Name: שימוש בעציצים מעור העופות לחקר תבניות רקמות ואורגנוגנזה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-15T12:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: חקור תבניות רקמות ואורגנוגנזה בעזרת עציצי עור עוברי עופות. השיטה מאפשרת ניתוח תהליכים מולקולריים ותאיים בזמן אמת באמצעות הדמיה תלת-ממדית לקידום הרפואה הרגנרטיבית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכת על ידי מענק NIH NIAMS R37 AR 060306, R01 AR 047364 ו-RO1 AR078050. העבודה נתמכת גם על ידי חוזה מחקר משותף בין USC והאוניברסיטה הרפואית של סין בטייוואן. אנו מודים למחלקת USC BISC 480 Developmental Biology 2023 על בדיקה מוצלחת של פרוטוקול תרבית עור עופות זה במהלך מספר מודולי מעבדה.

1. תרבית צמחילת עור עוף (איור 1)
<ol><li>לדגור על ביצי תרנגולות מופרות באינקובטור לח בטמפרטורה של 38 מעלות צלזיוס ולשלב אותן על פי המבורגר והמילטון14.<ol><li>בשלב 28 (~E5.5), הספרה השנייה והבוהן השלישית של הגפה ארוכות יותר מהאחרות; שלוש ספרות וארבע בהונות מובחנות.</li>
		<li>בשלב 29 (~E6), הכנף כפופה במרפק; הספרה השנייה ארוכה באופן מובהק מהאחרות.</li>
		<li>בשלב 30 (~E6.5), שתי שורות ניצני נוצה גביים משני צדי חוט השדרה נראות ברמה הברכיאלית ושלוש שורות נראות בגובה הרגליים.</li>
		<li>בשלב 31 (~E7), יש ~ 7 שורות של נוצות ברמות הג'מבו-סקרל.</li>
		<li>בשלב 32, אחת עשרה שורות או יותר של ניצני נוצות נמצאים בגובה הרגליים.</li>
	</ol></li>
	<li>הניחו עובר עוף שלב 28-32 בצלחת פטרי בקוטר 60 מ"מ המכילה תמיסת מלח חוצצת של הנקס (HBSS) או מלח חוצץ פוספט (PBS).<ol><li>נתחו את העור הגבי העוברי בין הצוואר התחתון לאזור הזנב. השתמש מספריים כדי להסיר את הראש מהצוואר. משכו בעדינות את ניצני הגפיים כדי למקם את הצד הגחוני של הגוף כלפי מטה כאשר התוספתן מתפשט כלפי חוץ.</li>
		<li>בצע חתך קדמי עד אחורי בעור לאורך שני הצדדים של גוף העובר באמצעות מלקחיים של שען או מספריים קפיציים חדים. הקפד לייצב את הגוף עם זוג מלקחיים על ידי צביטת ניצני הגפיים לאורך. מקלפים בעדינות את העור מהצוואר לאזור הזנב או מהזנב לצוואר באמצעות מלקחיים של שען.</li>
	</ol></li>
	<li>מסירים בעדינות את הרקמות התת עוריות שנותרו מחוברות לעור המקולף ומחליקים את קצוות העור בעזרת מספריים קפיציים חדים.</li>
	<li>הוסף 2 מ"ל / באר של מדיום הנשר המעובד של דולבקו (DMEM) בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי (FBS) ותמיסת פניצילין/סטרפטומיצין (מדולל 1:100) לבאר בצלחת של 6 בארות. לאחר הוספת המדיום והאנטיביוטיקה, מניחים בתוך הבאר תוספת תרבית רקמה סטרילית, כך שהמדיה נמצאת בצד החיצוני של תוספת התרבית.</li>
	<li>מעבירים את העור עם מרית לתרבית עם האפידרמיס עם הפנים כלפי מעלה והמזנכימה עם הפנים כלפי מטה על קרום ההחדרה. כדי להבטיח שהעור יהיה שטוח ללא קמטים, משכו את העור אל המרית ב-HBSS. להחליק את העור מן המרית עם הנוזל כדי להקל על העברת העור ללא קיפול.</li>
	<li>הסר עודפי HBSS מהתרבית עם פיפטה של 200 μL. השאירו שכבה דקה של HBSS בתוך תוספת התרבית כדי לשמור על הצמח רטוב למחצה כדי לספק ממשק אוויר-נוזל.</li>
	<li>יש לדגור על תרביות צמחי העור בטמפרטורה של 37°C תוך שימוש ב-5%CO2 ו-95% אוויר. שנה את המדיום כל יומיים. הערה: הליך זה פורסם4. מערכת תרבית זו יכולה לשמש גם עם העור של ציפורים אחרות כגון שליו או פרוש עור פרוש תרביות.</li>
</ol>2. רקומבינציה אפיתל-מזנכימלית של עור עוף (איור 2)
<ol><li>לדגור על ביצי תרנגולות מופרות באינקובטור לח ב 38 מעלות צלזיוס ולשלב את העוברים על פי המבורגר והמילטון14 (סעיף 1.1).</li>
	<li>הכינו 2 סוגי מלח ללא סידן מגנזיום (CMF) עם מאגר של 0.25% חומצה אתילאנדיאמין-טטראצטית (EDTA).<ol><li>יצירת חיץ CMF 10x (NaCl (1.37 מטר) 80 גרם, KCl (0.04 מטר) 3 גרם, NaH2PO4 (0.004 מטר) 0.5 גרם, KH2PO4 (2 מטר) 0.25 גרם, NaHCO3 (0.12 מטר) 10 גרם, גלוקוז (0.1 מטר) 20 גרם ב-1,000 מ"ל מים מזוקקים. התאם את ה- pH ל- 7.3. כדי לייצר 100 מ"ל של 2x CMF עם חיץ EDTA 0.25%, יש להמיס תחילה את ה- EDTA ב- 80 מ"ל מים מזוקקים, ולאחר מכן להוסיף 20 מ"ל של חיץ CMF 10x כדי ליצור 2x CMF עם פתרון עבודה של 0.25% EDTA.</li>
	</ol></li>
	<li>יש לנתח קליפות גביות של עוברי תרנגולות בשלב 30-32 ב-HBSS כמתואר לעיל (סעיף 1.2) ולדגור עליהן במי מלח CMF 2x עם 0.25% EDTA על קרח למשך 15-20 דקות.</li>
	<li>הפרידו בזהירות את האפיתל והמזנכימה באמצעות מלקחיים של שען. מעבירים את האפיתל והמזנכימה המופרדים לצלחת נקייה המכילה HBSS.</li>
	<li>שלבו מחדש את האפיתל עם המזנכימה על ידי הנחת המזנכימה תחילה על צלחת פטרי המכילה HBSS, ולאחר מכן הניחו את האפיתל על גבי המזנכימה. מקם את האפיתל לאורך אותו ציר קדמי-אחורי כמו המזנכימה או סובב את האפיתל 90o מהציר הקדמי-אחורי של המזנכימה כדי לקבוע איזה מרכיב מווסת היבטים שונים של מורפוגנזה של העור.</li>
	<li>מעבירים את הקליפות המשולבות מחדש לתוספות תרבית בצלחות תרבית של 6 בארות לגדילה ומסירים עודפי HBSS סביב העור המחודש.</li>
	<li>מניחים 2 מ"ל של מדיום תרבית DMEM עם 10% FBS בבאר מחוץ לתוספת. הניחו שכבה דקה של DMEM בתוך תא ההחדרה כדי לשמור על העציץ רטוב למחצה כדי לספק ממשק אוויר-נוזל.</li>
	<li>יש לדגור על רקומביננטים בעור בטמפרטורה של 37°C בתערובת של 5%CO2 ו-95% אוויר. שנה את המדיום כל יומיים. תעדו שינויים פנוטיפיים בשלבי העור הראשוניים של התפתחות העור באמצעות צילום בהילוך מהיר עם מצלמה המותקנת על מיקרוסקופ מנתח. הערה: הליך זה פורסם11.</li>
</ol>3. בנייה מחדש של עור עוף (איור 3)
<ol><li>לדגור על ביצי תרנגולות מופרות באינקובטור לח ב 38 מעלות צלזיוס ולשלב את העוברים על פי המבורגר והמילטון14 (סעיף 1.1).</li>
	<li>לנתח שלב 30-33 עורות עוברי תרנגולת ב- HBSS. יש לדגור על הקליפות במי מלח 2x CMF עם 0.25% EDTA על קרח למשך 15-20 דקות כמתואר לעיל (סעיף 2.3).</li>
	<li>הפרידו בזהירות את האפיתל והמזנכימה באמצעות מלקחיים של שען. מעבירים את האפיתל והמזנכימה המופרדים ל-HBSS על קרח. הערה: היזהר שלא לפגוע בשכבת הבסיס של האפיתל בעת הפרדת האפיתל מהמזנכימה.</li>
	<li>יש לאסוף את המזנכימה המופרדת בצינור צנטריפוגה בנפח 15 מ"ל ולדגור על תמיסת קולגן/טריפסין 0.1% המיוצרת ב-PBS באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10-15 דקות.</li>
	<li>לנתק את mesenchyme העור עם פיפט פסטר כדי להפוך את ההשעיה תא יחיד. הוסף DMEM עם 10% FBS כדי לעצור את העיכול.</li>
	<li>גלולה וצנטריפוגה את התאים ב 233 × גרם במשך 5 דקות. השהה מחדש את התאים עם מדיום תרבית בריכוז של 2 × 107 תאים / מ"ל. הערה: בשלב זה, ניתן גם להשעות מחדש את התאים המזנכימליים בתווך המכיל וירוס למשך 2-3 שעות על קרח לצורך העברת גנים.</li>
	<li>מניחים תרבית תאים בבאר אחת של צלחת 6 בארות. טיפה 10 μL של 2 × 107 תאים / mL תאים מזנכימליים על תרבית הרקמה להוסיף. מניחים 2 מ"ל של מדיום תרבית DMEM עם 10% FBS בבאר מחוץ לתוספת. יש לדגור על התאים המזנכימליים המצופים בטמפרטורה של 37°C באמצעות אינקובטור אוויר של 5%CO2 ו-95% למשך שעה אחת כדי לאפשר לתאים להתיישב על קרום ההחדרה.</li>
	<li>מעבירים את האפיתל השלם על גבי הטיפה המזנכימלית המצופה כאשר שכבת תאי הבסיס של האפיתל פונה לתאים המזנכימליים באמצעות פיפט 1 מ"ל. הערה: בעת העברת אפיתל לטיפה המזנכימלית, אין להפריע לתאים המזנכימליים.</li>
	<li>משטחים את האפיתל השלם מעל המזנכימה כדי לגרום לעור המשוחזר לצמח. השאירו שכבה דקה של המדיום על האינסרט כדי לשמור על העור המשוחזר חצי-רטוב כדי לספק ממשק אוויר-נוזל. יש לדגור על העור המשוחזר בטמפרטורה של 37°C באינקובטור אוויר של 5%CO2 ו-95%. שנה את המדיום כל יומיים. הערה: הליך זה פורסם13.</li>
</ol>

סקירה מקיפה של פרוטוקולי תרבית צמחילת עור עוברי בעופות

<ol><li>Lucas, A. M., Stettenheim, P. R. Avian anatomy: Integument part I and part II. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLucas%2C+AM+%22Agriculture+Handbook%22">Agriculture Handbook</a>. 362, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture, Washington D.C.. (1972).</li>
<li>Sengel, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSengel%2C+P+%22In+Morphogenesis+of+Skin%2C+l-277%22">In Morphogenesis of Skin, l-277</a>. , Cambridge Univ. Press. New York. (1976).</li>
<li>Dhouailly, D., Wilehm Roux, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+cutaneous+appendages+in+dermo-epidermal+recombinations+between+reptiles%2C+birds+and+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Formation of cutaneous appendages in dermo-epidermal recombinations between reptiles, birds and mammals.</a> Archives of Developmental Biology. 177 (4), 323-340 (1975).</li>
<li>Jiang, T. -X., Chuong, C. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+feather+morphogenesis%3A+I.+Analyses+with+antibodies+to+Adhesion+Molecules+Tenascin%2C+N-CAM+and+Integrin%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanism of feather morphogenesis: I. Analyses with antibodies to Adhesion Molecules Tenascin, N-CAM and Integrin.</a> Developmental Biology. 150 (1), 82-98 (1992).</li>
<li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shaping+organs+by+a+Wnt+%2F+Notch+%2F+non-muscle+myosin+module+which+orients+feather+bud+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%2C+USA%22%5BJournal%5D)">Shaping organs by a Wnt / Notch / non-muscle myosin module which orients feather bud elongation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 110 (16), E1452-E1461 (2013).</li>
<li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+oscillations+coordinate+feather+mesenchymal+cell+movement+by+SHH+dependent+modulation+of+gap+junction+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Calcium oscillations coordinate feather mesenchymal cell movement by SHH dependent modulation of gap junction networks.</a> Nature Communications. 9 (1), 5377(2018).</li>
<li>Ting-Berreth, S. A., Chuong, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+delivery+of+TGF+beta2+can+restore+epithelium+dependent+organization+of+mesenchymal+condensation+during+skin+appendage+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Local delivery of TGF beta2 can restore epithelium dependent organization of mesenchymal condensation during skin appendage morphogenesis.</a> Developmental Biology. 179 (2), 347-359 (1996).</li>
<li>Widelitz, R. B., Jiang, T. -X., Noveen, A., Chen, C. -W. J., Chuong, C. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF+induces+new+feather+buds+from+developing+avian+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigation+Dermatology%22%5BJournal%5D)">FGF induces new feather buds from developing avian skin.</a> Journal of Investigation Dermatology. 107 (6), 797-803 (1996).</li>
<li>Rawles, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+interactions+in+scale+and+feather+development+as+studies+in+dermal-epidermal+recombinations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Embryology+and+Experimental+Morphology%22%5BJournal%5D)">Tissue interactions in scale and feather development as studies in dermal-epidermal recombinations.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 11, 765-789 (1963).</li>
<li>McAleese, S. R., Sawyer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correcting+the+phenotype+of+the+epidermis+from+chick+embryos+homozygous+for+the+gene+scaleless+%28sc%2Fsc%29%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Correcting the phenotype of the epidermis from chick embryos homozygous for the gene scaleless (sc/sc).</a> Science. 214 (4524), 1033-1034 (1981).</li>
<li>Chuong, C. M., Widelitz, R. B., Ting-Berreth, S., Jiang, T. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+events+during+avian+skin+appendage+regeneration%3A+dependence+on+epithelial-mesenchymal+interaction+and+order+of+molecular+reappearance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Early events during avian skin appendage regeneration: dependence on epithelial-mesenchymal interaction and order of molecular reappearance.</a> J Invest Dermatol. 107 (4), 639-646 (1996).</li>
<li>Jiang, T. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+feather+orientations+changed+by+electric+current%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Global feather orientations changed by electric current.</a> iScience. 24 (6), 102671(2021).</li>
<li>Jiang, T. X., Jung, H. S., Widelitz, R. B., Chuong, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+of+periodic+patterns+by+dissociated+feather+mesenchymal+cells+and+the+regulation+of+size%2C+number+and+spacing+of+primordia%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Self-organization of periodic patterns by dissociated feather mesenchymal cells and the regulation of size, number and spacing of primordia.</a> Development. 126 (22), 4997-5009 (1999).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Morphology%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 188, 49-92 (1951).</li>
<li>Chen, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+of+early+odontogenic+signaling+pathway+in+Aves%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%2C+USA%22%5BJournal%5D)">Conservation of early odontogenic signaling pathway in Aves.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 97 (18), 10044-10049 (2000).</li>
<li>Chuong, C. -M., Ting, S. A., Widelitz, R. B., Lee, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+Skin+Morphogenesis%3A+II.+Retinoic+acid+gradient+modulates+axis+orientation+and+phenotypes+of+skin+appendages%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mechanism of Skin Morphogenesis: II. Retinoic acid gradient modulates axis orientation and phenotypes of skin appendages.</a> Development. 115 (3), 839-852 (1992).</li>
<li>Noveen, A., Jiang, T. -X., Chuong, C. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+A+and+protein+kinase+C+modulators+have+reciprocal+effects+on+mesenchymal+condensation+during+skin+appendage+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein kinase A and protein kinase C modulators have reciprocal effects on mesenchymal condensation during skin appendage morphogenesis.</a> Developmental Biology. 171 (2), 677-693 (1995).</li>
<li>Wu, X. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembly+of+biological+networks+via+adaptive+patterning+revealed+by+avian+intradermal+muscle+network+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%2C+USA%22%5BJournal%5D)">Self-assembly of biological networks via adaptive patterning revealed by avian intradermal muscle network formation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 116 (22), 10858-10867 (2019).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.

רקומבינציה רקמות מספק בדיקה כדי לחקור את התרומות הייחודיות של אפיתל ו mesenchyme. בתרנגולות, הנוצות מתחילות להתפתח ביום העוברי 7 (E7) ואילו הקשקשים מתחילים ב-E9. כאשר מזנכימה בקנה מידה E9 משולבת מחדש עם אפיתל נוצות E7, הרקמה המשולבת מחדש יוצרת קשקשים, וכאשר מזנכימה נוצה E7 משולבת מחדש עם נוצות אפיתל בקנה מידה E9 נוצרות11. מחקרים אלה הוכיחו כי המזנכימה שולטת בריווח היווצרות הדפוסים ובזהות האיברים. כמובן, אפיתל חייב להיות מוכשר כדי להיות מסוגל לקבל ולפרש את האותות mesenchymal כראוי. היכולת קיימת רק ...

התפתחות עור עובר העופות היא מודל מצוין לחקר מנגנוני המורפוגנזה בגלל הדפוסים השונים והנגישות למיקרו-כירורגיה ומניפולציה 1,2. עם זאת, הערכת אירועים תאיים ומולקולריים ברקמות שלמות יכולה להיות קשה מכיוון שנוכחות של רקמות חיצוניות יכולה לסבך תצפיות מיקרוסקופיות. יתר על כן, היכולת לתמרן ביטוי גנים כדי לבחון את תפקידם במורפוגנזה של העור אינה תמיד משימה פשוטה. אנו מוצאים שאנו יכולים לבדוק תפקודי גנים באמצעות התמרה רטרו-ויראלית עם שיעור הצלחה גבוה יותר באמצעות מודלים של צמחי עור. כאן אנו דנים ביתרונות של שלושה מודלים explant העור שפותחו.
תרבית עור עופות עוברית היא מערכת רבת עוצמה להערכת התנהגות תאים, בקרת גנים ותפקוד במהלך התפתחות ניצני נוצות העור 3,4,5,6. הוא מאפשר להעריך את המנגנונים המולקולריים של התפתחות ניצני הנוצות באמצעות הוספה גלובלית של גורמי גדילה המוצבים במדיה התרבותית או שחרורם המקומי מחרוזים מצופים גורמי גדילה. ניתן גם לתפעל גנים רגולטוריים התפתחותיים באמצעות התמרה של גנים נגיפיים של צורות שליליות שלמות או דומיננטיות עבור מחקרים פונקציונליים המעריכים את תפקידם באירועים מורפוגנטיים ספציפיים 7,8.
תרבית רקומבינציה אפיתל-מזנכימלית של עופות מאפשרת לחוקרים לקבוע את תרומתו של כל מרכיב עור בשלבים המוקדמים של מורפוגנזה של העור. השימוש של רולס בגישה זו גילה כי יחסי הגומלין בין המזנכימה והאפיתל חיוניים ליצירת נספחי עור9. המזנכימה יכולה ליצור עיבויים והאפיתל נחוץ כדי לגרום ולתחזק תצורות עיבוי מזנכימליות2. מאוחר יותר, גישה זו שימשה כדי להעריך מדוע תרנגולות חסרות קשקשים אינן מצליחות ליצור נוצות. הפגם התגלה במזנכימה10. Dhouailly ביצע מחקרי רקומת רקמה אפיתל-מזנכימלית בעוברים ממינים שונים. מחקרים אלה סיפקו תובנות התפתחותיות ואבולוציוניות על תקשורת אפיתל-מזנכימלית המקדמת מורפוגנזה של העור3.
מחקר זה שימש להבנה טובה יותר של גורמים השולטים בצמיחת נוצות. השיטה גם משפרת את ההדמיה של אירועים תאיים ומולקולריים המעורבים בעיצוב העור המתרחשים במהלך ייזום נוצות, התפתחות והתארכות לאורך הציר הקדמי-אחורי. כאשר האפיתל מופרד מהמזנכימה ושני המרכיבים משולבים מחדש, אינטראקציות חדשות מבססות מחדש את דפוסי העור. גישה זו מאפשרת לנו להעריך אותות מעוררי מזנכימליה ומולקולות כשירות אפיתל המאפשרות לאפידרמיס להגיב לאותות המזנכימליים11. ניתן לבחון גם את הביטוי המולקולרי העוקב במורד הזרם הדרוש להתפתחות ניצני נוצות וליצירת תבניות. מחקרים אלה קבעו כי מיקום הניצנים נשלט על ידי המזנכימה. סיבוב של אפיתל 90o לפני recombination עם mesenchyme מדגים כי כיוון התארכות ניצן נוצה נשלט על ידי אפיתל. שיטה זו הייתה חיונית עבורנו כדי לחקור את המנגנון המולקולרי המווסת את כיוון ניצני הנוצות12.
תרבית בנייה מחדש של עור העופות, שבה מזנכימה של העור מנותקת לתאים בודדים לפני ציפוי בצפיפות תאים גבוהה ומכוסה באפיתל שלם, מאפסת את תאי העור למצב קדמוני. לאחר מכן האקספלנט מתארגן בעצמו כדי ליצור תבנית מחזורית חדשה שאינה תלויה ברמזים הקודמים13. מודל זה של בנייה מחדש של העור יכול לשמש לחקר התהליכים הראשוניים של דפוס תקופתי נוצות. השתמשנו בגישה זו כדי לחקור כיצד אפנון היחס בין תאים מזנכימליים לחתיכה אחת של אפיתל יכול להשפיע על גודל או מספר ניצני נוצות. נמצא כי מספר הניצנים גדל, אך לא גודל הניצנים, ככל שהיחס בין התאים המזנכימליים גדל. יתרון נוסף לגישה זו הוא שהתמרה נגיפית של תאים מזנכימליים מראה יעילות גבוהה יותר מאשר בשני תנאי התרבית האחרים ויכולה לייצר פנוטיפים ברורים יותר.

<table><tbody><tr><td>צלחת תרבית 6 בארות&nbsp;</td><td>Falcon</td><td>REF 353502</td><td>תרביות ממשק אוויר-נוזל (ALI) &nbsp;</td></tr><tr><td>הכנסת תרבית תאים&nbsp;</td><td>פלקון</td><td>REF 353090.</td><td>0.4 ומיקרו; m קולגנאז קרום PET שקוף</td></tr><tr><td>סוג 1</td><td>וורת'ינגטון ביוכימי</td><td>LS004196</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s שונה Eagle' s בינוני&nbsp;</td><td>קורנינג</td><td>10-013-CV</td><td>4.5 גרם/ליטר גלוקוז</td></tr><tr><td>חומצה אתילנדיאמינטטראצטית דיסודיום מלח דיהידראט (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>ThermoFisher</td><td>16140-071</td><td></td></tr><tr><td>גלוקוז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>הנקס' s תמיסת מלח חוצצת</td><td>Gibco</td><td>14170-112</td><td>ללא סידן, ללא מגנזיום</td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15-140-122</td><td></td></tr><tr><td>פוגסיום פוספט מונו-בסיסי (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5379</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן כלורי (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>נתרן ביקרבונט (NaHCO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי (Nacl)</td><td>EMD&nbsp;</td><td>CAS 7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פוספט מונו-בסיסי (NaH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0751</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Gibco</td><td>27250-042</td><td></td></tr></tbody></table>

שימוש בעציצים מעור העופות לחקר תבניות רקמות ואורגנוגנזה

Using Avian Skin Explants to Study Tissue Patterning and Organogenesis

עור העופות המתפתח במהלך האמבריוגנזה הוא מודל ייחודי שיכול לספק תובנות חשובות על דפוסי רקמות. כאן מתוארות שלוש וריאציות על תרביות צמחי עור כדי לבחון היבטים שונים של התפתחות העור. ראשית, תרביות איברים ומניפולציות אקס ויו מציעות לחוקרים הזדמנויות להתבונן ולחקור את התפתחות ניצני הנוצות ישירות. תרבית צמחי העור יכולה לגדול במשך 7 ימים, מה שמאפשר ניתוח ישיר של התנהגות התא והדמיה 4D במרווחי זמן במהלך תקופת גדילה זו. זה גם מאפשר מניפולציות פיזיות ומולקולריות של תנאי תרבית כדי לדמיין את תגובת הרקמות. לדוגמה, ניתן ליישם חרוזים מצופים בגורם גדילה באופן מקומי כדי לגרום לשינויים בדוגמת הנוצות באזור מוגבל. לחלופין, התמרה ויראלית יכולה להיות מועברת ברחבי העולם במדיה התרבית כדי להעלות או להוריד את ביטוי הגנים. שנית, פרוטוקול רקומבינציית העור מאפשר לחוקרים לחקור אינטראקציות רקמה בין האפידרמיס למזנכימה שמקורן באזורי עור שונים, שלבי חיים שונים או ממינים שונים. זה נותן הזדמנות לבחון את חלון הזמן שבו האפיתל מוכשר להגיב לאותות ואת יכולתו ליצור נספחי עור שונים בתגובה לאותות ממקורות מזנכימליים שונים. שלישית, בנייה מחדש של העור באמצעות תאי עור מנותקים המכוסים באפיתל שלם מאפסת את התפתחות העור ומאפשרת לחקור את התהליכים הראשוניים של דפוסים תקופתיים. גישה זו גם משפרת את יכולתנו לתמרן את ביטוי הגנים בין התאים המנותקים לפני יצירת צמח העור המשוחזר. מאמר זה מספק את שלושת פרוטוקולי התרבות וניסויים לדוגמה כדי להדגים את תועלתם.

תרביות צמחי עור התפתחות ניצני נוצות מתרביות איברי עור ex vivo ניתן לצפות ישירות תחת המיקרוסקופ. באמצעות מודל תרבית צמחי העור של עור הגב בשלב 30 של עוף, הפלקודים נראים לאורך קו האמצע. לאחר מכן החזית המורפוגנטית מתפשטת בהדרגה לרוחב לכיוון פריפריית העור עם היווצרות פרימורדיה חדשה של נוצות. קדמוניות הנוצות האלה יתפתחו לניצני נוצות קצרים לאחר יומיים בתרבית ולניצני נוצות ארוכים לאחר 4 ימים בתרבית (איור 1).
תרביות רקומבינציה של העור</...

במאמר זה אנו מתארים פרוטוקולים לשלושה סוגים של תרביות צמחי עור עובריים של עופות שניתן להשתמש בהם כדי לבחון אינטראקציות בין רקמות, סרט צילום בהילוך מהיר של הדמיה 4D (3D plus time), הפרעה גלובלית או מקומית של תפקוד מולקולרי ואפיון ביולוגיה של מערכות.

The developing avian skin during embryogenesis is a unique model that can provide valuable insights into tissue patterning. Here three variations on skin ...

מטרת המחקר של צוות המחקר שלי היא להבין את התפתחות הרקמה ואת ההתחדשות. מטרה זו חשובה במיוחד במחקר תאי הגזע כיום. אנו מקווים להבין את העקרונות כיצד נוצר איבר.והידע הזה הוא לא רק לעזור לנו להבין את הטבע, אלא גם יכול להיות מיושם כדי לעזור רפואה רגנרטיבית. האתגר העומד בפנינו הוא להבין את התהליך המולקולרי והתאי המעורב בתהליכים מורפוגנטיים אלה. לכן, אנו זקוקים למערכת תרבית צמחים כדי לנתח תהליכים מולקולריים ותאיים בקפידה, מכיוון שלא ניתן לעשות זאת in vivo.כדי להשלים את פער הידע הזה, מדענים פיתחו דרכים שונות של תרביות אורגנואידים. בתרבית אורגנואידים נוכל לבצע תנועת תאים קולקטיבית כדי לראות כיצד תאים מתקשרים זה עם זה. אנו גם מסוגלים לתמרן את התאים כך שהם יבטאו מולקולות שונות כדי לבחון את תפקוד המולקולות.הגישה הייחודית בה אנו משתמשים היא תרבית צמחי עור עוף. עור תרנגולת משמש מכיוון שהם נגישים בקלות מהביצה והם יוצרים ניצני נוצות נפרדים, מסודרים בתבנית משושה כקריאה לתבניות רקמות. ישנן שלוש דרכים בהן אנו עושים את התרבות, כפי שתראו.האחת היא להחזיק את תרבית הצמחים, לאפשר לנו לצלם את הסרטים או להעביר מולקולות שיפריעו למערכת. שנית, כדי לחקור את תרומתם של אפיסיליה או מזנזים, אנו יכולים לפרק אותם ולהחזיר אותם. שלישית, כדי לאתגר עוד יותר את היכולת של כל תא, אנו מנתקים אותם לתאים בודדים ובודקים כיצד הם חוזרים להתארגן מחדש לתבניות הרקמה.באמצעות גישות אלה, הצלחנו להשיג הבנה חדשה כלפי תבנית הרקמה.

using-avian-skin-explants-to-study-tissue-patterning-and-organogenesis

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

במאמר זה, אנו מציגים מתודולוגיה פשוטה כדי לאפשר לטווח...

לשעבר אובו העובר עוף התרבות מתאים ליישומים הדמיה microsurgery מערכת

מאמר זה מתאר השתלת רקמות טכניקה שנועדה לבדוק את איתות ותכונות של דפוסים האאקטודרם משטח cephalic במהלך הפיתוח craniofacial.

הערכת נכסים איתות של Ectodermal epithelia במהלך פיתוח Craniofacial

מאמר זה מספק גישה מעודכן למערכת כמירה שליו-עוף קלאסית ללמוד היווצרות האיברים, על ידי שילוב של הרומן במבחנה , ב ovo בצרות.

גישה דו-שלבית לחקור ו מאוחר-בשלבים המוקדמים של היווצרות האיברים במודל העופות: בלוטת התימוס, בלוטות יותרת התריס Organogenesis הפרדיגמה

כאן, אנו מציגים organotypic culturing פרוטוקול לגדול עוף עובריים באיברים במבחנה. באמצעות שיטה זו, התפתחות עובריים עוף רקמות ניתן יהיה ללמוד, תוך שמירה על רמה גבוהה של שליטה על הסביבה תרבות.

שיטת Organotypic תרבות ללמוד על התפתחות עובריים עוף רקמות

מאמר זה מספק שיטה לבודד טהור עובריים רקמות מעוברים שליו ועוף שניתן לשלבם לטופס ex-vivo האיברים chimeric.

בידוד של רקמות עובריים ועל היווצרות האיברים Chimeric שליו-עוף לפי הדוגמה בלוטת התימוס

מאמר זה מתאר טכניקת השתלת רקמות שנועדה לבחון את תכונות האיתות והדפוס של המוח הקדמי הבסיסי במהלך התפתחות הגולגולת.

יצירת כימרות במוח הקדמי של העופות להערכת התפתחות הפנים

הגוזל הוא אורגניזם מודל חסכוני, נגיש וזמין באופן נרחב למגוון מחקרים. כאן מפורטת סדרה של פרוטוקולים להבנת המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס ההתפתחות וההתחדשות של האוזן הפנימית של העופות.

בשיטות אובו ואקס אובו לחקר התפתחות האוזן הפנימית של העופות

עובר Xenopus laevis ממשיך להיות שימושי במיוחד בחקר ההתפתחות המוקדמת בשל גודלו הגדול וקלות המניפולציה שלו.   מסופק פרוטוקול פשוט לפרוטוקול הכלאה של הרכבה שלמה באתרו שניתן להשתמש בו בזיהוי איברים ספציפיים במערכת מודל זו.

הבנת organogenesis המוקדם שימוש פשוטה<em&gt; באתר</em&gt; הכלאת פרוטוקול ב<em&gt; Xenopus</em

keratocytes דג הזברה להעביר בגיליונות תא מexplants ולספק מודל במבחנה לחקר המנגנונים של נדידת תאים קולקטיבית בהקשר של ריפוי פצע אפיתל. פרטים אלה פרוטוקולי דרך יעילה להקמת תרבויות explant עיקריות לשימוש במבחני נדידת תאים קולקטיביים.

Explants Keratocyte דג הזברה לחקר הגירה קולקטיבית סלולארי וReepithelialization בריפוי פצע עורית

תרבית הטיפות הזקופות ex vivo היא אלטרנטיבה לטכניקות הניסוי הנוכחיות in vitro ו-in vivo. פרוטוקול זה קל לביצוע ודורש כמויות קטנות יותר של ריאגנטים, תוך מתן אפשרות לתפעל ולחקור כלי דם עובריים, מורפוגנזה ואורגנוגנזה.

שימוש<em&gt; Ex Vivo</em&gt; תרבויות הזקופה טיפה של איברים העובר שלמים לחקר תהליכים התפתחותיים בעכבר organogenesis

חקור תבניות רקמות ואורגנוגנזה בעזרת עציצי עור עוברי עופות. השיטה מאפשרת ניתוח תהליכים מולקולריים ותאיים בזמן אמת באמצעות הדמיה תלת-ממדית לקידום הרפואה הרגנרטיבית.

שימוש בעציצים מעור העופות לחקר תבניות רקמות ואורגנוגנזה

גלה סרטונים נוספים