שימוש בדימות STED של תאים חיים כדי להמחיש את מבנה העל של הממברנה הפנימית של המיטוכונדריה במודלים של תאים עצביים
June 30th, 2023
פרוטוקול זה מציג זרימת עבודה להתפשטות, התמיינות וצביעה של תאי SH-SY5Y בתרבית ותאי עצב ראשוניים בהיפוקמפוס של חולדה לצורך הדמיה וניתוח של מבנה אולטרה-מבנה מיטוכונדריאלי באמצעות מיקרוסקופ דלדול פליטה מגורה (STED).
תוכנית המחקר שלנו מתמקדת בהיבטים מבניים ותפקודיים של מיטוכונדריה, במיוחד כאשר הם קשורים לתפקוד לקוי הקשור להזדקנות. לשם כך, אנו משתמשים במגוון רחב של טכניקות ביופיזיקליות, ביוכימיות ומבניות כדי לחקור את המנגנונים הבסיסיים של הזדקנות מיטוכונדריאלית ולפתח התערבויות טיפוליות לשימור ושיקום בריאות המיטוכונדריה. תפקוד ומבנה המיטוכונדריה קשורים קשר בל יינתק.
טכניקות סטנדרטיות של מיקרוסקופ אור מתאימות למדידת תכונות מיטוכונדריאליות בקנה מידה גדול כמו מורפולוגיה בסיסית ומבני רשת. ניתוח מבנה אולטרה מיטוכונדריאלי או תכונות הדורשות רזולוציה גבוהה יותר מזו הניתנת על ידי מיקרוסקופ אופטי מסורתי נעשה בדרך כלל באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים או טומוגרפיה על דגימות קבועות. מיקרוסקופ סופר רזולוציה הוא טכניקת הדמיה מבוססת פלואורסצנטיות המודדת תכונות מעבר לגבול העקיפה.
עבור מיטוכונדריה, זה כולל מדידות של התפלגות חלבונים בקנה מידה ננומטרי וארכיטקטורת cristae. פרוטוקול ההדמיה המתואר כאן מאפשר לחוקרים למדוד את המבנה המפורט של הממברנה הפנימית בתאים חיים. הדמיה של תאים חיים מאפשרת לנו לצפות ולנתח כמותית תכונות מורכבות של cristae בתנאים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית ללא צורך בקיבוע דגימה.
זה ייתן לחוקרים תובנות חדשות על השינויים הדינמיים המתרחשים בתכונות אולטרה מבניות והתגובות הטמפורליות שלהם לגורמי לחץ ותרכובות פרמקולוגיות.
סקירה כללית
מחקר זה מציג פרוטוקול להפצה, התמיינות וכתמת של תאי SH-SY5Y ונוירונים היפוקמפיים ראשוניים של חולדה. המטרה היא לדמיין ולנתח אולטרה-מבנה של מיטוכונדריה באמצעות מיקרוסקופיית דלדול פליטה מגורה (STED), ובכך לספק תובנות לגבי הדינמיקה המבנית של המיטוכונדריה בתאים חיים.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- נוירו-מדע
- ביולוגיה של התא
- מחקר מיטוכונדריה
רקע
- המבנה והתפקוד של המיטוכונדריה חיוניים לבריאות התא.
- מיקרוסקופיה מסורתית מוגבלת ברזולוציה לניתוח אולטרה-מבני.
- מיקרוסקופיה בעלת רזולוציה-על מאפשרת הדמיה מפורטת יותר של מאפייני המיטוכונדריה.
- הבנת השינויים המיטוכונדריאליים יכולה לספק תובנות לגבי הזדקנות ותפקוד לקוי.
מטרת המחקר
- לבסס שיטה אמינה לחקר האולטרה-מבנה המיטוכונדריאלי בתאים חיים.
- לאפשר לחוקרים לנתח שינויים דינמיים במורפולוגיה המיטוכונדריאלית.
- לספק בסיס לחקר תגובות המיטוכונדריה לטיפולים שונים.
שיטות ששימשו
- גידול והתמיינות של תאי נוירובלסטומה SH-SY5Y.
- הכנה של נוירונים היפוקמפיים ראשוניים של חולדה.
- שימוש במיקרוסקופיית STED לצורך הדמיה ברזולוציה גבוהה.
- צעדים מרכזיים כוללים הפשרת תאים, ציפוי גלידות והכתמה עם PKMO.
- רכישת ותיקון תמונות באמצעות תוכנות ופלאגינים מסוימים.
תוצאות עיקריות
- הדמיה מוצלחת של מבנים מיטוכונדריאליים ברזולוציה ננומטרית.
- תובנות לגבי ארכיטקטורת הקריסטות והתפלגות החלבונים בתוך המיטוכונדריה.
- ניתוח כמותי של שינויים במאפייני המיטוכונדריה בתנאים פיזיולוגיים.
- ממצאים משמעותיים פוטנציאליים לגבי התגובה של המיטוכונדריה לתרכובות פרמקולוגיות.
מסקנות
- המחקר מדגים טכניקה בעלת ערך לחקר הדינמיקה המיטוכונדריאלית בתאים חיים.
- תורם להבנת התפקיד של המיטוכונדריה בהזדקנות ובבריאות התא.
- השלכות להתערבויות טיפוליות שמטרתן שיקום התפקוד המיטוכונדריאלי.
