פרופיל פנוטיפי של נוירונים דופמינרגיים שמקורם בתאי גזע אנושיים במוח התיכון
7 ביולי 2023
פרוטוקול זה מתאר את תרבית התאים של נוירונים דופמינרגיים במוח התיכון האנושי, ולאחר מכן צביעה אימונולוגית ויצירת פרופילים פנוטיפיים עצביים מתמונות מיקרוסקופיות שנרכשו בתוכן גבוה ומאפשרים זיהוי של וריאציות פנוטיפיות עקב מודולציות גנטיות או כימיות.
אנו בונים פרופילים פנוטיפיים של תאים אנושיים ממוינים כגון נוירונים. המטרה שלנו היא להבין טוב יותר את ההשפעות הכוללות של טיפולים בתרכובות כימיות על התאים. פרופילים פנוטיפיים יכולים להציע נקודות כניסה פחות מוטות למחקרים מכניסטיים נוספים.
איכות הפרוטוקולים להבחנה בין נוירונים דופמינרגיים אנושיים השתפרה באופן משמעותי, ומאפשרת ייצור של קבוצות גדולות של נוירונים הומוגניים. בנוסף, יש עלייה בשימוש באוטומציה מעבדתית לטיפול ביכולת הרבייה של תאים ממוינים לאורך תקופות ממושכות, וכמובן שהניצול של נתונים מבוססי הדמיה הפך מהיר ומפורט יותר. אתגר גדול הוא להבטיח שפרופילים פנוטיפיים ניתנים לכימות ולשחזור.
כדי להשיג זאת, חיוני לייצר אצוות נוירונים הומוגניות ולזהות פרוטוקול מותאם אוטומציה. עם זאת, עם פרוטוקולים אוטומטיים, תמיד יש פשרה בין היתכנות טכנית לבין רלוונטיות פיזיולוגית. כאן, מצאנו פשרה טובה.
פיתחנו פתרון מוכן לשימוש לאפיון יסודי של נוירונים דופמינרגיים אנושיים בגישת הדמיה. הפרוטוקול האוטומטי, יחד עם זרימת העבודה של ניתוח תמונות ונתונים, יצייד מדענים נוספים ליצירת פרופילים פנוטיפיים עצביים. ברצוננו להבין טוב יותר כיצד פרופילים פנוטיפיים שונים בין צורות מונוגנטיות ואידיופתיות של מחלת פרקינסון.
ברצוננו גם לחקור את השינויים בהיבטים פנוטיפיים כאשר נוירונים דופמינרגיים מתקשרים עם סוגים אחרים של תאי מוח כגון מיקרוגליה, למשל.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מפרט פרוטוקול לתרבית של נוירונים דופמינרגיים מהמוח האמצעי האנושי, הכולל צביעה אימונולוגית ויצירת פרופילים פנוטיפיים נוירונליים באמצעות דימוי בעל תוכן גבוה (high-content imaging). המחקר נועד להבהיר וריאציות פנוטיפיות הנובעות ממודולציות גנטיות וכימיות, ובמיוחד בהקשר של מחלת פרקינסון.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- נוירופרמקולוגיה
רקע
- שיפור בפרוטוקולים להביהה של נוירונים דופמינרגיים אנושיים.
- אוטומציה שיפרה את הטיפול ובאתשחזר של נוירונים מובההים.
- האתגרים כוללים הבטחת היכולת למדידה כמותית ושיחזור של פרופילים פנוטיפיים.
- הצורך באיזון בין היתכנות טכנית לבין רלוונטיות פיזיולוגית בפרוטוקולים אוטומטיים.
מטרת המחקר
- לבניית פרופילים פנוטיפיים להבנת השפעות של תרכובות כימיות על נוירונים.
- לבחינת הבדלים בפרופילים פנוטיפיים נוירונליים הקשורים למחלת הפרקינסון.
- לחקירת אינטראקציות של נוירונים דופמינרגיים עם סוגי תאי מוח אחרים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הפלטפורמה העיקרית שבה נעשה שימוש היא תרבית תאים, ובפרט של נוירונים דופמינרגיים אנושיים.
- המודל הביולוגי כולל נוירונים דופמינרגיים של גבעול המוח מתורמים בריאים ומנשאי מוטציה LRRK2 G2019S.
- השיטות כוללות הפשרה, גידול וטיפול בנוירונים, ולאחריהן צביעה והדמיה לצורך ניתוח.
- השלבים המרכזיים כוללים הפשרה של הנוירונים, זריעה בריכוזים שנקבעו וטיפול בתמיסות של תרכובות.
- הודגש השימוש בתוכנת PhenoLink לצורך סגמנטציה של תמונות וחילוץ מאפיינים.
תוצאים עיקריים
- תרבית מוצלחת של נוירונים דופמינרגיים, עם נתוני דימות המאפשרים הפקה של 126 מאפיינים פנוטיפיים.
- אפיון של תגובות נוירונליות לטיפולים שונים, תוך התמקדות ספציפית בהשפעות של מעכבי kinase של LRRK2.
- תובנות לגבי הבדלים פנוטיפיים הקשורים לרקעים גנטיים ולתנאי טיפול.
- ביסוס של שיטה חסונה ליצירת פרופילים פנוטיפיים נוירונליים כמותיים.
מסקנות
- מחקר זה מספק פרוטוקול מקיף לאפיון נוירונים דופמינרגיים אנושיים, המאפשר מחקר רחב יותר של פנוטיפינג נוירונלי.
- השיטה מאפשרת הבנה טובה יותר של מודלים של מחלות, ובמיוחד בנוגע למחלת פרקינסון.
- ההשלכות כוללות נתיבים משופרים למחקרים מכניסטיים על אינטראקציה בין נוירונים ווריאציות פנוטיפיות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
פרופיילינג פנוטיפי של נוירונים דופמינרגיים של הגבלי הגבלי שמקורם בתאי iPSC אנושיים מאפשר הערכה כמותית רב-ממדית של תגובות תאיות הרלוונטיות למחלה במחקר של מחלת פרקינסון. גישה זו מגבירה את הביטחון החזוי בשלבי הגילוי המוקדמים על ידי לכידה של פנוטיפים מורכבים ותמיכה בהפחתת סיכונים מכניסטית לצורך תיקוף מטרות. תהליכי עבודה של דימוי בעל תוכן גבוה (high-content imaging) הניתנים להרחבה מקלים על מיון יעיל של פורטפוליו והשוואה בין תוכניות שונות בקווי פיתוח של ניוון עצבי.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה בלתי מוטה של פנוטיפים נוירונליים הרלוונטיים למחלה לצורך הפחתת סיכונים מכניסטיים.
- תומך בתיקוף תפקודי של מטרות על ידי כימות של מספר סממנים תאיים במקביל.
- מעניק ביטחון תחזיתי בבחירת המטרה באמצעות נתונים פנוטיפיים רב-ממדיים.
- מספק פלטפורמה להשוואה בין שינויים פנוטיפיים מושריים גנטיים לכאלה המושרים על ידי תרכובות.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay Development)
- מספק בדיקות פנוטיפיות סטנדרטיות וניתנות לשחזור באמצעות טיפול אוטומטי בנוזלים והדמיה בקיבולת גבוהה.
- מייצר פלטים כמותיים עבור 126 מאפיינים לצורך הערכה רבת-מסמך של תרכובות.
- מאפשר סריקה ניתנת להרחבה בפורמט של 384 בארות לפיתוח יעיל של בדיקות.
- תומכת בשימוש חוזר בפלטפורמה עבור מחקרי הפרעה גנטית וכימית מגוונים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מיישר פנוטיפים in vitro עם סמנים ביולוגיים הרלוונטיים למחלה לצורך המשכיות תרגומית.
- מאפשר קבלת החלטות על קידום מותאם סיכון על ידי השוואת תגובות עצביות של תאים בריאים לעומת תאים עם מוטציה של מחלה.
- מספק תובנות מכניסטיות לגבי השפעות של תרכובות במערכות עצביות אנושיות.
- מקל על תיקוף צולב עם מודלים פרה-קליניים אחרים כאשר הדבר נתמך על ידי תוצרי פנוטיפיים.
שילוב צינור עיבוד וזרימת עבודה
תהליך עבודה זה לאפיון פנוטיפי מגשר בין שלבי הגילוי המוקדמים, זיהוי מובילים (lead identification) ומחקר פרה-קליני, על ידי מתן אפשרות להערכה כמותית וניתנת לשחזור של פנוטיפים נוירונליים במערכות הרלוונטיות למחלה.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות ובהבהרת מסלולים באמצעות קריאות פנוטיפיות רב-ממדיות.
- סריקה: מספקת מוכנות של בדיקות ושחזור באמצעות פלטפורמות דימוי אוטומטיות בעלות תוכן גבוה.
- אנליטיקה: מספקת מדידות כמותיות ופלטים סטטיסטיים להשוואה חסונה של תנאים.
- מחקר תרגומי: מקשרת פנוטיפים in vitro לסממנים ביולוגיים של מחלות לצורך התאמה פרה-קלינית.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה ניתנת להרחבה ולשימוש חוזר עבור פרופיל פנוטיפי נוירונלי תמיכתי במספר תוכניות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכנית במחקר של ניוון עצבי.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של זרימות עבודה למען הדירות ויכולת הרחבה בהגדרות של תפוקה גבוהה.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מושכלת של המשך או עצירה (go/no-go) וניהול פורטפוליו יעיל מבחינת הון.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים ובקידום של נכסים בתחום הניוון העצבי.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בתרביות תאי גזע, דיפרנציאציה עצבית וניתוח דימויים בעתירה גבוהה (high-content imaging).
- נחוש גישה למערכות אוטומטיות לטיפול בנוזלים, מיקרוסקופיה קונפוקלית ותוכנות מתקדמות לניתוח תמונות.
- דורש סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי צביעה, דימוי ועיבוד נתונים.
- התאמה לסוגי תאי עצבים אחרים או למודלים של מחלות עשויה לדרוש אופטימיזציה של הפרוטוקול.
- איזון בין אוטומציה לרלוונטיות פיזיולוגית הוא קריטי לקבלת תוצרי פנוטיפיים אמינים.
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
0:00
Introduction
2:05
Thawing Human iPSC‐Derived mDA Neurons for Seeding
4:22
Human iPSC‐Derived mDA Neurons Seeding and Compound Treatment for Phenotypic Profiling
6:53
Image Processing of Fluorescently‐Stained Human iPSC‐Derived mDA Neurons for Phenotypic Profile Generation
