Name: הכנה וצביעה אימונופלואורסצנטית של צרורות ותאי סיבים בודדים מקליפת המוח וגרעין עדשת העין (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-09T14:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 8 s
Description: למד הכנה וצביעה אימונופלואורסצנטית של צרורות ותאי סיבים בודדים מקליפת המוח וגרעין עדשת העין. שיטה זו מאפשרת חקר ארכיטקטורת הממברנה ומאפיינים ביומכניים של העדשה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענק R01 EY032056 (ל- CC) מהמכון הלאומי לעיניים. המחברים מודים לד"ר תרזה פאסל וקימברלי ונדרפול במתקן סקריפס למיקרוסקופיה על עזרתם בתמונות מיקרוסקופ אלקטרונים.

עכברים טופלו על בסיס פרוטוקול בעלי חיים שאושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת אינדיאנה בבלומינגטון. העכברים ששימשו ליצירת נתונים מייצגים היו חיות ביקורת (מסוג בר) ברקע C57BL6/J, נקבות ובנות 8-12 שבועות. ניתן להשתמש הן בעכברים זכרים והן בנקבות לניסוי זה, מאחר שהסבירות שמין העכברים תשפיע על תוצאות הניסוי נמוכה מאוד.
1. דיסקציה של עדשה ועריפת ראשים
<ol><li>המתת חסד של עכברים בעקבות "המדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה" של המכונים הלאומיים לבריאות וכן פרוטוקולים לשימוש בבעלי חיים שאושרו על ידי המוסד. הערה: במחקר הנוכחי, עכברים הומתו על ידי מנת יתר של CO2 ואחריה פריקת צוואר הרחם בהתאם לפרוטוקול מאושר של בעלי חיים (אוניברסיטת אינדיאנה).</li>
	<li>לחנך את העיניים מהעכברים באמצעות מלקחיים מעוקלים על ידי דיכוי הרקמה סביב העיניים עם צד אחד של המלקחיים כדי להזיז את העין מחוץ לשקע. לאחר מכן, סגור את המלקחיים מתחת לעין והרים כדי להסיר את העין מהשקע. העבירו את העיניים למי מלח טריים חוצצי פוספט (PBS) במגש דיסקציה.</li>
	<li>חותכים את עצב הראייה עם מספריים עדינים במיוחד קרוב ככל האפשר לגלגל העין. יש להחדיר בזהירות פינצטה ישרה בעלת קצה דק לתוך גלגל העין דרך יציאת עצב הראייה בחלק האחורי של העין.</li>
	<li>מכניסים בזהירות מספריים באותו מיקום כמו הפינצטה בשלב 1.3 ומתחילים לחתוך חתך מהאחורי לכיוון צומת הקרנית-סקלרלית. הערה: עדשות מכרסמים תופסות ~30% מהעיניים. נזק מקרי יתרחש אם הפינצטה או המספריים מוחדרים עמוק מדי לתוך העין.</li>
	<li>ממשיכים לחתוך לאורך צומת הקרנית-סקלרלית עד להפרדת לפחות מחצית הצומת.</li>
	<li>השתמש בפינצטה כדי ללחוץ בעדינות על הקרנית כך שהעדשה תוכל לצאת דרך החתך שנעשה בשלבים 1.4 ו -1.5.</li>
	<li>הסר בזהירות חתיכות גדולות של רקמה מהעדשה באמצעות פינצטה ישרה בעלת קצה עדין. בדוק את העדשה כדי למצוא את האזור המשווני.</li>
	<li>ניקבו את העדשה בצורה רדודה באמצעות פינצטה ישרה בעלת קצה דק, ולאחר מכן הסירו את קפסולת העדשה. המסה של תאי סיבי העדשה תישאר שלמה, והחד-שכבה האפיתל של העדשה תישאר מחוברת לכמוסת העדשה. יש להשליך את כמוסת העדשה.</li>
</ol>2. צביעת תא סיב בודד בעדשה
<ol><li>העבירו את מסת תאי סיבי העדשה לצלחת באר עם 500 μL של תמיסת 1% פרפורמלדהיד (PFA; ב-1x PBS) ודגרו על הדגימות בטמפרטורה של 4°C למשך הלילה עם אגוז עדין (איור 2A). הערה: הנפחים עבור הפתרונות שניתנו מותאמים ללוחות של 48 בארות. אם משתמשים בצלחת או צינורות בגודל אחר, התאימו את נפחי הפתרונות בהתאם. תמיסות קיבוע, חסימה ושטיפה (1x PTX, 0.1% Triton X-100 ב-1x PBS) יוצרו עם 10x PBS ומים מזוקקים כפול (ddH2O) לריכוז סופי של 1x PBS.</li>
	<li>העבירו את תאי סיבי העדשה לצלחת של 60 מ"מ עם 1% PFA. השתמשו באזמל חד כדי לפצל את כדור תאי הסיבים לשניים לאורך הציר הקדמי-אחורי שלו (איור 2B). חותכים את החצאים לשניים שוב לאורך אותו ציר כדי לייצר רבעים. הערה: הציר הקדמי-אחורי מזוהה בקלות על ידי כיוון תאי הסיבים במסת הרקמה.</li>
	<li>השתמשו בפינצטה ישרה כדי להסיר את אזור הגרעין מרבעי תאי סיבי העדשה (איור 2C). הערה: אזור גרעין העדשה קשיח בעדשות מכרסמים, ומרכז העדשה ייפרד בקלות מסיבי קליפת המוח הרכים יותר.</li>
	<li>לאחר מכן תקן את רבעי אזור קליפת המוח של העדשה ב- 200 μL של 1% PFA למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר (RT) עם טלטול עדין (300 סל"ד בשייקר צלחת).</li>
	<li>שטפו את רבעי הרקמה פעמיים ב-750 מיקרוליטר של 1x PBS במשך 5 דקות כל אחד עם טלטול עדין ב-RT.</li>
	<li>חסום את הדגימות באמצעות 200 μL של תמיסת חסימה (5% סרום, 0.3% Triton X-100, 1x PBS) למשך שעה אחת ב- RT עם טלטול עדין. הערה: עבור הנתונים המייצגים בפרוטוקול זה, הדגימות לא הוכתמו בנוגדנים ראשוניים או משניים. לאחר שלב החסימה, הדגימות הודגרו עם אגלוטינין נבט חיטה (WGA; 1:100) ופאלואידין (1:100) (ראה טבלת חומרים) במשך 3 שעות ב- RT עם טלטול עדין והגנה מפני אור. צביעת נוגדנים ראשונית הודגמה בפרסומים קודמים22,23.</li>
	<li>יש לדגור עם 100 μL של תמיסת נוגדנים ראשונית למשך הלילה ב-4°C עם רעידות עדינות. הערה: הנוגדנים מדוללים בתמיסת חסימה. לעומת שקופיות עם קטעי רקמות, יש יותר תאים בסוג זה של הכנה. יש להגדיל את ריכוזי הנוגדנים הראשוניים כדי לספק נוגדנים בשפע כדי להכתים תאים נוספים. מומלץ להכפיל את ריכוז הנוגדנים ממה שמשתמשים בו על חלקי רקמות. כנ"ל לגבי נוגדנים משניים.</li>
	<li>שטפו את רבעי הטישו שלוש פעמים עם 1x PTX (0.1% Triton X-100, 1x PBS) במשך 5 דקות כל אחד ב-RT עם רעד עדין.</li>
	<li>לדגור על תאי הסיבים עם 100 μL של נוגדן/תמיסת צבע משנית במשך 3 שעות ב- RT עם ניעור עדין. הגן על הדגימות מפני אור במהלך שלב זה והשלבים הבאים. הערה: ניתן להוסיף WGA, פאלואדין וצבעים פלואורסצנטיים אחרים לתמיסת הנוגדנים המשנית לתיוג סימולטני של קרום התא, השלד הציטו-שלד או אברונים אחרים תוך סימון הנוגדן הראשוני.</li>
	<li>שטפו את תאי הסיבים ארבע פעמים עם PTX אחד במשך 5 דקות כל אחד ב-RT עם ניעור עדין.</li>
	<li>הוסף טיפה אחת או 50 מיקרוליטר של מדיית הרכבה לשקופית מיקרוסקופ טעונה פלוס לפני העברת רבעי הרקמה לשקופית.</li>
	<li>השתמשו בפינצטה כדי להפריד בעדינות את תאי הסיבים זה מזה ונסו להגביל את החפיפה בין צרורות התאים.</li>
	<li>החל בעדינות כיסוי #1.5 על גבי הדגימה במדיית הרכבה. אמצעי ההרכבה צריכים להתפשט לקצה הכיסוי; אם מצב זה אינו מתרחש, הוסף אמצעי הרכבה נוספים לקצה הכיסוי. יש לשאוף החוצה את עודפי אמצעי ההרכבה סביב קצה הכיסוי ולהשתמש בלק כדי לאטום את קצוות הכיסוי במגלשה. הערה: כל סוג של אמצעי הרכבה המנוסח עבור מיקרוסקופ קונפוקלי יכול לשמש לניסויים אלה.</li>
</ol>3. גרעין עדשה צביעת תא סיב בודד
<ol><li>השלם את הדיסקציה המתוארת בסעיף 1.</li>
	<li>הסר באופן מכני את סיבי קליפת המוח מהכדור של תאי סיבי העדשה, ועוזב את גרעין העדשה, על ידי העברה עדינה של מסת תא הסיבים לקצות אצבעות רטובות וכפפות וגלגול עדין של מסת הרקמה. הערה: בעדשות עכבר, גלגול כדור תאי סיבי העדשה בין קצות אצבעות הכפפות הוא שיטה יעילה להסרת תאי סיבי קליפת המוח מגרעין העדשה הקשה28,30. עבור עדשות שבהן שיטה מכנית זו אינה יעילה, ניתן להשתמש בדיסקציה זהירה או בשיטת מערבולות29 כדי להסיר את תאי סיבי קליפת המוח.</li>
	<li>העבירו את גרעין העדשה לתמיסת 1% PFA טרייה בצלחת טובה ודגרו למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C עם ניעור עדין.</li>
	<li>מעבירים את הדגימה לצלחת 60 מ"מ עם 1% PFA ומשתמשים באזמל חד כדי לפצל את גרעין העדשה לאורך הציר הקדמי-אחורי. הפחיתו שוב את דגימות הרקמה בחצי כדי לייצר רבעי גרעין.</li>
	<li>בצע את התהליך המתואר בשלבים 2.4-2.13 עבור immunostaining והרכבה דגימה.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65638/65638fig02v2.jpg"> איור 2: סיכום גרפי המפרט את ההכנה והצביעה החיסונית של תאי סיבי העדשה . (A) לוחית זו, בעלת 48 בארות, קודדה בצבע לפי עמודה כדי להדגים את הגדרת לוח הדגימה עבור השיטות המתוארות, ומאפשרת העברה קלה של דגימות בין שלבי החיסון השונים על ידי טיפול עדין באמצעות מלקחיים. בעוד הנתונים המייצגים עבור פרוטוקול זה אינם מודגרים עם נוגדן ראשוני, התרשים כולל עמודה עבור דגירה נוגדנים ראשוניים, ואת הבארות לשטיפה ניתן לעשות שימוש חוזר לאחר הסרת מאגרי כביסה משומשים על ידי שאיפה. (B) לאחר קיבוע מסת תאי סיבי העדשה, הרקמה מפוצלת לאורך הציר הקדמי-אחורי (קווים מקווקווים אדומים) כדי לשמר את המבנה המקורי של התאים. לאחר שמסת הרקמה נחתכה בחצי, הדגימות מסובבות והחצאים מפוצלים לרבעים לאורך הציר הקדמי-אחורי (קווים מקווקווים אדומים). (C) הסרת אזור גרעין העדשה (בוורוד) נעשית בקלות באמצעות פינצטה כדי לחפור את הרקמה המרכזית הצפופה מתאי הסיבים בקליפת המוח (בכחול). דיאגרמות מצוירות נוצרו בחלקן באמצעות BioRender.com ולא צוירו בקנה מידה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65638/65638fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

צביעה אימונופלואורסצנטית של אינטרדיגיטציות ממברנות בתאי סיבי עדשה

<ol><li>Lovicu, F. J., McAvoy, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+factor+regulation+of+lens+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Growth factor regulation of lens development.</a> Developmental Biology. 280 (1), 1-14 (2005).</li>
<li>Kuszak, J., Alcala, J., Maisel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+surface+morphology+of+embryonic+and+adult+chick+lens-fiber+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">The surface morphology of embryonic and adult chick lens-fiber cells.</a> The American Journal of Anatomy. 159 (4), 395-410 (1980).</li>
<li>Kuszak, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ultrastructure+of+epithelial+and+fiber+cells+in+the+crystalline+lens%5BTitle%5D)+AND+%22International+Review+of+Cytology%22%5BJournal%5D)">The ultrastructure of epithelial and fiber cells in the crystalline lens.</a> International Review of Cytology. 163, 305-350 (1995).</li>
<li>Kuszak, J. R., Macsai, M. S., Rae, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereo+scanning+electron+microscopy+of+the+crystalline+lens%5BTitle%5D)+AND+%22Scanning+Electron+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Stereo scanning electron microscopy of the crystalline lens.</a> Scanning Electron Microscopy. , 1415-1426 (1983).</li>
<li>Lo, W. K., Harding, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Square+arrays+and+their+role+in+ridge+formation+in+human+lens+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ultrastructure+Research%22%5BJournal%5D)">Square arrays and their role in ridge formation in human lens fibers.</a> Journal of Ultrastructure Research. 86 (3), 228-245 (1984).</li>
<li>Taylor, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+of+the+normal+human+lens%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Morphology of the normal human lens.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 37 (7), 1396-1410 (1996).</li>
<li>Vrensen, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+of+the+human+eye+lens-a+morphological+point+of+view%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Biochemistry+and+Physiology.+Part+A%2C+Physiology%22%5BJournal%5D)">Aging of the human eye lens-a morphological point of view.</a> Comparative Biochemistry and Physiology. Part A, Physiology. 111 (4), 519-532 (1995).</li>
<li>Vrensen, G. F., Duindam, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+of+fiber+membranes+in+the+human+eye+lens.+Ultrastructural+and+Raman+microspectroscopic+observations%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Research%22%5BJournal%5D)">Maturation of fiber membranes in the human eye lens. Ultrastructural and Raman microspectroscopic observations.</a> Ophthalmic Research. 27, 78-85 (1995).</li>
<li>Willekens, B., Vrensen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+three-dimensional+organization+of+lens+fibers+in+the+rabbit.+A+scanning+electron+microscopic+reinvestigation%5BTitle%5D)+AND+%22Albrecht+von+Graefe%27s+Archive+for+Clinical+and+Experimental+Opthalmology%22%5BJournal%5D)">The three-dimensional organization of lens fibers in the rabbit. A scanning electron microscopic reinvestigation.</a> Albrecht von Graefe's Archive for Clinical and Experimental Opthalmology. 216 (4), 275-289 (1981).</li>
<li>Willekens, B., Vrensen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+three-dimensional+organization+of+lens+fibers+in+the+rhesus+monkey%5BTitle%5D)+AND+%22Graefe%27s+Archive+for+Clinical+and+Experimental+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">The three-dimensional organization of lens fibers in the rhesus monkey.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 219 (3), 112-120 (1982).</li>
<li>Zhou, C. J., Lo, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+clathrin%2C+AP-2+adaptor+and+actin+cytoskeleton+with+developing+interlocking+membrane+domains+of+lens+fibre+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Association of clathrin, AP-2 adaptor and actin cytoskeleton with developing interlocking membrane domains of lens fibre cells.</a> Experimental Eye Research. 77 (4), 423-432 (2003).</li>
<li>Kuwabara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+maturation+of+the+lens+cell%3A+a+morphologic+study%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">The maturation of the lens cell: a morphologic study.</a> Experimental Eye Research. 20 (5), 427-443 (1975).</li>
<li>Weeber, H. A., Eckert, G., Pechhold, W., vander Heijde, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stiffness+gradient+in+the+crystalline+lens%5BTitle%5D)+AND+%22Graefe%27s+Archive+for+Clinical+and+Experimental+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Stiffness gradient in the crystalline lens.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 245 (9), 1357-1366 (2007).</li>
<li>Weeber, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+mechanical+properties+of+human+lenses%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Dynamic mechanical properties of human lenses.</a> Experimental Eye Research. 80 (3), 425-434 (2005).</li>
<li>Weeber, H. A., vander Heijde, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+relationship+between+lens+stiffness+and+accommodative+amplitude%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">On the relationship between lens stiffness and accommodative amplitude.</a> Experimental Eye Research. 85 (5), 602-607 (2007).</li>
<li>Heys, K. R., Cram, S. L., Truscott, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massive+increase+in+the+stiffness+of+the+human+lens+nucleus+with+age%3A+the+basis+for+presbyopia%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Massive increase in the stiffness of the human lens nucleus with age: the basis for presbyopia.</a> Molecular Vision. 10, 956-963 (2004).</li>
<li>Heys, K. R., Friedrich, M. G., Truscott, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presbyopia+and+heat%3A+changes+associated+with+aging+of+the+human+lens+suggest+a+functional+role+for+the+small+heat+shock+protein%2C+alpha-crystallin%2C+in+maintaining+lens+flexibility%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Presbyopia and heat: changes associated with aging of the human lens suggest a functional role for the small heat shock protein, alpha-crystallin, in maintaining lens flexibility.</a> Aging Cell. 6 (6), 807-815 (2007).</li>
<li>Glasser, A., Campbell, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biometric%2C+optical+and+physical+changes+in+the+isolated+human+crystalline+lens+with+age+in+relation+to+presbyopia%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Research%22%5BJournal%5D)">Biometric, optical and physical changes in the isolated human crystalline lens with age in relation to presbyopia.</a> Vision Research. 39 (11), 1991-2015 (1999).</li>
<li>Pierscionek, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+response+of+human+lenses+to+stretching+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Age-related response of human lenses to stretching forces.</a> Experimental Eye Research. 60 (3), 325-332 (1995).</li>
<li>Biswas, S. K., Lee, J. E., Brako, L., Jiang, J. X., Lo, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junctions+are+selectively+associated+with+interlocking+ball-and-sockets+but+not+protrusions+in+the+lens%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Gap junctions are selectively associated with interlocking ball-and-sockets but not protrusions in the lens.</a> Molecular Vision. 16, 2328-2341 (2010).</li>
<li>Lo, W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquaporin-0+targets+interlocking+domains+to+control+the+integrity+and+transparency+of+the+eye+lens%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Aquaporin-0 targets interlocking domains to control the integrity and transparency of the eye lens.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (3), 1202-1212 (2014).</li>
<li>Cheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tropomyosin+3.5+protects+the+F-actin+networks+required+for+tissue+biomechanical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Tropomyosin 3.5 protects the F-actin networks required for tissue biomechanical properties.</a> Journal of Cell Science. 131 (23), (2018).</li>
<li>Cheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tropomodulin+1+regulation+of+actin+is+required+for+the+formation+of+large+paddle+protrusions+between+mature+lens+fiber+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Tropomodulin 1 regulation of actin is required for the formation of large paddle protrusions between mature lens fiber cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (10), 4084-4099 (2016).</li>
<li>Kuszak, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+lens+sutures%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">The development of lens sutures.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 14 (2), 567-591 (1995).</li>
<li>Bassnett, S., Costello, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cause+and+consequence+of+fiber+cell+compaction+in+the+vertebrate+lens%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">The cause and consequence of fiber cell compaction in the vertebrate lens.</a> Experimental Eye Research. 156, 50-57 (2017).</li>
<li>Biswas, S., Son, A., Yu, Q., Zhou, R., Lo, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breakdown+of+interlocking+domains+may+contribute+to+formation+of+membranous+globules+and+lens+opacity+in+ephrin-A5%28-%2F-%29+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Breakdown of interlocking domains may contribute to formation of membranous globules and lens opacity in ephrin-A5(-/-) mice.</a> Experimental Eye Research. 145, 130-139 (2016).</li>
<li>Blankenship, T., Bradshaw, L., Shibata, B., Fitzgerald, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+specializations+emerging+late+in+mouse+lens+fiber+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Structural specializations emerging late in mouse lens fiber cell differentiation.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (7), 3269-3276 (2007).</li>
<li>Cheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+changes+in+eye+lens+biomechanics%2C+morphology%2C+refractive+index+and+transparency%5BTitle%5D)+AND+%22Aging%22%5BJournal%5D)">Age-related changes in eye lens biomechanics, morphology, refractive index and transparency.</a> Aging. 11 (24), 12497-12531 (2019).</li>
<li>Cheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EphA2+affects+development+of+the+eye+lens+nucleus+and+the+gradient+of+refractive+index%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">EphA2 affects development of the eye lens nucleus and the gradient of refractive index.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 63 (1), 2(2022).</li>
<li>Cheng, C., Gokhin, D. S., Nowak, R. B., Fowler, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+application+of+glass+coverslips+to+assess+the+compressive+stiffness+of+the+mouse+lens%3A+strain+and+morphometric+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Sequential application of glass coverslips to assess the compressive stiffness of the mouse lens: strain and morphometric analyses.</a> Journal of Visualized Experiments. (111), e53986(2016).</li>
<li>Forrester, J. V., Dick, A. D., McMenamin, P. G., Roberts, F., Pearlman, E. Anatomy of the eye and orbit. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aForrester%2C+JV+%22The+Eye+%28Fourth+Edition%29%22">The Eye (Fourth Edition)</a>. Saunders, W. B. , 1(2016).</li>
<li>Cheng, C., Nowak, R. B., Fowler, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lens+actin+filament+cytoskeleton%3A+Diverse+structures+for+complex+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">The lens actin filament cytoskeleton: Diverse structures for complex functions.</a> Experimental Eye Research. 156, 58-71 (2017).</li>
<li>Goldberg, M. W., Fiserova, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunogold+labeling+for+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Immunogold labeling for scanning electron microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 1474, 309-325 (2016).</li>
<li>Goldberg, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+scanning+electron+microscopy+and+immuno-gold+labeling+of+the+nuclear+lamina+and+nuclear+pore+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">High-resolution scanning electron microscopy and immuno-gold labeling of the nuclear lamina and nuclear pore complex.</a> Methods in Molecular Biology. 1411, 441-459 (2016).</li>
<li>Hermann, R., Walther, P., Muller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunogold+labeling+in+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Immunogold labeling in scanning electron microscopy.</a> Histochemistry and Cell Biology. 106 (1), 31-39 (1996).</li>
<li>Gokhin, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tmod1+and+CP49+synergize+to+control+the+fiber+cell+geometry%2C+transparency%2C+and+mechanical+stiffness+of+the+mouse+lens%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Tmod1 and CP49 synergize to control the fiber cell geometry, transparency, and mechanical stiffness of the mouse lens.</a> PLoS One. 7 (11), e48734(2012).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

פרוטוקול זה הדגים את שיטות הקיבוע, השימור והצביעה החיסונית המשמרת נאמנה את המורפולוגיה של הממברנה התלת-ממדית של צרורות או תאי סיבי עדשה בודדים מעומקים שונים בעדשה. סיבי העדשה המוכתמים מושווים לתכשירי SEM המשמשים זה מכבר לחקר המורפולוגיה של תאי סיבי העדשה. התוצאות מראות מבני קרום דומים בין שני התכשירים. EM נותר תקן הזהב לחקר מורפולוגיה של תאים, אך תיוג חיסוני מאתגר יותר בדגימות SEM עבור לוקליזציה של חלבונים33,34,35 ודורש מיקרוסקו...

העדשה היא רקמה שקופה וביצית בחדר הקדמי של העין שמורכבת משני סוגי תאים, תאי אפיתל ותאי סיבים 1 (איור 1). יש monolayer של תאי אפיתל המכסה את ההמיספרה הקדמית של העדשה. תאי סיבים נבדלים מתאי אפיתל ומהווים את עיקר העדשה. תאי הסיבים המתמחים עוברים תהליך התארכות, התמיינות והבשלה, המתבטא בשינויים ברורים במורפולוגיית קרום התא מפריפריית העדשה למרכז העדשה 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 ידוע גם בשם גרעין העדשה., תפקידה של העדשה למקד אור עדין המגיע ממרחקים שונים אל הרשתית תלוי בתכונותיה הביומכניות, כולל קשיחות ואלסטיות 13,14,15,16,17,18,19. האינטרדיגיטציות המורכבות של סיבי העדשה הועלו20,21 ולאחרונה הוכחו כחשובות לנוקשות העדשה22,23.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65638/65638fig01.jpg"> איור 1: דיאגרמות אנטומיה של עדשה ותמונות של מיקרוסקופ אלקטרונים סורק מייצג (SEM) מסיבי עדשה. הקריקטורה מראה מבט אורכי (קדמי עד אחורי מלמעלה למטה) של השכבה הקדמית של תאי אפיתל (מוצללת בתכלת) ומסה גדולה של תאי סיבי עדשה (לבן). מרכז העדשה (מוצלל בוורוד) ידוע כגרעין והוא מורכב מתאי סיבים דחוסים מאוד. מימין, קריקטורה בחתך רוחב חושפת את צורת תא המשושה המוארך של סיבי עדשה הארוזים בתבנית חלת דבש. לתאי סיבים יש שני צדדים רחבים וארבעה צדדים קצרים. תמונות SEM מייצגות לאורך החלק התחתון מראות את האינטרדיגיטציות המורכבות של הממברנה בין תאי סיבי העדשה בעומקים שונים של העדשה. מימין, סיבי עדשה חדשים שנוצרו בשולי העדשה הם בעלי בליטות קטנות לאורך הצדדים הקצרים וכדורים ושקעים לאורך הצד הרחב (קופסאות אדומות). במהלך ההתבגרות, סיבי העדשה מפתחים אזורי משוטים גדולים המעוטרים על ידי בליטות קטנות לאורך הצדדים הקצרים (קופסאות כחולות). תאי סיבים בוגרים הם בעלי תחומי משוט גדולים המודגמים על ידי בליטות קטנות. תחומים שלובים אלה חשובים לתכונות ביומכניות של העדשה. לתאי סיבים בגרעין העדשה יש פחות בליטות קטנות לאורך הצדדים הקצרים שלהם ויש להם אינטרדיגיטציות מורכבות של לשון וחריץ (קופסאות סגולות). הצדדים הרחבים של התא מציגים מורפולוגיה של קרום כדורי. הקריקטורה שונתהמ-22,32 ולא צוירה בקנה מידה. סרגל קנה מידה = 3 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65638/65638fig01large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
העדשה גדלה על ידי הוספת קליפות של תאי סיבים חדשים על גבי הדורות הקודמים של סיבים24,25. לתאי סיבים יש צורת חתך משושה מוארכת עם שתי צלעות רחבות וארבע צלעות קצרות. תאים אלה משתרעים מהקוטב הקדמי לקוטב האחורי של העדשה, ובהתאם למין, סיבי העדשה יכולים להיות באורך של כמה מילימטרים. כדי לתמוך במבנה של תאים מוארכים ורזים אלה, אינטרדיגיטציות מיוחדות לאורך הצדדים הרחבים והקצרים יוצרות מבנים שלובים כדי לשמור על צורת העדשה ועל התכונות הביומכניות. שינויים בצורת קרום התא במהלך התמיינות ובגרות תאי סיבים תועדו בהרחבה על ידי מחקרי מיקרוסקופ אלקטרונים (EM) 2,3,4,5,6,7,8,9,10,20,26,27,28,29 . לתאי סיבים שזה עתה נוצרו יש כדורים ושקעים לאורך הצדדים הרחבים שלהם עם בליטות קטנות מאוד לאורך הצדדים הקצרים שלהם, בעוד שלסיבים בוגרים יש בליטות משתלבות ומשוטים לאורך הצדדים הקצרים שלהם. סיבים גרעיניים מציגים אינטרדיגיטציות של לשון וחריץ ומורפולוגיה של קרום כדורי. מעט ידוע על החלבונים הדרושים לממברנות שלובות מורכבות אלה. מחקרים קודמים על לוקליזציה של חלבונים בתאי סיבים הסתמכו על מקטעי רקמת העדשה, שאינם מאפשרים הדמיה ברורה של ארכיטקטורת התא המורכבת.
עבודה זו יצרה ושכללה שיטה חדשנית לקיבוע בודדים וצרורות של תאי סיבי עדשה כדי לשמר את המורפולוגיה המורכבת ולאפשר צביעה חיסונית של חלבונים בקרום התא ובתוך הציטופלסמה. שיטה זו משמרת נאמנה את ארכיטקטורת קרום התא, הדומה לנתונים ממחקרי EM, ומאפשרת צביעה בנוגדנים ראשוניים לחלבונים ספציפיים. בעבר יש לנו סיבי עדשה קורטיקלית חיסונית שעוברים התמיינות והתבגרות22,23. בפרוטוקול זה קיימת גם שיטה חדשה להכתמת תאי סיבים מגרעין העדשה. פרוטוקול זה פותח את הדלת להבנת מנגנוני היווצרות ושינויים באינטרדיגיטציות של ממברנות במהלך הבשלת תאי סיבים ודחיסת גרעין העדשה.

<table><tbody><tr><td>100% Triton X-100</td><td>FisherScientific</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>60mm plate</td><td>FisherScientific</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>16% paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>10X phosphate buffered saline</td><td>ThermoFisher</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>1X phosphate buffered saline</td><td>ThermoFisher</td><td>14190136</td><td></td></tr><tr><td>48-well plate</td><td>CytoOne</td><td>CC7672-7548</td><td></td></tr><tr><td>Cover slips (22 x 40 mm)</td><td>FisherScientific</td><td>12-553-467</td><td></td></tr><tr><td>Curved tweezers</td><td>World Precision Instruments</td><td>501981</td><td></td></tr><tr><td>Dissection microscope</td><td>Carl Zeiss</td><td>Stereo Discovery V8</td><td></td></tr><tr><td>Fine tip straight tweezers</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72707-01</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides</td><td>FisherScientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>LSM 800 confocal microscope with Airyscan (63X) and Zen 3.5 Software</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nail polish</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Normal donkey serum</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin (rhodamine)</td><td>ThermoFisher</td><td>R415</td><td></td></tr><tr><td>Primary antibody</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scalpel Feather Disposable, steril, No. 11</td><td>VWR</td><td>76241-186</td><td></td></tr><tr><td>Secondary antibody</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Straight forceps</td><td>World Precision Instruments</td><td>11252-40</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific&nbsp;Nunc MicroWell MiniTrays (dissection tray)</td><td>FisherScientific</td><td>12-565-154</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-fine scissors</td><td>World Precision Instruments</td><td>501778</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Wheat germ agglutinin (fluorescein)</td><td>Vector Laboratories</td><td>FL-1021-5</td><td></td></tr></tbody></table>

הכנה וצביעה אימונופלואורסצנטית של צרורות ותאי סיבים בודדים מקליפת המוח וגרעין עדשת העין

Preparation and Immunofluorescence Staining of Bundles and Single Fiber Cells from the Cortex and Nucleus of the Eye Lens

העדשה היא איבר שקוף ואליפסואידי בחדר הקדמי של העין שמשנה צורה כדי למקד אור עדין על הרשתית ליצירת תמונה ברורה. חלק הארי של רקמה זו מורכב מתאי סיבים מיוחדים, ממוינים, בעלי חתך משושה ונמשכים מהקוטב הקדמי ועד האחורי של העדשה. תאים ארוכים ורזים אלה מנוגדים מאוד לתאים שכנים ויש להם אינטרדיגיטציות מורכבות לאורך התא. המבנים השלובים המיוחדים נדרשים לתכונות ביומכניות רגילות של העדשה ותוארו בהרחבה באמצעות טכניקות של מיקרוסקופ אלקטרונים. פרוטוקול זה מדגים את השיטה הראשונה לשימור ואימונוסטיין יחיד כמו גם צרורות של תאי סיבי עדשה עכבריים כדי לאפשר לוקליזציה מפורטת של חלבונים בתוך תאים בעלי צורה מורכבת זו. הנתונים המייצגים מראים צביעה של תאי הסיבים ההיקפיים, המתמיינים, הבוגרים והגרעיניים בכל אזורי העדשה. שיטה זו יכולה לשמש באופן פוטנציאלי על תאי סיבים שבודדו מעדשות של מינים אחרים.

תאי סיבי העדשה מוכנים מקליפת המוח של העדשה (סיבים מתמיינים וסיבים בוגרים) ומהגרעין, והתאים מוכתמים בפלואידין עבור F-אקטין ו-WGA עבור קרום התא. תערובת של צרורות תאים או סיבי עדשה בודדים (איור 3) נצפית ומצולמת. מקליפת המוח של העדשה נמצאים שני סוגי תאים (איור 3A). תאי סיבים מתמיינים בפריפריה של העדשה הם ישרים, עם בליטות קטנות מאוד לאורך הצדדים הקצרים שלהם. ככל שהתא מתמיין, תאי הסיבים הופכים גליים עם בליטות משתלבות קטנות. יתר על כן, לאורך תהליך ההתבגרות, תאי סיבים ל...

פרוטוקול זה מתאר שיטות להכנת תאי סיבי עדשת עין היקפיים, בוגרים וגרעיניים לצביעת אימונופלואורסנציה כדי לחקור אינטרדיגיטציות מורכבות בין תאים ואת ארכיטקטורת הממברנה.

The lens is a transparent and ellipsoid organ in the anterior chamber of the eye that changes shape to finely focus light onto the retina to form a clear ...

העדשה היא איבר אליפסואידי שקוף בחדר הקדמי של העין, והיא אחראית על מיקוד עדין של האור על הרשתית ליצירת תמונה ברורה. תפקידה של העדשה מסתמך על תכונותיה הביומכניות, אינטרדיגיטציות מורכבות בין תאי סיבי העדשה הוכחו לאחרונה כחשובות לנוקשות העדשה. בעוד המורפולוגיה המיוחדת של תאי סיבי עדשה תוארה בעבר במיקרוסקופ אלקטרונים, מעט ידוע על החלבונים הדרושים לממברנות שלובות אלה.מחקרים קודמים הסתמכו על קטעי רקמת עדשה, שאינם מאפשרים הדמיה ברורה של ארכיטקטורת תאים מורכבת. יצרנו ושכללנו טכניקה חדשנית לשימור נאמן של האינטרדיגיטציות המורכבות של הממברנות בין תאי סיבי העדשה לצורך צביעה והדמיה במיקרוסקופ קונפוקלי של חלבונים ספציפיים. בפרוטוקול זה קיימת גם שיטה חדשה להכתמת תאי הסיבים ממרכז העדשה, הידועה גם בשם גרעין העדשה.שיטה זו פותחת את הדלת להבנת התמיינות ובגרות תאי סיבים על ידי לימוד מנגנוני היווצרות ושינויים באינטרדיגיטציות של ממברנה.

preparation-immunofluorescence-staining-bundles-single-fiber-cells

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

במצבים ביולוגיים וקליניים רבים הוא יתרון ללמוד תהליכים תאיים כמו שהם להתפתח microenvironment הולדתם. כאן אנו מתארים את הרכבה ושימוש מיקרוסקופ סיב אופטי בעלות נמוכה אשר יכול לספק הדמיה בזמן אמת בתרבות התא, מחקרים בבעלי חיים, ומחקרים קליניים המטופל.

רזולוציה גבוהה סיבים אופטיים עבור Microendoscopy באתרו נייד הדמיה

טכניקות להדמית cytoarchitecture רשתית ישירות בסמוך לאלקטרודות בודדות בתוך ממריץ רשתית.

טכניקות לעיני עיבוד השתלה תותבת רשתית לניתוח Histopathological מרוכזות

הפרוטוקול המתואר כאן מיועד להערכה מבנית של תכשיר רשתית שלם. זה כולל תיאורים של דיסקציה של רקמות, הרכבה על תוספת ממברנה פוליטטרפלואורואתילן הידרופילית (PTFE), העמסת בולוס עם סמנים פלואורסצנטיים, והשוואה של קיבוע עם קרבודימיד ופרפורמלדהיד לניתוח אימונוהיסטוכימי של רכיבים תאיים וסינפטיים.

פרוטוקול אופטימלי עבור רשתית Wholemount הכנה להדמיה ואימונוהיסטוכימיה

נדגים שלוש טכניקות להכנת רקמות שונות להמחשת immunohistochemical של pericytes microvascular ברשתית עכברוש, קרי, הקפאה-סעיפים, שלם-טעינות בידוד היפוטוניק של רשת כלי הדם.

הקפאה-מקטעי רשתית, שלם-טעינות, וההכנות להערכת מבודד היפוטוניק להמחשת Immunohistochemical של Microvascular Pericytes

פרוטוקולים אלה פותחו כדי לנתח מורפולוגיה עדשה קורטיקלית, שלמות מבנית של התפרים העדשה דג זברה בעדשות קבועות וחיות למדוד את המיקום של גרעין העדשה דג זברה לאורך הציר האחורי הקדמי.

הערכה של השפות הגרעין של העדשה Zebrafish ושלמות הsutural

הפרוטוקולים הנוכחיים מתארים הדמיה חדשה של הר שלם להדמיית מבנים היקפיים בעדשת העין עם שיטות לכימות תמונה. פרוטוקולים אלה יכולים לשמש במחקרים כדי להבין טוב יותר את הקשר בין מבנים מיקרוסקולריים של עדשה לבין התפתחות/תפקוד עדשה.

הדמיה של תושבת שלמה כדי להמחיש ולכמת את מבנה העדשה ההיקפית, המורפולוגיה של התא והארגון

פרוטוקול זה מתאר שיטה אמינה להשגת קריוסקציות באיכות גבוהה של עיני ארנב שלמות. הוא מפרט את הליכי הדיסקציה, הקיבוע, ההטבעה והחתך של עין הארנב, אשר עשויים להיות מותאמים בקלות לשימוש בכל מחקר המשתמש באימונוהיסטוכימיה בעיניים גדולות יותר.

השגת קריוקציות באיכות גבוהה של עין ארנב שלמה 

שיטה זו מדמיינת את המבנה הטבעי של סיבי קולגן בגוף הזגוגית באמצעות מיקרוסקופ רפלקטיבי קונפוקלי.

הכנת עיני חזיר למיקרוסקופיה רפלקטיבית קונפוקלית כדי להמחיש את רשת סיבי הקולגן הזגוגית

תאי אפיתל פיגמנט רשתית (RPE) שמקורם בתאי גזע עשויים לשמש ליישומים מרובים, כולל טיפולים מבוססי תאים לניוון רשתית, מידול מחלות ומחקרי תרופות. כאן אנו מציגים פרוטוקול פשוט להפקת RPE מתאי גזע.

גזירה יעילה של תאי הרשתית פיגמנט האפיתל מתאי גזע

פרוטוקול זה מתאר שיטה לבידוד תאים בודדים מעוברי דג הזברה, העשרה לתאים מעניינים, לכידת תאי דג זברה במערכות מולטיפלקס תאים בודדים מבוססות מיקרופלואידית, והערכת ביטוי גנים מתאים בודדים.

בידוד ואפיון של תאים בודדים מעוברים דג הזברה

למד הכנה וצביעה אימונופלואורסצנטית של צרורות ותאי סיבים בודדים מקליפת המוח וגרעין עדשת העין. שיטה זו מאפשרת חקר ארכיטקטורת הממברנה ומאפיינים ביומכניים של העדשה.

הכנה וצביעה אימונופלואורסצנטית של צרורות ותאי סיבים בודדים מקליפת המוח וגרעין עדשת העין

גלה סרטונים נוספים