופ דלדול פליטה מגורה (STED), הפכו לדרכים פופולריות לצפייה במבנים הדורשים רזולוציה מתחת למגבלת העקיפה המגבילה שיטות קלאסיות של מיקרוסקופיה אופטית. כאשר ExM משמש בשילוב עם טכניקה אחרת סופר רזולוציה, התוצאות מרשימות, אבל הדגימה חייבת להיות קבועה ומוכתמת בג'ל61. לשם השוואה, SIM, PALM/STORM ו-STED שימשו בהצלחה עם דגימות חיות, וצבעים חדשים ומבטיחים שבדרך כלל מכתימים את ה-IMM מספקים גישה חדשנית וקלה להדמיה חיה של מיטוכונדריה cristae dynamics 62,63,64,65,66. ההתקדמות האחרונה בצבעים חיים עבור הדמיית STED שיפרה את בהירות הצבע ואת יציבות האור, וצבעים אלה מכוונים ל- IMM ברמה גבוהה יותר של ספציפיות מקודמיהם. פיתוחים אלה מאפשרים איסוף של ניסויים ארוכי טווח של timelapse ו-z-stack עם הדמיה ברזולוציית על, ופותחים את הדלת לניתוח טוב יותר של תאים חיים של מבנה ודינמיקה של מיטוכונדריה.
להלן פרוטוקולים להדמיית תאים חיים של תאי SH-SY5Y לא ממוינים ומובחנים המוכתמים בצבע PKmito Orange (PKMO) באמצעות STED63. קו התאים SH-SY5Y הוא נגזרת תת-משובטת שלוש פעמים מקו תאי ההורים, SK-N-SH, שנוצר מביופסיה של מח עצם של נוירובלסטומה גרורתית 67,68,69,70. קו תאים זה הוא מודל מבחנה נפוץ במחקר ND, במיוחד עם מחלות כגון AD, HD ו- PD, שבהן תפקוד לקוי של המיטוכונדריה מעורב במידה רבה 10,43,71,72,73. היכולת להתמיין תאי SH-SY5Y לתאים עם פנוטיפ דמוי נוירון באמצעות מניפולציה של אמצעי תרבית הוכחה כמודל מתאים למחקר מדעי המוח מבלי להסתמך על תאי עצב ראשוניים10,74. בפרוטוקול זה, חומצה רטינואית (RA) נוספה למדיום תרבית התאים כדי לגרום להתמיינות של תאי SH-SY5Y. RA הוא נגזרת של ויטמין A והוכח כמסדיר את מחזור התא ומקדם את הביטוי של גורמי שעתוק המווסתים התמיינות עצבית75. פרוטוקול לתרבית והדמיית תאים חיים של תאי עצב שבודדו מההיפוקמפוס של החולדה מסופק גם כן. הודגם כי ההיפוקמפוס מושפע מניוון מיטוכונדריאלי, ויחד עם קליפת המוח, הוא ממלא תפקיד חשוב בהזדקנות וב-ND 76,77,78,79,80.

<table><tbody><tr><td>0.05% טריפסין-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>0.4% טריפאן כחול</td><td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>0.5% טריפסין-EDTA, ללא פנול</td><td>אדום Gibco</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td>100 X אנטיביוטיקה-אנטי-פטריית</td><td>Gibco</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>100 X/1.40 עדשת טבילה בשמן UPlanSApo</td><td>אולימפוס</td><td></td><td>מצוידת במיקרוסקופ אולימפוס IX83 עבור STED התקנה המתוארת בסעיף 4</td></tr><tr><td>חומצה טרנס-רטינואית</td><td>סיגמא</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>עמילואיד ובטא; (1-42, HiLyte Fluor647, 0.1 מ"ג)</td><td>AnaSpec</td><td>AS-64161</td><td>מצומדים פלואורסצנטיים אחרים זמינים</td></tr><tr><td>תוסף B27 (50 X), ללא סרום</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Cell Counter (Countess II FL)</td> <td>Life Technologies</td><td>AMQAF1000</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>Eppendorf</td><td>5804-R</td><td></td></tr><tr><td>שקופיות מונה</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>צינורות חרוטיים (15 מ"ל)</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>קובטות (תאי קוורץ)</td><td>Starna Cells, Inc.</td><td>9-Q-10</td><td>בשימוש עם ספקטרומטר כמתואר בסעיף 1.3</td></tr><tr><td>DMEM (גלוקוז גבוה עם נתרן פירובט)</td><td>Gibco</td><td>11995073</td><td>משמש לחומרי תאים SH-SY5Y כמתואר בסעיף 1</td></tr><tr><td>DMEM (גלוקוז גבוה ללא נתרן פירובאט)</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td>משמש לחומרי תאים ראשוניים כמתואר בסעיף 2</td></tr><tr><td>DMEM (נטול פנול אדום)</td><td>Gibco</td><td>31053028</td><td>משמש להדמיה כמתואר ב סעיף 3</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>DNAase I מלבלב בקר</td><td>Sigma</td><td>DN25</td><td>משמש לחומרי תאים ראשוניים כמתואר בסעיף 2.2.1 ו- 2.2.2</td></tr><tr><td>DPBS (ללא סידן, ללא מגנזיום)</td> <td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>E18 Rat Hippocampus</td><td>Transnetyx רקמת</td><td>SDEHP</td><td></td></tr><tr><td>אתנול (200 הוכחה)</td> <td>פישר ביוריאגנטים</td><td></td><td></td>BP28184</tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS), ג'יבקו לא מומת בחום</td><td></td><td>26140079</td><td>לתאים מתורבתים, בסעיף 1</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (מושבת בחום)</td><td>Gibco</td><td>10082147</td><td>לתרבית תאים ראשונית, סעיף 2</td></tr><tr><td>יחידת עיקור מסנן (0.1 &micro; מ', 500 מ"ל)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>5660010</td><td></td></tr><tr><td>FIJI (הוא רק ImageJ) ותוסף Trainable Weka Segmentation (TWS)</td> <td>--</td><td>--</td> <td>תוכנה חינמית לניתוח תמונות בקוד פתוח הכוללת תוספים כולל Trainable Weka Segmentation המתואר בסעיף 5; תוסף TWS מהפניה 90 של הטקסט הראשי</td></tr><tr><td>תוסף GlutaMAX (100 X)</td><td>תוסף גלוטמין Gibco</td><td>35050061</td><td>המשמש לחומרי תאים ראשוניים המתוארים בסעיף 2.1.2</td></tr><tr><td>Hausser Scientific bright-Line and Hy-Lite Counting Chambers</td><td>Hausser Scientific</td><td>267110</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (ללא סידן, ללא מגנזיום)</td><td>Gibco</td><td>14170120</td><td>משמש לחומרי תאים ראשוניים המתוארים בסעיף 2.2.1 ו-2.2.2</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Huygens תוכנת דה-קונבולוציה מקצועית (V. 20.10)</td> <td>הדמיה בנפח מדעי (SVI)</td> <td>-</td> <td>תוכנת הדה-קונבולוציה המשמשת בפרוטוקול זה ומתוארת בסעיף 5</td></tr><tr><td>IX83 מיקרוסקופ הפוך עם פוקוס אוטומטי רציף</td><td>אולימפוס</td> <td>-</td> <td>מאמר זה משתמש במערכת STED Infinity Line הבנויה סביב מיקרוסקופ הפוך אולימפוס IX83, המתואר בסעיף 4</td></tr><tr><td>תוכנת Lightbox (V. 16.3.16118)</td><td>Abberior</td> <td>-</td> <td>תוכנת ספק המשמשת לרכישת תמונות STED, המתוארת בסעיף 4</td></tr><tr><td>צבע Mito כתום חי</td><td>Abberior</td><td>LVORANGE-0146-30NMOL</td><td>הדמיית תאים חיים צבע ממוקד IMM המתואר בדיון</td></tr><tr><td>מדיה נוירובזאלית</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td>משמש לחומרי תאים ראשוניים המוזכרים בסעיף 2.1.2</td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek II 2 בארות כיסוי</td><td>זכוכית Nunc</td><td>155379</td><td>ניתן לרכוש מגוון תאים אך וודאו שזכוכית הכיסוי היא #1.5</td></tr><tr><td>Pasteur Pipets (Fisherbrand)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22183632</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>PKmito צבע כתום</td><td>Spirochrome</td><td>SC053</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lysine</td><td>Gibco</td><td></td><td></td>A3890401</tr><tr><td>SH-SY5Y קו תאים</td><td>ATCC</td><td>CRL2266</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פירובט (100 מ"מ)</td> <td>Gibco</td><td>11360070</td><td>משמש לחומרי תאים ראשוניים המתוארים בסעיף 2</td></tr><tr><td>ספקטרומטר (GENESYS 180 UV-Vis)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>840309000</td><td></td></tr><tr><td>STED Expert Line מיקרוסקופ</td><td>Abberior</td><td>--</td><td>ניתן להתאים אישית את הגדרת STED, אך בעת הרכישה המכשיר נחשב ל-Abberior' קו המומחים; תיאור קצר של ההתקנה זמין בסעיף 4 של פרוטוקול</td></tr><tr><td>T25 בקבוק (מטופל TC, מכסה מסנן)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>156367</td><td>כלי תרבית וגדלים אחרים זמינים</td></tr></tbody></table>

שימוש בדימות sted של תאים חיים כדי להמחיש את מבנה העל של הממברנה הפנימית של המיטוכונדריה במודלים של תאים עצביים

Using Live Cell STED Imaging to Visualize Mitochondrial Inner Membrane Ultrastructure in Neuronal Cell Models

מיטוכונדריה ממלאים תפקידים חיוניים רבים בתא, כולל ייצור אנרגיה, ויסות הומאוסטזיס Ca2+ , ביוסינתזה של שומנים וייצור מיני חמצן תגובתי (ROS). תהליכים אלה בתיווך מיטוכונדריה לוקחים על עצמם תפקידים מיוחדים בנוירונים, תיאום חילוף החומרים האירובי כדי לענות על דרישות האנרגיה הגבוהות של תאים אלה, ויסות איתות Ca2+ , אספקת שומנים לצמיחה והתחדשות של אקסונים, וכוונון ייצור ROS להתפתחות ותפקוד עצביים. לכן, תפקוד לקוי של המיטוכונדריה הוא גורם מרכזי במחלות נוירודגנרטיביות. המבנה והתפקוד של המיטוכונדריה קשורים קשר בל יינתק. הממברנה הפנימית המורכבת מורפולוגית עם קפלים מבניים הנקראים cristae מכילה מערכות מולקולריות רבות המבצעות את תהליכי החתימה של המיטוכונדריה. המאפיינים האדריכליים של הממברנה הפנימית הם אולטרה-סטרוקטורליים ולכן קטנים מכדי שניתן יהיה לדמיין אותם במיקרוסקופ מסורתי מוגבל עקיפה. לפיכך, רוב התובנות על אולטרה-מבנה מיטוכונדריאלי הגיעו ממיקרוסקופ אלקטרונים על דגימות קבועות. עם זאת, טכנולוגיות מתפתחות במיקרוסקופ פלואורסצנטי ברזולוציית על מספקות כיום רזולוציה של עד עשרות ננומטרים, ומאפשרות הדמיה של תכונות אולטרה-מבניות בתאים חיים. הדמיה ברזולוציית על מציעה אפוא יכולת חסרת תקדים לצלם ישירות פרטים קטנים של מבנה המיטוכונדריה, התפלגות חלבונים ננומטרית ודינמיקה של קריסטה, ומספקת תובנות בסיסיות חדשות הקושרות מיטוכונדריה לבריאות האדם ולמחלות. פרוטוקול זה מציג את השימוש במיקרוסקופ ברזולוציית על של דלדול פליטה מגורה (STED) כדי להמחיש את מבנה העל של המיטוכונדריה של תאי נוירובלסטומה אנושיים חיים ונוירונים ראשוניים של חולדות. הליך זה מאורגן בחמישה חלקים: (1) גדילה והתמיינות של קו תאי SH-SY5Y, (2) בידוד, ציפוי וגדילה של נוירונים ראשוניים בהיפוקמפוס של חולדה, (3) נהלים להכתמת תאים עבור דימות STED חי, (4) הליכים לניסויי STED של תאים חיים באמצעות מיקרוסקופ STED לעיון, ו-(5) הדרכה לסגמנטציה ועיבוד תמונה באמצעות דוגמאות למדידה וכימות של תכונות מורפולוגיות של הממברנה הפנימית.

פרוטוקול זה מתאר את תנאי צמיחת התאים עבור תאים בתרבית ותאים ראשוניים, תוך התמקדות בהדמיית STED של תאים חיים ובניתוחים עוקבים של קריסטות מיטוכונדריאליות. הקרנות שנעשו עם ImageJ של מיטוכונדריה מתאי SH-SY5Y לא ממוינים (איור 3A) ותאי SH-SY5Y ממוינים RA (איור 3B) יכולות להיאסף כערימות z עם קונפוקל מסורתי ו-STED, ואז ניתן לפרק את תמונות STED הגולמיות. ניתן גם לבצע הדמיית Timelapse ולאחר מכן לפרק אותה (איור 3C,D). באמצעות שימוש בפרמטרי הדמיה מעט שונים עבור תאי עצב ראשוניים בהיפוקמפוס של חולדה (טבלה 1), תמונות קונפוקליות ותמונות STED גולמיות יכולות להתקבל כערימות z, ותמונות STED גולמיות יכולות להיות מפותלות (איור 4A). הדמיה בהילוך מהיר של מיטוכונדריה מתאי עצב ראשוניים אפשרית גם כן (איור 4B). באופן כללי, תמונות קיטועי הזמן אמורות להיות מסוגלות להציג אירועים דינמיים מיטוכונדריאליים.
כאשר תחזיות STED גולמיות ו- STED z-stack מפותלות מהדגימות המשמשות לסגמנטציה נראות עקביות, מבוצעות מדידות כמותיות. תוסף TWS משתמש בתמונת STED מפותלת כדי לפלח כדי ליצור מסיכת הסתברות, אשר לאחר מכן משמשת ליצירת מסיכה בינארית של cristae כדי לקבל פרמטרים של גודל וצורה (איור 5A). האזורים ממסיכה זו נשמרים במנהל החזר ההשקעה וניתן להחיל אותם על תמונת STED גולמית אם רוצים בכך כדי למדוד הבדלים בעוצמה יחסית. תחזיות STED מפותלות יכולות לשמש גם כדי לקבוע את מחזוריות הקריסטאה ואת צפיפותה באזור נתון (איור 5B).
<img alt="תרשים מבנה מיטוכונדריון; תוויות: קריסטה, מטריקס, ממברנות; מחקר ביולוגיה תאית." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65561/65561fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> איור 1: מורפולוגיה מיטוכונדריאלית. למיטוכונדריה יש מערכת דו-ממברנית המגדירה תת-תאים שונים (A). Cristae הם קפלים של הקרום הפנימי עם תכונות מוגדרות (B). קיצורים: OMM, קרום מיטוכונדריאלי חיצוני; ICS, חלל אינטרקריסטל; IMS, חלל אינטרממברנה; CM, קרום cristae; IBM, קרום גבול פנימי; IMM, קרום מיטוכונדריאלי פנימי; CT, קצה cristae; CJ, צומת קריסטי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="תהליך הדמיה מיטוכונדריאלית באמצעות מיקרוסקופ STED; דיאגרמה של עיבוד וניתוח תמונה." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65561/65561fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> איור 2: סכמה של זרימת עבודה. תאי SH-SY5Y או נוירונים ראשוניים בהיפוקמפוס של חולדה גדלים על זכוכית כיסוי מצופה PDL. תאי SH-SY5Y גדלים במקביל כדי להישאר בלתי ממוינים או נתונים להתמיינות RA במשך שישה ימים. תאי עצב ראשוניים בהיפוקמפוס של חולדה גדלו על זכוכית כיסוי מצופה PDL לאחר שבודדו מחלקי ההיפוקמפוס במשך שבעה ימים. ברגע שהיו מוכנים לצילום, התאים הוכתמו ב-PKMO וצולמו ב-STED. לאחר מכן, תמונות STED גולמיות מפותלות, והתמונות המפותלות מעובדות בפיג'י כדי לקבל מדידות גודל וצורה, כגון צפיפות cristae, שטח, היקף, מעגליות ויחס גובה-רוחב. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="תמונות מיקרוסקופיה STED; תאים לא ממוינים לעומת תאים מובחנים; רצף זמני; קנה מידה של 250 ננומטר." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65561/65561fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> איור 3: הדמיה של מיטוכונדריה בתאי SH-SY5Y. מוצגות הקרנות של תמונת STED מפותלת (משמאל), STED גולמי (במרכז) ו-Huygens deconvolved STED image z-stack (מימין) של מיטוכונדריה מתאי SH-SY5Y לא ממוינים (A) ו-RA-differentiated (B) עם צביעת PKMO. קיטוע זמן עם מרווחים של 30 שניות ו- 5 איטרציות של תאי SH-SY5Y ממוינים RA מוצג (C) עם אזורים נבחרים (תיבות לבנות) המורחבים על (D) באמצעות תמונות בקנה מידה של אזורים אלה ללא אינטרפולציה. פסי קנה מידה: A,B, 250 ננומטר; C,D, 1 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561fig03large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="השוואת מיקרוסקופיה STED, vs. raw קונפוקלי ותמונות STED לא מפותלות, ניתוח פלואורסצנטי." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65561/65561fig04.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> איור 4: הדמיה של מיטוכונדריה בתאי עצב ראשוניים בהיפוקמפוס של חולדה. תמונה קונפוקלית מייצגת (משמאל), STED גולמי (במרכז) והויגנס נטרלה STED מפותל (מימין) מוצגות הקרנות z-stack של מיטוכונדריה מנוירונים ראשוניים בהיפוקמפוס של חולדה (A). מוצג פרק זמן עם מרווחים של 25 שניות ו-5 חזרות של מיטוכונדריה בתאי עצב אלה (B). פסי קנה מידה: A, 250 ננומטר; B, 1 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561fig04large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="תמונות מיקרוסקופיה של דה-קונבולוציה וגרף המציג רזולוציה מרחבית וניתוח עוצמה." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65561/65561fig05.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> איור 5: עיבוד של תמונות STED מפותלות ב-ImageJ. מוצג שימוש מייצג בתוסף Trainable Weka Segmentation למדידת גודל וצורה של cristae (A). משמאל לימין, מוצגות התמונות הבאות: תמונת STED מפותלת, מפת ההסתברות המבוססת על סגמנטציה מתוסף TWS, המסכה מסף בפיג'י באמצעות מפת ההסתברות כקלט, המסכה עם ה- ROI המתואר, וה- ROI שכבת-על על תמונת STED המפותלת המקורית. ניתן למצוא את מדידות השטח, ההיקף, המעגליות ויחס הגובה-רוחב המתקבלות בהתאם לאובייקטים אלה בטבלה משלימה 1. מוצגת התוויית קו המשתמשת בתמונת STED מפותלת למדידת מרחקי שיא לשיא כקריאה לצפיפות cristae (B). פסי קנה מידה: 0.5 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561fig05large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>גודל פיקסל (nm)</td>
			<td>זמן שהייה (μs)</td>
			<td>קו acc.</td>
			<td>עירור 561 ננומטר במהלך רכישת STED (%)</td>
			<td>עוצמת דלדול STED של 775 ננומטר (%)</td>
			<td>גודל צעד (nm)</td>
			<td>חור סיכה (AU)</td>
			<td>מרווחי זמן של קיטועי זמן</td>
			<td>איטראציות של קיטועי זמן</td>
		</tr><tr><td>SH-SY5Y ללא הבדל</td>
			<td>20</td>
			<td>4</td>
			<td>10</td>
			<td>15</td>
			<td>20</td>
			<td>200</td>
			<td>1.0</td>
			<td>30</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>RA-Differe-ntiated SH-SY5Y</td>
			<td>20-25</td>
			<td>4</td>
			<td>10-12</td>
			<td>15</td>
			<td>20-22</td>
			<td>150-200</td>
			<td>1.0</td>
			<td>30</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>תאי עצב ראשוניים</td>
			<td>20-25</td>
			<td>4</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>25</td>
			<td>200</td>
			<td>0.7</td>
			<td>30</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td colspan="10">הערה: גודל הפיקסלים עשוי להשתנות בהתאם לדרישות ההדמיה ולכוונה לנטרל תמונות. דגימה מתאימה נדרשת עבור deconvolution. גודלי פיקסלים לתמונות STED גולמיות ללא דה-קונבולוציה יכולים להגיע עד 30 ננומטר.</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 1: סיכום פרמטרים של רכישת STED. ההגדרות המשמשות לדימות STED דו-ממדי עבור כל סוג תא, SH-SY5Y לא ממוין, SH-SY5Y ממוין RA ונוירונים ראשוניים בהיפוקמפוס של חולדה, מוצגות. עבור כל הפסקות הזמן, 5 חזרות נלקחו עם מרווחי זמן משתנים בהתבסס על גודל החזר ההשקעה.
איור משלים 1: הדמיה של תאי SH-SY5Y עם תוספת עמילואיד-β (Aβ). מוצגות תמונות קונפוקליות מייצגות (משמאל), STED גולמי (במרכז) ו-STED מפותל (מימין) של תאי SH-SY5Y ממוינים RA עם כתם PKMO (למעלה) ו-Aβ-HiLyte647 (למטה). מוצגות תחזיות z-stack ממוזגות של PKMO STED גולמי (ירוק) עם Aβ STED גולמי (מגנטה) (B) או PKMO STED מפותל (ירוק) עם Aβ STED מפותל (מגנטה) (C). פסי קנה מידה: 0.5 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/Suppl%20Fig.pdf" target="_blank">אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.</a>
טבלה משלימה 1: מדידות גודל וצורה של קריסטה מקוטעת. מדידות הגודל והצורה של שטח (μm2), היקף (μm), מעגליות ויחס גובה-רוחב, המתאימות לעצמים המתוארים באיור 5A ממיטוכונדריה מקוטעת, מוצגות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561_Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
טבלה משלימה 2: סיכום פרמטרים של רכישה עם דגימות β עמילואיד. ההגדרות המשמשות להדמיית STED דו-ממדית של PKMO ו- Aβ-HiLyte647 בתאי SH-SY5Y לא ממוינים וממוינים RA מוצגות. ניתן להשתמש בקונפוקל של Aβ-HiLyte647 לבד מכיוון שאין מבנה ספציפי לפתור; תמונות STED של Aβ-HiLyte647 מוצגות כאן עבור גדלי חלקיקים קטנים יותר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561_Supplementary%20Table%202.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
קובץ משלים 1: פרוטוקול טיפול בעמילואיד-β. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561_Supplementary%20File%201.docx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>

פרוטוקול זה מציג זרימת עבודה להתפשטות, התמיינות וצביעה של תאי SH-SY5Y בתרבית ותאי עצב ראשוניים בהיפוקמפוס של חולדה לצורך הדמיה וניתוח של מבנה אולטרה-מבנה מיטוכונדריאלי באמצעות מיקרוסקופ דלדול פליטה מגורה (STED).

שימוש בדימות STED של תאים חיים כדי להמחיש את מבנה העל של הממברנה הפנימית של המיטוכונדריה במודלים של תאים עצביים

Mitochondria play many essential roles in the cell, including energy production, regulation of Ca2+ homeostasis, lipid biosynthesis, and production of ...

תוכנית המחקר שלנו מתמקדת בהיבטים מבניים ותפקודיים של מיטוכונדריה, במיוחד כאשר הם קשורים לתפקוד לקוי הקשור להזדקנות. לשם כך, אנו משתמשים במגוון רחב של טכניקות ביופיזיקליות, ביוכימיות ומבניות כדי לחקור את המנגנונים הבסיסיים של הזדקנות מיטוכונדריאלית ולפתח התערבויות טיפוליות לשימור ושיקום בריאות המיטוכונדריה. תפקוד ומבנה המיטוכונדריה קשורים קשר בל יינתק.טכניקות סטנדרטיות של מיקרוסקופ אור מתאימות למדידת תכונות מיטוכונדריאליות בקנה מידה גדול כמו מורפולוגיה בסיסית ומבני רשת. ניתוח מבנה אולטרה מיטוכונדריאלי או תכונות הדורשות רזולוציה גבוהה יותר מזו הניתנת על ידי מיקרוסקופ אופטי מסורתי נעשה בדרך כלל באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים או טומוגרפיה על דגימות קבועות. מיקרוסקופ סופר רזולוציה הוא טכניקת הדמיה מבוססת פלואורסצנטיות המודדת תכונות מעבר לגבול העקיפה.עבור מיטוכונדריה, זה כולל מדידות של התפלגות חלבונים בקנה מידה ננומטרי וארכיטקטורת cristae. פרוטוקול ההדמיה המתואר כאן מאפשר לחוקרים למדוד את המבנה המפורט של הממברנה הפנימית בתאים חיים. הדמיה של תאים חיים מאפשרת לנו לצפות ולנתח כמותית תכונות מורכבות של cristae בתנאים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית ללא צורך בקיבוע דגימה.זה ייתן לחוקרים תובנות חדשות על השינויים הדינמיים המתרחשים בתכונות אולטרה מבניות והתגובות הטמפורליות שלהם לגורמי לחץ ותרכובות פרמקולוגיות.

using-live-cell-sted-imaging-to-visualize-mitochondrial-inner

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

הדמיה תא חי היא של כלי מסוים כאשר לומדים את הדינמיקה של סחר אברון. כאן אנו מתארים פרוטוקול הדמיה חיה של צפופה ליבות שלפוחית ​​בנוירונים בתרבית שימוש רחב בתחום מיקרוסקופ פלואורסצנטי. פרוטוקול זה הוא גמיש ניתן להתאים האברונים תמונה אחרים כגון המיטוכונדריה, endosomes, ואת peroxisomes.

הדמיה חיה של צפופה ליבות שלפוחית ​​בתוך ראשי נוירונים בהיפוקמפוס Cultured

אנו מתארים פרוטוקול המאפשר הדמיה של המיטוכונדריה לחיות הנוירונים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי פני משכי זמן ארוכים. הדמיה על תקופות ממושכות נעשה באמצעות הביטוי lentivirus בתיווך של חלבון פלואורסצנטי ממוקד mitochondrially ושימוש זול הבמה העליון חממה כי תוכנן ונבנה במעבדה שלנו.

Neuromodulation ותחבורה מיטוכונדריאלי: הדמיה חיה נוירונים בהיפוקמפוס פני משכי זמן ארוכים

מקור: Kennedy, L. H., et. al. הדמיה והדמיה חיה של אברוני אוליגודנדרוציטים בפרוסות מוח אורגנוטיפיות באמצעות וירוס הקשור לאדנו ומיקרוסקופיה קונפוקלית. J. Vis. Exp. (2017)סרטון זה מדגים את ההדמיה של מיטוכונדריה אוליגודנדרוציטים בפרוסות מוח אורגנוטיפיות של עכבר. הפרוסה מונחת בתוך תא אמבטיה עם זרימת נוזלים רציפה וטמפרטורה מבוקרת. לאחר הגדרת פרמטרים שונים של המיקרוסקופ הקונפוקלי, נלכדות תמונות זמן-lapse של מיטוכונדריה עם פלואורסצנטיות אדומה, ואחריהן תמונות Z-stack של האוליגודנדרוציטים עם...

הדמיה קונפוקלית של תנועה מיטוכונדריאלית בתוך אוליגודנדרוציטים בתרביות פרוסות מוח אורגנוטיפיות

הובלה מיטוכונדריאלי לקויה ומורפולוגיה מעורבים במחלות ניווניות שונות. הפרוטוקול המוצג משתמש מושרה המושרה תא גזע הנגזרת הנוירונים המוח כדי להעריך הובלה מיטוכונדריאלי ומורפולוגיה ב מפרסטית תורשתית. פרוטוקול זה מאפשר אפיון של סחר מיטוכונדריאלי לאורך אקסונים וניתוח של מורפולוגיה שלהם, אשר להקל על המחקר של מחלות ניווניות.

ניתוח הובלה מיטוכונדריאלי ומורפולוגיה בתאי גזע בעלי השפעה של האדם המושרה בנוירונים

פרוקטוקול זה נועד לספק שיטה במבחנה ובהדמיה של ויוו מיטוכונדריאלי Ca2+ באסטרוציטים ונוירונים.

הדמיה מיטוכונדריאלית Ca2 + ספיגה אסטרוציטים ונוירונים באמצעות אינדיקטורים Ca2+ מקודדים גנטית (GECIs)

מאמר זה מתאר את השיטה להדמיה מיטוכונדריאלית של תרביות אסטרוציטים המצוידות בביו-סנסור MitoTimer ואת הניתוח הרב-פרמטרי המתקבל של דינמיקה מיטוכונדריאלית, ניידות, מורפולוגיה, ביוגנזה, מצב אדום ומחזור.

הדמיה חיה של מערכת מיטוכונדריאלית באסטרוציטים מתורבתים

מאמר זה מתאר פרוטוקול כדי לקבוע הבדלים במצב redox בזאלי ו redox תגובות perturbations חריפה בהיפוקמפוס ראשוני נוירונים קליפת המוח באמצעות מיקרוסקופיה חיה קונפוצלית. ניתן להחיל את הפרוטוקול על סוגי תאים ומיקרוסקופים אחרים עם שינויים מינימליים.

הדמיה חיה של מצב גלוטתיון גלוטתיון מיטוכונדריאלי בנוירונים ראשוניים באמצעות מחוון רצומטרי

פרוטוקול זה מתאר כיצד לשחזר כריסטה מיטוכונדריאלית כדי להשיג הדמיה תלת-ממדית בדיוק גבוה, ברזולוציה גבוהה ובתפוקה גבוהה.

טכניקה תלת מימדית להדמיה של שינויים אולטרה-מבניים מיטוכונדריאליים בתאי סרטן הלבלב

צבעים FM כבר סיוע שלא יסולא בפז בהבנת הדינמיקה הסינפטי. FMS אחריהן בדרך כלל במהלך תנאי גירוי שונים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. עם זאת, photoconversion של צבעים FM משולב עם מיקרוסקופ אלקטרונים מאפשר הדמיה של בריכות נפרדות שלפוחית ​​סינפטית, בין הרכיבים ultrastructure אחרות, boutons הסינפטי.

לימוד בריכות שלפוחיות Synaptic באמצעות photoconversion של צבעים Styryl

פיתחנו תוכנת מחשב לנתח מורפולוגיה עצביים. בשילוב עם שני כלים הקיימים ניתוח קוד פתוח, התוכנית שלנו מבצעת ניתוח Sholl וקובע את מספר neurites, נקודות הסניף, וטיפים neurite. הניתוחים מבוצעים כך שינויים מקומיים במורפולוגיה neurite ניתן לצפות.

ניתוח אוטומטי של מורפולוגיה Sholl העצבית סרוקים בקני מידה מרובים

חקור את מבנה המיטוכונדריה ברזולוציה ננומטרית באמצעות מיקרוסקופיית STED בתאי SH-SY5Y ונוירונים היפוקמפיים. שיטה זו מאפשרת ניתוח דינמי של ארכיטקטורת הכריסטאה בחיים.

שימוש בדימות STED של תאים חיים כדי להמחיש את מבנה העל של הממברנה הפנימית של המיטוכונדריה במודלים של תאים עצביים

גלה סרטונים נוספים