Name: חסימת PCR מסוג Wild בשילוב עם ריצוף Sanger לאיתור מוטציה סומטית בתדר נמוך (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-23T12:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: למד שיטת PCR מסוג Wild בשילוב עם ריצוף Sanger לאיתור מוטציות סומטיות בתדר נמוך בלימפומה אנגיו-אימונובלסטית. שיטה זו מציעה רגישות גבוהה ועלות נמוכה לאבחון מוטציות בסרטן.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>אופטימיזציה של זיהוי מוטציות בתדר נמוך עם PCR חוסם מסוג פראי

<ol><li>Penn Medicine. Testing for measurable/minimal residual disease (MRD). , Oncolink Team. 
 <a target="_blank" href="https://www.oncolink.org/cancer-treatment/procedures-diagnostic-tests/blood-tests-tumordiagnostic-tests/testing-for-measurable-minimal-residualdisease-mrd">https://www.oncolink.org/cancer-treatment/procedures-diagnostic-tests/blood-tests-tumordiagnostic-tests/testing-for-measurable-minimal-residualdisease-mrd</a> (2019).</li>
<li>Xie, Y., Elaine, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+I+diagnose+angioimmunoblastic+T-cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">How I diagnose angioimmunoblastic T-cell lymphoma.</a> Am J Clin Pathol. 156, 1-14 (2021).</li>
<li>Mariko, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angioimmunoblastic+T-cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Treat+Res%22%5BJournal%5D)">Angioimmunoblastic T-cell lymphoma.</a> Cancer Treat Res. 176, 99-126 (2019).</li>
<li>Daniel, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+2016+revision+to+the+World+Health+Organization+classification+of+myeloid+neoplasms+and+acute+lukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The 2016 revision to the World Health Organization classification of myeloid neoplasms and acute lukemia.</a> Blood. 127 (20), 2391-2405 (2016).</li>
<li>Rita, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+5th+edition+of+the+World+Health+Organization+Classification+of+Haematolymphoid+Tumours+%3A+Lymphoid+Neoplasms%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">The 5th edition of the World Health Organization Classification of Haematolymphoid Tumours : Lymphoid Neoplasms.</a> Leukemia. 36 (7), 1720-1748 (2022).</li>
<li>Hae, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+recurrent+inactivating+mutation+in+RHOA+GTPase+in+angioimmunoblastic+T+cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">A recurrent inactivating mutation in RHOA GTPase in angioimmunoblastic T cell lymphoma.</a> Nat Genet. 46 (4), 371-375 (2014).</li>
<li>Lee, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RHOA+G17V+mutation+in+angioimmunoblastic+T-cell+lymphoma%3AA+potential+biomarker+for+cytological+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Pathol%22%5BJournal%5D)">RHOA G17V mutation in angioimmunoblastic T-cell lymphoma:A potential biomarker for cytological assessment.</a> Exp Mol Pathol. 110, 104294(2019).</li>
<li>Mamiko, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+RHOA+mutation+in+angioimmunoblastic+T+cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Somatic RHOA mutation in angioimmunoblastic T cell lymphoma.</a> Nat Genet. 46 (2), 171-175 (2014).</li>
<li>Palomero, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recurrent+mutations+in+epigenetic+regulators%2C+RHOA+and+FYN+kinase+in+peripheral+T+cell+lymphomas%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Recurrent mutations in epigenetic regulators, RHOA and FYN kinase in peripheral T cell lymphomas.</a> Nat Genet. 46 (2), 166-170 (2014).</li>
<li>Fujisawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+RHOA-VAV1+signaling+in+angioimmunoblastic+T-cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Activation of RHOA-VAV1 signaling in angioimmunoblastic T-cell lymphoma.</a> Leukemia. 32 (3), 694-702 (2018).</li>
<li>Voena, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RHO+family+GTPases+in+the+biology+of+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">RHO family GTPases in the biology of lymphoma.</a> Cells. 8 (7), 646(2019).</li>
<li>Shendure, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+sequencing+an+40%3A+past%2C+present+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">DNA sequencing an 40: past, present and future.</a> Nature. 550 (7676), 345-353 (2017).</li>
<li>Athanasios, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Sanger+sequencing%2C+pyrosequencing%2C+and+melting+curve+analysis+for+the+detection+of+KRAS+mutations%3A+diagnostic+and+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">Comparison of Sanger sequencing, pyrosequencing, and melting curve analysis for the detection of KRAS mutations: diagnostic and clinical implications.</a> J Mol Diagn. 12 (4), 425-432 (2010).</li>
<li>Wu, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+enrichment+of+rare+DNA+variants+via+sequence-selective+and+temperature-robust+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Multiplexed enrichment of rare DNA variants via sequence-selective and temperature-robust amplification.</a> Nat Biomed Eng. 1, 714-723 (2017).</li>
<li>John, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+thermodynamics+of+DNA+structural+motifs%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys+Biomol+Struct%22%5BJournal%5D)">The thermodynamics of DNA structural motifs.</a> Annu Rev Biophys Biomol Struct. 33, 415-440 (2004).</li>
<li>Coren, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR-based+methods+for+the+enrichment+of+minority+alleles+and+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">PCR-based methods for the enrichment of minority alleles and mutations.</a> Clin Chem. 55 (4), 632-640 (2009).</li>
<li>Eliza, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+DNA+in+B-cell+lymphoma%3A+technical+advances%2C+clinical+applications%2C+and+perspectives+for+translational+research%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor DNA in B-cell lymphoma: technical advances, clinical applications, and perspectives for translational research.</a> Leukemia. 36 (9), 2151-2164 (2022).</li>
<li>Lee, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hot-spot-specific+probe+%28HSSP%29+for+rapid+and+accurate+detection+of+KRAS+mutations+in+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors%22%5BJournal%5D)">Hot-spot-specific probe (HSSP) for rapid and accurate detection of KRAS mutations in colorectal cancer.</a> Biosensors. 12 (8), 597(2022).</li>
<li>Matsubara, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+the+G17V+RHOA+mutation+in+angioimmunoblastic+T-cell+lymphoma+and+related+lymphomas+using+quantitative+allele-specific+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Detection of the G17V RHOA mutation in angioimmunoblastic T-cell lymphoma and related lymphomas using quantitative allele-specific PCR.</a> PLoS One. 9 (10), e109714(2014).</li>
<li>Dieffenbach, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+concepts+for+PCR+primer+design%5BTitle%5D)+AND+%22PCR+Methods+Appl%22%5BJournal%5D)">General concepts for PCR primer design.</a> PCR Methods Appl. 3 (3), S30-S37 (1993).</li>
<li>Applied Biosystems. User Guide for Applied Biosystems. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%223730%2F3730xl+DNA+Analyzer%22">3730/3730xl DNA Analyzer</a>. , (2014).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>מחלץ DNA אוטומטי</td><td>9001301</td> גלאי חומצות גרעין <td>DNA Qiagen</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Q32854</td> ערכת הגברה PCR <td>תרמו פישר</td><td></td></tr><tr><td></td><td>P4600</td><td>מכשיר PCR</td><td></td></tr> מרק <tr><td>C1000 מגע</td><td></td><td>ביורד</td><td></td></tr><tr><td>פרוטאינאז K תמיסת</td><td>D3001-2-A</td><td>מחקר</td><td></td></tr><tr><td>zymo חלבון K מאגר אחסון</td><td>D3001-2-C</td><td>zymo מחקר</td><td></td></tr><tr><td>ערכת אנזים הגברת ריצוף</td><td>P7670-FIN</td><td>Qiagen</td><td></td></tr></tbody></table>

חסימת pcr מסוג wild בשילוב עם ריצוף sanger לאיתור מוטציה סומטית בתדר נמוך

Wild-type Blocking PCR Combined with Sanger Sequencing for Detection of Low-frequency Somatic Mutation

השווה את רצף דגימת הבדיקה לרצף הייחוס כדי לקבל את מצב המוטציה של דגימת הבדיקה. טכנולוגיית WBT-PCR מבוססת BDA יכולה לזהות את מוטציית RHOA G17V הידועה ומוטציות אחרות בתדר נמוך במרווח ההגברה של פריימרים במעלה ובמורד הזרם. ראו איור 1. שני גנים נוספים, כלומר IDH2 ו-JAK1, נותחו גם הם באמצעות השיטה הזאת, איור 2 ואיור 3, בהתאמה. התוצאות מראות כי שיטה זו רגישה למדי באיתור מוטציות בתדירות נמוכה.
<img alt="כרומטוגרמה של רצף DNA; PCR מסורתי לעומת WBT-PCR המציג השוואה לזיהוי מוטציות RHOA." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65647/65647fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> איור 1: תוצאת ריצוף עבור RHOA. מלמעלה למטה, האיור מראה את מוטציית הבסיס של אתר RHOA G17 המוגברת על ידי WBT-PCR ואת תוצאות הריצוף לאחר הגברת PCR מסורתית המתאימה ל- RHOA G17 מסוג פראי. התמונה האמצעית מראה את תוצאות הריצוף של מוטציית c.50G&gt;T לאחר הגברה עם פריימרים WBT-PCR כאשר רגישות הגילוי היא 0.5%. התמונה התחתונה מציגה את תוצאות הריצוף של מוטציית c.49-50delinsTT לאחר הגברה עם פריימרים WBT-PCR כאשר רגישות הזיהוי היא 0.5%. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65647/65647fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="WBT-PCR והשוואת כרומטוגרמה PCR מסורתית, c.515G&gt;A זיהוי מוטציות, גן IDH2." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65647/65647fig02v2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> איור 2: תוצאת ריצוף עבור IDH2. מלמעלה למטה, האיור לעיל מראה את מוטציית הבסיס של אתר IDH2 R172 המוגברת על ידי WBT-PCR ואת תוצאות הריצוף לאחר הגברה מסורתית של PCR המתאימה ל- IDH2 R172 מסוג פראי. התמונה העליונה מציגה את תוצאות הריצוף של מוטציית c.515G&gt;A לאחר הגברה עם פריימרים WBT-PCR כאשר רגישות הזיהוי היא 0.5%. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65647/65647fig02largev2.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="השוואת ריצוף DNA, WBT-PCR לעומת PCR מסורתי עבור תרשים ניתוח מוטציות JAK1." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65647/65647fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> איור 3: תוצאת ריצוף עבור JAK1. מלמעלה למטה, האיור לעיל מראה את מוטציית הבסיס של אתר JAK1 S703 שהועצמה על ידי WBT-PCR ואת תוצאות הריצוף לאחר הגברה מסורתית של PCR המתאימה ל- JAK1 S703 מסוג פראי. התמונה העליונה מציגה את תוצאות הריצוף של מוטציית c.2108G&gt;T לאחר הגברה עם פריימרים WBT-PCR כאשר רגישות הזיהוי היא 0.5%. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65647/65647fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>תחל</td>
			<td colspan="2">רצף פריימר</td>
		</tr><tr><td>RHOA-VF</td>
			<td colspan="2">ATAACCTTTTGGTGCCAGGT</td>
		</tr><tr><td>RHOA-VR</td>
			<td colspan="2">GCTGAAGACTATGAGCAAGCA</td>
		</tr><tr><td>RHOA-WTB</td>
			<td colspan="2">AGCAAGCATGTCTTTCCACAGGCAAAA</td>
		</tr><tr><td>פריימר ריצוף</td>
			<td colspan="2">ATAACCTTTTGGTGCCAGGT</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 1: רשימת הפריימר המעוצבת הסופית של RHOA.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>פריימר IDH2 R172</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>תחל</td>
			<td>רצף פריימר</td>
		</tr><tr><td>IDH2-VF</td>
			<td>CTGGTTGAAAGATGGCGGCT</td>
		</tr><tr><td>IDH2-VR</td>
			<td>TACCTGGTCGCCATGGGC</td>
		</tr><tr><td>IDH2-WTB</td>
			<td>GCCATGGGCGTGCCTGCCAAAAT</td>
		</tr><tr><td>פריימר ריצוף</td>
			<td>CTGGTTGAAAGATGGCGGCT</td>
		</tr><tr><td>פריימר גן JAK1</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>תחל</td>
			<td>רצף פריימר</td>
		</tr><tr><td>JAK1-VF</td>
			<td>ACTCTGAGGCCGAGTGTGT</td>
		</tr><tr><td>JAK1-VR</td>
			<td>CCATTATGGACATCAGGACATTC</td>
		</tr><tr><td>JAK1-WTB</td>
			<td>GGACATTCTCACCAAGTAGCTCAGAAAA</td>
		</tr><tr><td>פריימר ריצוף</td>
			<td>ACTCTGAGGCCGAGTGTGT</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 2: רשימת הפריימר המעוצבת הסופית של IDH2 ו - JAK1.

חסימת PCR מסוג Wild בשילוב עם ריצוף Sanger לאיתור מוטציה סומטית בתדר נמוך

When monitoring minimal residual disease (MRD) after tumor treatment, there are higher requirements of the lower limit of detection than when detecting ...

wild-type-blocking-pcr-combined-with-sanger-sequencing-for-detection

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

רצפי DNA ונקווה היא אסטרטגיה מהיר וחסכוני לזהות גרסאות נדירים הקשורים פנוטיפים מורכבים של קבוצות גדולות. כאן אנו מתארים את ניתוח חישובי של רצפי נקווה הדור הבא, של 32 גנים הקשורים בסרטן באמצעות חבילת תוכנה ספלינטר. שיטה זו היא מדרגית, והיא חלה על כל הפנוטיפ של עניין.

זיהוי גנטי של וריאנטים נדירים מן הרצף נקווה שימוש Splinter

סרטון זה מתאר תגובת שרשרת פולימראז חוסמת מסוג פראי, או WTB-PCR, המזהה מוטציות סומטיות. הטכניקה מבוססת PCR משתמשת בחומצת גרעין נעולה, או LNA, אוליגונוקלאוטיד שנקשר לאלל הבר המשלים שלו וחוסם את התארכותו. החסימה מאפשרת באופן סלקטיבי הגברה של אללים מוטנטיים ברמה נמוכה על פני הגרסאות הפראיות שלהם בדגימה.

חסימת PCR מסוג Wild לאיתור מוטציות סומטיות בתדר נמוך

אנו מתארים את ההכנה של ספריות ה-DNA המינימרקטים ולכידת אקסון הבא המבוסס על הכלאה לזיהוי של מוטציות סרטן קשור מפתח בדגימות גידול קליניים על ידי רצף "הדור הבא" מקביל מסיבי. רצף אקסון ממוקד מציע יתרונות של תפוקה גבוהה, עלות נמוכה, וכן כיסוי רצף עמוק, ובכך מניב רגישות גבוהה לאיתור מוטציות בתדירות נמוכה.

זיהוי שינויים גנטיים סומטי בדגימות גידול על ידי לכידת אקסון וריצוף מקביל מסיבי

כתב יד זה מתאר פרוטוקולים קליניים עבור שני לוחות ריצוף מהדור הבא. פאנל אחד חוקר ממאירויות המטולוגיות ואילו הפאנל השני מתמקד בגנים שעברו מוטציה בדרך כלל בגידולים מוצקים. סיווג מולקולרי של מוטציות מניעות בגידולים ממאירים אנושיים מציע מידע פרוגנוסטי וחיזוי רב ערך.

רצף הדור הבא לצורך זיהוי של מוטציות שניתן לפעול ב מוצק לנוזל גידולים

מתוארת מערכת משולבת לריצוף ממוקד של הדור הבא של דגימות אונקולוגיות. מערכת חוצת פלטפורמות זו מותאמת לביופסיות גידול באיכות נמוכה ובכמות נמוכה, מתאימה לתשומות DNA נמוכות, כוללת בקרות מרובות וריאנטים מאופיינות היטב, וכוללת מתקשר וריאנט חדש המבוסס על אמצעי בקרת איכות כמותיים טרום-אנליטיים.

אינטגרציה של Wet ותהליכי ספסל יבשים מבצעת אופטימיזציה ממוקד רצף הדור הבא של איכות נמוכה וביופסיות גידול נמוכה כמות

PCR חוסם מסוג פרא ואחריו ריצוף ישיר מציע שיטה רגישה ביותר לזיהוי מוטציות סומטיות בתדירות נמוכה במגוון סוגי דגימות.

חסימת PCR משולבת מסוג Wild עם רצף ישיר כשיטה רגישה עבור איתור של תדרים נמוכים מוטציות סומטיות

הדור הבא רצפי (הגדרות) הוא כלי רב עוצמה עבור אפיון גנומית זה מוגבל על ידי שיעור שגיאה גבוהה של פלטפורמת (~0.5–2.0%). אנו מתארים את השיטות שלנו של רצף שגיאות המאפשרים לנו במחלקותיכם שיעור שגיאה המיתרים, לזהות מוטציות ב- variant אלל שברים כמו שנדיר למצוא 0.0001.

אירוע נדיר איתור שגיאות DNA ו RNA רצף

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לכמת במדויק מספר שינויים גנטיים של אזור היעד בתגובה יחיד באמצעות מסירה ddPCR וזוג הידרוליזה הגששים ייחודי.

Droplet יחיד שרשרת התגובה פולימראז דיגיטלי עבור זיהוי מקיף, בו זמנית של מוטציות באזורים חמה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לזהות מוטציות סומניות הגידול במחזור ה-DNA הנוכחי נוזלים ביולוגיים החולה (ביולואידים). שלנו droplet דיגיטלי פולימראז תגובת שרשרת (dPCR) שיטה מבוססת מאפשר כימות של מוטציה allelic תדירות הגידול (MAF), הקלה מינימלית פולשנית משלים אבחון וניטור זמני של תגובת הגידול.

איתור וניטור של DNA הקשורים במחזור הגידול ב ביולואידים חולה

מאמר זה מתאר שיטה לזהות שינויים של שבטים ושבטים תת-שבטיים בין דגימות שונות ממטופל נתון. למרות שהניסויים המתוארים כאן מתמקדים בסוג גידול מסוים, הגישה ישימה באופן כללי לגידולים מוצקים אחרים.

ניתוח נגעים השוואתית באמצעות גישה ממוקדת רצף

למד שיטת PCR מסוג Wild בשילוב עם ריצוף Sanger לאיתור מוטציות סומטיות בתדר נמוך בלימפומה אנגיו-אימונובלסטית. שיטה זו מציעה רגישות גבוהה ועלות נמוכה לאבחון מוטציות בסרטן.

חסימת PCR מסוג Wild בשילוב עם ריצוף Sanger לאיתור מוטציה סומטית בתדר נמוך

גלה סרטונים נוספים