Name: ניתוח תפקוד מיטוכונדריאלי במוטנט Drosophila melanogaster PINK1B9-Null באמצעות רספירומטריה ברזולוציה גבוהה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-11-10T12:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: חקור תפקוד מיטוכונדריאלי במוטנט PINK1 B9-null של Drosophila melanogaster באמצעות פרוטוקול רספירומטריה ברזולוציה גבוהה. שיטה זו מאפשרת ניתוח ביואנרגטי מדויק לחקר מחלת פרקינסון.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים לסוכנות הברזילאית Coordenação de Aperfeiçoamento de Pesquisa Pessoal de Nível Superior (CAPES EPIDEMIAS 09 #88887.505377/2020). P.M. (#88887.512821/2020-00) ו- T.D. (#88887.512883/2020-00) הם מקבלי מלגות מחקר.

השתמשנו בזנים w1118 (לבן) ו-w[*] Pink1[B9]/FM7i, P{w[+mC]=ActGFP}JMR3 (המכונה Pink1B9) (מזהה FlyBase: FBgn0029891) ממרכז המניות בלומינגטון דרוזופילה (מספר מזהה: 34749). במחקר זה, מוטנטים זכריים של D. melanogaster PINK1B9-null מושווים לזכר D. melanogaster מזן w1118, המשמש כקבוצת ביקורת (רקע גנטי). יש לנתח פרמטרים אחרים במקביל לניסויי הרספירומטריה כדי לוודא שלזבובים יש את הגנוטיפ הנכון (Pink1B9/Y), כגון עיוותים בבית החזה ובעיות תנועה, המתוארים היטב עבור זבובים מוטנטייםורודים1 B9 24,25,26.
1. בעלי חיים ודיור
<ol><li>שמרו את הזבובים בבקבוקי זכוכית המכילים 10 מ"ל של תזונה סטנדרטית (שמרים 1.73%, קמח סויה 0.9%, קמח תירס 7.3%, אגר 0.5%, סירופ תירס 7.6% וחומצה פרופיונית 0.48%) בטמפרטורה ולחות קבועות (25 מעלות צלזיוס ו-60%, בהתאמה), עם מחזור אור/חושך של 12 שעות: 12 שעות.</li>
	<li>עבור כל ניסוי, השתמש בשני זבובים בגילאי 1-3 ימים לאחר האקלוסיה. הערה: נקבות הזבובים הבתוליות המוטנטיות PINK1B9-null הוצלבו עם w1118 זכרים כדי להשיג את זכרי F1 עם גנוטיפ Pink1B9/Y.</li>
</ol>2. הכנת מדגם
<ol><li>הכן את מאגר MiR05 כמתואר בטבלה 1.</li>
	<li>מרדימים את הזבובים על קרח ומעבירים אותם לצינורות מיקרוצנטריפוגות (שני זבובים בכל צינור).</li>
	<li>בכל צינור, הוסף 200 μL של חיץ MiR05 צונן והומוגניזציה של הזבובים. הומוגניזציה ידנית, הפעלת לחץ עדין (כ 4-6 פעימות של pestle) כדי למנוע את התפוררות המיטוכונדריה.</li>
</ol>3. כיול רספירומטריה ברזולוציה גבוהה של חיישני חמצן פולרוגרפיים
הערה: לתאי OROBOROS יש נפח כולל של כ -2 מ"ל. כיול נדרש כדי להבטיח ששטף החמצן קרוב ל-0 PMOL כדי להתחיל את הבדיקה.
<ol><li>החל מהכיול, הוסף 2 מ"ל של MiR05 לתא. מכסים את החדר בפקק ולא משאירים בועות אוויר; לאחר מכן, משוך בזהירות את הפקק ליצירת בועת אוויר אחת בודדת.</li>
	<li>פתח את תוכנת OROBOROS Dat.Lab. הזינו טמפרטורה של 25°C בשדה טמפרטורת הבלוק ולחצו על Connect to Oxygraph-2k (איור 1A).</li>
	<li>לחץ ובחר את התיקיה שבה יש לשמור את הכיול ולחץ על שמור.</li>
	<li>כאשר נפתח חלון חדש, תן שם לניסוי ולדוגמאות (אם אתה מכייל, פשוט הזן את כיול השם) ולחץ על שמור.</li>
	<li>עבור אל תפריט פריסה ובחר באפשרות הראשונה: 01 Calibration Exp. Gr.3 - Temp כפי שמוצג באיור 1B.</li>
	<li>המתן עד שהתוכנית תנתב מחדש לפריסת הכיול, המתן עד שהקו האדום יציג קו ישר סטנדרטי עם נקודות סביב 0 pmol. לאחר מכן, בחרו שתי נקודות: אחת עבור תא A והשנייה עבור תא B (איור 1C) כאשר הקו האדום נמצא בדיוק באפס. הערה: הנקודות שנבחרו חייבות להיות שטף חמצן (קו אדום) סביב 0.<ol><li>לסימון הנקודות בשני החדרים, בחרו ריכוז O2 בצד ימין של המסך, בחרו בנקודה המסומנת והעתיקו את ערכי הטמפרטורה והלחץ הברומטרי ביחס לנקודה. הדביקו את הערכים האלה בתיבות למטה ולחצו על כיול והעתקה ללוח בפינה הימנית התחתונה של המסך, כפי שמוצג באיור 2.</li>
		<li>בצע תהליך זה עבור שני החדרים (A ו - B), ולאחר מכן עבור לתפריט קובץ ובחר שמור והתנתק. הערה: לאחר תהליך הכיול, התוכנית תנתב מחדש את המשתמש למסך הבית כך שהתוכנה תהיה מוכנה להתחיל את בדיקת HRR. לצורך בדיקה זו, נשתמש בפרוטוקול SUIT.</li>
	</ol></li>
</ol>4. פרוטוקול חליפה
<ol><li>עם השלמת הכיול, הסר את הפקקים ופתח את החדרים.</li>
	<li>שטפו את הפקקים (המחזיקים את הקצה שאינו נוגע בדגימה) ואת התאים עם 100% אתנול, 70% אתנול ומים מזוקקים, בסדר הזה. הערה: חזור על התהליך עבור כל שינוי דגימה.</li>
	<li>הומוגניזציה של הזבובים ב 200 μL של חיץ, למקם את כל תוכן הדגימה בתא באמצעות micropipette, ולמקם מחדש את הפקק בתא, תוך הקפדה לא ליצור בועות אוויר. הערה: אם נוצרות בועות אוויר, הסר את הפקק בעדינות והוסף 100 μL של חיץ MIR05.</li>
	<li>לחץ על תפריט פריסה ובחר באפשרות 05 Flow by Corrected Volume כפי שמוצג באיור 1B.</li>
	<li>המתן לניתוב מחדש לחלון חדש. לחץ על שמור כדי לבחור את התיקיה שבה יש לשמור את הניסוי.</li>
	<li>המתן לפתיחת חלון חדש נוסף. תן שם לניסוי בחלל קוד ניסויי. לאחר מכן, תן שם לכל דגימה בתא המתאים לה A ו- B בשדה Sample, והגדר את יחידת השדה ליחידה. הערה: ניתן לבחור גם יחידות אחרות, לדוגמה, מיליוני תאים או מ"ג.</li>
	<li>בהתחשב בכך שפרוטוקול זה משתמש בשני זבובים (2 יחידות) ונפח התא הוא 2 מ"ל, בשדה הריכוז , הגדר 1 לכל מ"ל (איור 1D). הערה: כאן, כמות המדגם נורמלה על ידי מספר הזבובים; עם זאת, נורמליזציה זו עשויה להתבצע על ידי תכולת החלבון של הדגימה, כימות DNA מיטוכונדריאלי, או פעילות של ציטראט סינתאז.</li>
	<li>כאשר אות שטף החמצן (הקו האדום) יציב על הערך החיובי, התחילו את פרוטוקול HRR עם טיטרציה של מצעים, מעכבים ובלתי מצמדים (איור 3). כל הריאגנטים והציוד הבאים מוצגים בטבלה 1.<ol><li>הוסף דיגיטונין (5 מיקרוגרם/מ"ל) כדי לחדור לקרום המיטוכונדריה.</li>
		<li>מוסיפים מצעי פירובט (5 מ"מ), מלאט (2 מ"מ) ופרולין (10 מ"מ) וממתינים עד ששטף החמצן עולה ומתייצב. כדי לסמן את האירוע עבור כל תוספת מגיב, הקש על מקש F4 במקלדת והזן את השם של כל מגיב.</li>
		<li>הוסף ADP (5mM) כדי להתאים את שרשרת הנשימה המיטוכונדריאלית ולחכות לעלייה וייצוב של שטף החמצן.</li>
		<li>מוסיפים סוקצינאט (10 מ"מ) ומחכים לעלייה וייצוב של שטף החמצן.</li>
		<li>הוסף אוליגומיצין (2.5 מיקרומטר) כדי לעכב ATP סינתאז ולחפש ירידה בשטף החמצן.</li>
		<li>המתן עד שהקו האדום יתייצב ונפרק את העברת האלקטרונים המיטוכונדריאלית באמצעות קרבוניל-4-(trifluoromethoxy) פנילהידראזון ציאניד (FCCP) עם טיטרים של 0.25 מיקרומטר עד שתגיע לצריכת החמצן המרבית, כפי שמודגם על ידי עליית הקו האדום. לאחר ייצוב שטף החמצן, התחל להוסיף את המעכבים של כל קומפלקס, אחד בכל פעם.</li>
		<li>הוסף רוטנון (0.5 מיקרומטר), מעכב I מורכב. המתן לירידה וייצוב של שטף החמצן כדי להוסיף את המעכב הבא.</li>
		<li>הוסף Malonate (5 mM), מעכב II מורכב. המתן לירידה וייצוב של שטף החמצן כדי להוסיף את המעכב הבא.</li>
		<li>לבסוף, להוסיף Antimycin (2.5 μM), מעכב III מורכב. המתן לירידה ואחריה עלייה וייצוב של שטף החמצן. הערה: שטף החמצן אמור להתייצב בערך חיובי אך מתחת לערך עבור העיכוב האחרון של קומפלקסים של חלבון מיטוכונדריאלי.</li>
	</ol></li>
	<li>בסוף הניתוח, להסיר את כל התוכן של החדרים באמצעות micropipette. יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C לצורך ניתוח עתידי, בעת הצורך.</li>
</ol>5. ניתוח נתונים
<ol><li>השתמש בחבילת תוכנה סטטיסטית מתאימה לניתוח נתונים.</li>
	<li>בצע בדיקות t כדי להעריך את ההבדלים בין שתי הקבוצות. עבור מצבים הכוללים טיפולים מרובים, השתמש בניתוח שונות (ANOVA) כמבחן סטטיסטי 27.</li>
	<li>חלץ את ערכי שטף O2 מהגרף שנוצר על-ידי התוכנה. OXPHOS CI מתייחס לערך של שטף O2 לאחר הוספת ADP. OXPHOS CII מתקבל על ידי חיסור OXPHOS CI&CII - OXPHOS CI. OXPHOS CI&CII הוא הערך של שטף O2 המופק לאחר הוספת סוקצינאט. ETS CI&CII הוא ערך השטף O2 לאחר הוספת FCCP. ETS CI = FCCP - Rotenone ו- ETS CII = Rotenone - Malonate.</li>
	<li>חשב סינתזת ATP כהפרש בין OXPHOS (P) ו- LEAK (L) (P - L)28.</li>
	<li>קבע את יחס בקרת הנשימה (RCR) על ידי חישוב היחס OXPHOS/LEAK, כאשר RCR = P/L.11</li>
</ol>

ניתוח פיזיולוגיה מיטוכונדריאלית וביו-אנרגטיקה בזבובי פירות

<ol><li>Brand, M. D., Orr, A. L., Perevoshchikova, I. V., Quinlan, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+mitochondrial+function+and+cellular+bioenergetics+in+ageing+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Dermatol%22%5BJournal%5D)">The role mitochondrial function and cellular bioenergetics in ageing and disease.</a> Br J Dermatol. 169, 1-8 (2013).</li>
<li>Ramaccini, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+function+and+dysfunction+in+dilated+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial function and dysfunction in dilated cardiomyopathy.</a> Front Cell Dev Biol. 8, 624216(2021).</li>
<li>Zhunina, O. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mitochondrial+dysfunction+in+vascular+disease%2C+tumorigenesis%2C+and+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Biosci%22%5BJournal%5D)">The role of mitochondrial dysfunction in vascular disease, tumorigenesis, and diabetes.</a> Front Mol Biosci. 8, 671908(2021).</li>
<li>Prasun, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+in+metabolic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction in metabolic syndrome.</a> Biochim Biophys Acta. 1866 (10), 165838(2020).</li>
<li>Bhatti, J. S., Bhatti, G. K., Reddy, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+and+oxidative+stress+in+metabolic+disorders+-+A+Step+towards+mitochondria+based+therapeutic+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in metabolic disorders - A Step towards mitochondria based therapeutic strategies.</a> Biochim Biophys Acta. 1863 (5), 1066-1077 (2017).</li>
<li>Perier, C., Vila, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+biology+and+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Med%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial biology and Parkinson's disease.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (2), 009332(2012).</li>
<li>DeMaagd, G., Philip, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease+and+its+management%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacy+and+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease and its management.</a> Pharmacy and Therapeutics. 40 (8), 504-532 (2015).</li>
<li>Miyazaki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PINK1-dependent+and+Parkin-independent+mitophagy+is+involved+in+reprogramming+of+glycometabolism+in+pancreatic+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">PINK1-dependent and Parkin-independent mitophagy is involved in reprogramming of glycometabolism in pancreatic cancer cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 625, 167-173 (2022).</li>
<li>Kopin, I. J., Markey, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MPTP+toxicity%3A+implications+for+research+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">MPTP toxicity: implications for research in Parkinson's disease.</a> Annual Review of Neuroscience. 11, 81-96 (1988).</li>
<li>Connolly, N. M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+on+experimental+methods+to+assess+mitochondrial+dysfunction+in+cellular+models+of+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Guidelines on experimental methods to assess mitochondrial dysfunction in cellular models of neurodegenerative diseases.</a> Cell Death Differ. 25 (3), 542-572 (2018).</li>
<li>Brand, M. D., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+mitochondrial+dysfunction+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Assessing mitochondrial dysfunction in cells.</a> Biochem J. 435, 297-312 (2011).</li>
<li>Haynes, C. M., Fiorese, C. J., Lin, Y. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+and+responding+to+mitochondrial+dysfunction%3A+The+UPRmt+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Evaluating and responding to mitochondrial dysfunction: The UPRmt and beyond.</a> Trends Cell Mol Biol. 23 (7), 311-318 (2013).</li>
<li>Long, Q., Huang, L., Huang, K., Yang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+mitochondrial+bioenergetics+in+isolated+mitochondria+from+mouse+heart+tissues+using+oroboros+2k-oxygraph%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Assessing mitochondrial bioenergetics in isolated mitochondria from mouse heart tissues using oroboros 2k-oxygraph.</a> Methods Mol Biol. 1966, Clifton, N.J. 237-246 (2019).</li>
<li>Scheiber, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+respirometry+in+human+endomyocardial+biopsies+shows+reduced+ventricular+oxidative+capacity+related+to+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">High-resolution respirometry in human endomyocardial biopsies shows reduced ventricular oxidative capacity related to heart failure.</a> Exp Mol Med. 51 (2), 1-10 (2019).</li>
<li>Krumschnabel, G., Eigentler, A., Fasching, M., Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+nine+-+use+of+safranin+for+the+assessment+of+mitochondrial+membrane+potential+by+high-resolution+respirometry+and+fluorometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Chapter nine - use of safranin for the assessment of mitochondrial membrane potential by high-resolution respirometry and fluorometry.</a> Methods Enzymol. 542, 163-181 (2014).</li>
<li>Demir, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+use+of+Drosophila+as+an+in+vivo+model+organism+for+COVID-19-related+research%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Turk+J+Biol%22%5BJournal%5D)">The potential use of Drosophila as an in vivo model organism for COVID-19-related research: a review.</a> Turk J Biol. 45 (4), 559-569 (2021).</li>
<li>Hales, K. G., Korey, C. A., Larracuente, A. M., Roberts, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+on+the+fly%3A+a+primer+on+the+Drosophila+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetics on the fly: a primer on the Drosophila model system.</a> Genetics. 201 (3), 815-842 (2015).</li>
<li>McBride, S. M. J., Holloway, S. L., Jongens, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Drosophila+as+a+tool+to+identify+pharmacological+therapies+for+fragile+X+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today+Technol+Technologies%22%5BJournal%5D)">Using Drosophila as a tool to identify pharmacological therapies for fragile X syndrome.</a> Drug Discov Today Technol Technologies. 10 (1), e129-e136 (2013).</li>
<li>Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+studying+metabolism+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+%28San+Diego%2C+Calif%29%22%5BJournal%5D)">Methods for studying metabolism in Drosophila.</a> Methods (San Diego, Calif). 68 (1), 105-115 (2014).</li>
<li>Bar, S., Prasad, M., Datta, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuromuscular+degeneration+and+locomotor+deficit+in+a+Drosophila+model+of+mucopolysaccharidosis+VII+is+attenuated+by+treatment+with+resveratrol%29%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Neuromuscular degeneration and locomotor deficit in a Drosophila model of mucopolysaccharidosis VII is attenuated by treatment with resveratrol).</a> Dis Model Mech. 11 (11), (2018).</li>
<li>Imai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PINK1-Parkin+signaling+in+Parkinson%27s+disease%3A+Lessons+from+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">PINK1-Parkin signaling in Parkinson's disease: Lessons from Drosophila.</a> Neurosci Res. 159, 40-46 (2020).</li>
<li>Julienne, H., Buhl, E., Leslie, D. S., Hodge, J. J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+PINK1+and+parkin+loss-of-function+mutants+display+a+range+of+non-motor+Parkinson%27s+disease+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Drosophila PINK1 and parkin loss-of-function mutants display a range of non-motor Parkinson's disease phenotypes.</a> Neurobiol Dis. 104, 15-23 (2017).</li>
<li>Biswas, S., Bagchi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+structural+dynamics+of+the+mutations+in+the+kinase+domain+of+PINK1+protein+associated+with+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Analysis of the structural dynamics of the mutations in the kinase domain of PINK1 protein associated with Parkinson's disease.</a> Gene. 857, 147183(2023).</li>
<li>Koh, H., Chung, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PINK1+and+Parkin+to+control+mitochondria+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">PINK1 and Parkin to control mitochondria remodeling.</a> Anat Cell Biol. 43 (3), 179-184 (2010).</li>
<li>Zhu, M., Li, X., Tian, X., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mask+loss-of-function+rescues+mitochondrial+impairment+and+muscle+degeneration+of+Drosophila+pink1+and+parkin+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Mask loss-of-function rescues mitochondrial impairment and muscle degeneration of Drosophila pink1 and parkin mutants.</a> Hum Mol Genet. 24 (11), 3272-3285 (2015).</li>
<li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+in+Drosophila+PINK1+mutants+is+complemented+by+parkin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction in Drosophila PINK1 mutants is complemented by parkin.</a> Nature. 441 (7097), 1157-1161 (2006).</li>
<li>Dytham, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDytham%2C+C+%22Choosing+and+using+statistics%3A+a+biologist%27s+guide%22">Choosing and using statistics: a biologist's guide</a>. , Wiley-Blackwell. Hoboken, NJ. (2011).</li>
<li>Bonora, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+synthesis+and+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Purinergic+Signal%22%5BJournal%5D)">ATP synthesis and storage.</a> Purinergic Signal. 8 (3), 343-357 (2012).</li>
<li>Gonçalves, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caffeine+improves+mitochondrial+function+in+PINK1B9-null+mutant+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bioenerg+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Caffeine improves mitochondrial function in PINK1B9-null mutant Drosophila melanogaster.</a> J Bioenerg Biomembr. 55 (1), 1-13 (2023).</li>
<li>Gonçalves, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+function+and+cellular+energy+maintenance+during+aging+in+a+Drosophila+melanogaster+model+of+Parkinson+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial function and cellular energy maintenance during aging in a Drosophila melanogaster model of Parkinson disease.</a> Mitochondrion. 65, 166-175 (2022).</li>
<li>Janowska, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+respiratory+chain+complex+I+dysfunction+induced+by+N-methyl+carbamate+ex+vivo+can+be+alleviated+with+a+cell-permeable+succinate+prodrug%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial respiratory chain complex I dysfunction induced by N-methyl carbamate ex vivo can be alleviated with a cell-permeable succinate prodrug.</a> Toxicol In Vitro. 65, 104794(2020).</li>
<li>Ngo, D. T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+modifications+of+mitochondrial+complex+II+are+associated+with+insulin+resistance+of+visceral+fat+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Oxidative modifications of mitochondrial complex II are associated with insulin resistance of visceral fat in obesity.</a> Physiol Endocrinol Metab. 316 (2), E168-E177 (2019).</li>
<li>Stroud, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accessory+subunits+are+integral+for+assembly+and+function+of+human+mitochondrial+complex+I%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Accessory subunits are integral for assembly and function of human mitochondrial complex I.</a> Nature. 538 (7623), 123-126 (2016).</li>
<li>Senyilmaz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+mitochondrial+morphology+and+function+by+stearoylation+of+TFR1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Regulation of mitochondrial morphology and function by stearoylation of TFR1.</a> Nature. 525 (7567), 124-128 (2015).</li>
<li>Poddighe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucuna+pruriens+%28Velvet+bean%29+rescues+motor%2C+olfactory%2C+mitochondrial+and+synaptic+impairment+in+PINK1B9+Drosophila+melanogaster+genetic+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Mucuna pruriens (Velvet bean) rescues motor, olfactory, mitochondrial and synaptic impairment in PINK1B9 Drosophila melanogaster genetic model of Parkinson's disease.</a> PloS One. 9 (10), e110802(2014).</li>
<li>Pesta, D., Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+respirometry%3A+OXPHOS+protocols+for+human+cells+and+permeabilized+fibers+from+small+biopsies+of+human+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol+%28Clifton%2C+N.J%29%22%5BJournal%5D)">High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle.</a> Methods Mol Biol (Clifton, N.J). 810, 25-58 (2012).</li>
<li>Winer, L. S. P., Wu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+analysis+of+glycolytic+and+oxidative+substrate+flux+of+cancer+cells+in+a+microplate%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Rapid analysis of glycolytic and oxidative substrate flux of cancer cells in a microplate.</a> PloS One. 9 (10), e109916(2014).</li>
<li>Plitzko, B., Loesgen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+oxygen+consumption+rate+%28OCR%29+and+extracellular+acidification+rate+%28ECAR%29+in+culture+cells+for+assessment+of+the+energy+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Measurement of oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) in culture cells for assessment of the energy metabolism.</a> Bio Protoc. 8 (10), e2850(2018).</li>
<li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparameter+metabolic+analysis+reveals+a+close+link+between+attenuated+mitochondrial+bioenergetic+function+and+enhanced+glycolysis+dependency+in+human+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells.</a> Am J Physiol. Cell Physiol. 292 (1), C125-C136 (2007).</li>
<li>Divakaruni, A. S., Jastroch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+for+the+analysis%2C+standardization+and+interpretation+of+oxygen+consumption+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Metab%22%5BJournal%5D)">A practical guide for the analysis, standardization and interpretation of oxygen consumption measurements.</a> Nat Metab. 4 (8), 978-994 (2022).</li>
<li>Bingol, B., Sheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+mitophagy%3A+PINK1%2C+Parkin%2C+USP30+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of mitophagy: PINK1, Parkin, USP30 and beyond.</a> Free Radic Biol Med. 100, 210-222 (2016).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים מתחרים.

HRR היא טכניקה רבת עוצמה לחקר נשימה מיטוכונדריאלית ומטבוליזם של אנרגיה ב-D. melanogaster ובאורגניזמים אחרים. הוא מספק הערכה מפורטת וכמותית של תפקוד המיטוכונדריה, ומאפשר לחוקרים לקבל תובנות לגבי הביו-אנרגטיקה של התאים. הפרוטוקול המוצג כאן מתאר את הערכת תפקוד שרשרת הנשימה המיטוכונדריאלית ואת הפעילות של קומפלקסים מיטוכונדריאליים ספציפיים באמצעות פרוטוקול SUIT ב- D. melanogaster. פרוטוקול SUIT כולל מניפולציה שיטתית של מצעים שונים, מפרקים ומעכבים כדי לבחון היבטים שונים של נשימה מיטוכונדריאלית.
<p class="...

מיטוכונדריה הם אברונים תאיים השולטים בתפקודים חשובים, כולל ויסות אפופטוטי, הומאוסטזיס סידן והשתתפות במסלולים ביוסינתטיים. על ידי בעל חומר גנטי אוטונומי, הם מסוגלים לתרום לתהליכי תחזוקה ותיקון תאים. המבנה שלהם מכיל את שרשרת הובלת האלקטרונים ואת הזרחן החמצוני, שניהם חיוניים לאנרגיה תאית 1,2,3. בפרט, בקרת אנרגיה מושגת באמצעות ייצור אדנוזין טריפוספט (ATP) באמצעות זרחן חמצוני (OXPHOS)2. הפרעה בחילוף החומרים האנרגטי עם פגיעה בתפקודי המיטוכונדריה מתרחשת הן בהישרדות תאיםוהן במוות 4,5, הקשורים לעתים קרובות למגוון רחב של פתולוגיות אנושיות, כגון סרטן, ומחלות נוירודגנרטיביות כגון מחלת פרקינסון (PD)3,6.
מחלת פרקינסון היא הפרעה כרונית, פרוגרסיבית ונוירולוגית. הגורם העיקרי למחלה זו הוא מוות של תאי מוח, במיוחד בחומר ניגרה, אשר אחראים לייצור של נוירוטרנסמיטר דופמין, אשר שולט על תנועה 6,7,8. התצפית המוקדמת ביותר שקישרה בין פרקינסוניזם לתפקוד לקוי של המיטוכונדריה נעשתה בשנת 1988, במודלים ניסיוניים המשתמשים ברעלים המעכבים את שרשרת הנשימה קומפלקס I9.
נכון לעכשיו, ישנן מספר שיטות להערכת תפקוד לקוי של המיטוכונדריה 10,11,12,1 3; עם זאת, בהשוואה לגישות קונבנציונליות, רספירומטריה ברזולוציה גבוהה (HRR) מציגה רגישות ויתרונות מעולים13,14. לדוגמה, פרוטוקולי HRR מאפשרים להעריך את כל תפקוד שרשרת הנשימה המיטוכונדריאלית או את הפעילות של קומפלקסים מיטוכונדריאליים ספציפיים14,15. ניתן להעריך תפקוד לקוי של המיטוכונדריה בתאים שלמים, במיטוכונדריה מבודדים, או אפילו ב-ex vivo 10,11,13,14.
תפקוד לקוי של המיטוכונדריה קשור קשר הדוק עם תהליכים פתולוגיים ופיזיולוגיים רבים. לכן חשוב לחקור פיזיולוגיה מיטוכונדריאלית וביו-אנרגטיקה באמצעות מערכות מודל גנטיות וניסיוניות. בהקשר זה, מחקר על Drosophila melanogaster, זבוב הפירות, יש כמה יתרונות. מודל זה חולק מאפיינים ותהליכים תאיים בסיסיים עם בני אדם, כולל שימוש בדנ"א כחומר גנטי, אברונים משותפים ומסלולים מולקולריים שמורים המעורבים בהתפתחות, חסינות ואיתות תאי. בנוסף, לזבובי הפירות יש מחזור חיים מהיר, תחזוקה קלה, עלות נמוכה, תפוקה גבוהה ופחות דאגות אתיות, ובכך מהווים כלי רב ערך לניתוח תהליכים תאיים מורכבים 16,17,18,19,20.
יתר על כן, הומולוג של הגן קינאז משוער 1 (pink1) המושרה על ידי PTEN מבוטא ב- D. melanogaster. יש לו תפקיד מכריע בסילוק מיטוכונדריה פגומה בתהליך של מיטופגיה8. בבני אדם, מוטציות בגן זה נוטות אנשים לצורה משפחתית אוטוזומלית רצסיבית של PD הקשורה לתפקוד לקוי של המיטוכונדריה 8,21,22,23. כתוצאה מכך, זבוב הפירות הוא מודל חייתי רב עוצמה למחקרים על הפתופיזיולוגיה של מחלת פרקינסון ולסינון מועמדים לתרופות המתמקדים בתפקוד לקוי של המיטוכונדריה ובביו-אנרגטיקה. לכן, העבודה הנוכחית מסבירה כיצד לנתח תפקוד מיטוכונדריאלי במודל של PD מ D. melanogaster באמצעות טכניקת HRR ב OROBOROS עם Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration (SUIT) פרוטוקול.

<table><tbody><tr><td>ADP</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A5285</td><td>אדנוזין 5&פריים;-דיפוספט נתרן סל (מספר CAS 72696-48-1); &ge; 95%; משקל מולקולרי = 501.31 גרם/מול.</td></tr><tr><td>ואקוטי; gar</td><td>Kasv</td><td>K25-1800</td><td>לשימוש בקטריולוגי</td></tr><tr><td>Antimycin-A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8674</td><td>Antimycin A מ- Streptomyces sp. (מספר CAS 1397-94-0); משקל מולקולרי&nbsp; 540 גרם/מול;</td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td>סרום בקר אלבומין (מספר CAS 9048-46-8); pH 7,0 &ge; 98%</td></tr> <tr><td>תוכנת Datlab</td><td>Oroboros Instruments, אינסברוק, אוסטריה</td><td>20700</td><td>תוכנה לאיסוף וניתוח נתונים</td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D 5628</td><td>מספר CAS 11024-24-1</td></tr><tr><td>מים</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>מזוקקיםDrosophila melanogaster strain w[*] Pink1[B9]/FM7i, P{w[+mC]=ActGFP}JMR3</td><td></td><td></td><td>הושג ממרכז המניות של בלומינגטון דרוזופילה</td></tr><tr><td>Drosophila melanogaster strain&nbsp; w1118</td><td></td><td></td><td>הושג&nbsp; מהאוניברסיטה הפדרלית של סנטה מריה</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E8145</td><td>אתילן גליקול-ביס(2-אמינואתילאתר)-N,N,N',N'-חומצה טטראצטית (מספר CAS 13638-13-3); &ge; 97%; משקל מולקולרי = 468.28 גרם/מול</td></tr><tr><td>FCCP</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>C2920</td><td>קרבוניל ציאניד 4- (טריפלואורומטוקסי)פנילהידרזון&nbsp; (מספר CAS 370-86-5); &ge; 98% (TLC), פודרה&nbsp;</td></tr><tr><td>GraphPad Prism גרסה 8.0.1.</td><td></td><td></td><td>תוכנה לאיסוף וניתוח נתונים</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td>4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (מספר CAS 7365-45-9); &ge; 99,5% (טיטרציה), נבדק בתרבית תאים; משקל מולקולרי = 238.30 גרם/מול</td></tr><tr><td>מד נשימה ברזולוציה גבוהה Oxygraph O2K</td><td>Oroboros Instruments, אינסברוק, אוסטריה</td><td>10022-02</td><td>ערכת מד נשימה O2K להפעלה</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5379</td><td>מונופוטסיום פוספט (מספר CAS 7778-77-0); ריאגנט פלוס, משקל מולקולרי = 136.09 גרם/מול</td></tr><tr><td>KOH</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>211473</td><td>אשלגן הידרוקסיד (מספר CAS 1310-58-3); מגיב ACS, &ge; 85%, כדורים</td></tr><tr><td>מלאט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>M1296</td><td>חומצה מלונית (מספר CAS 141-82-2); 99%, משקל מולקולרי = 104.06 גרם/מול). תמיסה מותאמת ל-7.0 בקירוב.</td></tr><tr><td>חומצה מאלית</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>M1000</td><td>(S)-(&מינוס;)-2-חומצה הידרוקסיסוקסינית (מספר CAS 97-67-6); &ge; 95% ; משקל מולקולרי = 134.09 גרם/מול</td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3671</td><td>2-(N-Morpholino)חומצה אתנסולפונית (מספר CAS 4432-31-9); &ge; 99% (טיטרציה); משקל מולקולרי = 195.24 גרם/מול</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td>מגנזיום כלוריד (מספר CAS 7786-30-3); נטול מים, &ge; 98%, משקל מולקולרי = 95.21 גרם/מול</td></tr><tr><td>צינורות מיקרוצנטריפוגה</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>O2K-Titration Set</td><td>Oroboros Instruments, אינסברוק, אוסטריה</td><td>20820-03</td><td>מזרקי המילטון בנפחים שונים</td></tr><tr><td>אוליגומיצין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>O 4876</td><td>אוליגומיצין מ&nbsp; Streptomyces diastatochromogenes (מספר CAS&nbsp; 1404-19-9); &ge; 90% סה"כ בסיס אוליגומיצינים (HPLC)</td></tr><tr><td>עלי להומוגניזציה</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>פרולין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P0380</td><td>L-פרולין (מספר CAS 147-85-3); אבקה; 99%; משקל מולקולרי = 115.13 גרם/מול</td></tr><tr><td>פירובט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P2256</td><td>נתרן פירובט (מספר CAS 113-24-6), &ge; 99%; משקל מולקולרי = 110.04 גרם/מול</td></tr><tr><td>רוטנון</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>R8875</td><td>רוטטון (מספר CAS 83-79-4); &ge; 95%, משקל מולקולרי 394.42 גרם/מול</td></tr><tr><td>סוקסינט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S 2378</td><td>נתרן סוקסינט דו-בסיסי הקסהידרט (מספר CAS 6106-21-4); &ge; 99%</td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>Merck</td><td>107,651,000</td><td>סוכרוז לשימוש במיקרוביולוגיה (מספר CAS 57-50-1)</td></tr><tr><td>טאורין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>T0625</td><td>מספר CAS 107-35-7</td></tr></tbody></table>

ניתוח תפקוד מיטוכונדריאלי במוטנט drosophila melanogaster pink1b9-null באמצעות רספירומטריה ברזולוציה גבוהה

Analyzing Mitochondrial Function in a Drosophila melanogaster PINK1B9-Null Mutant Using High-resolution Respirometry

מחלות נוירודגנרטיביות, כולל מחלת פרקינסון (PD), והפרעות תאיות כגון סרטן הן חלק מההפרעות המשבשות את חילוף החומרים האנרגטי עם פגיעה בתפקודי המיטוכונדריה. מיטוכונדריה הם אברונים השולטים הן בחילוף החומרים של האנרגיה והן בתהליכים תאיים המעורבים בהישרדות התאים ובמוות. מסיבה זו, גישות להערכת תפקוד המיטוכונדריה יכולות להציע תובנות חשובות על התנאים התאיים בתהליכים פתולוגיים ופיזיולוגיים. בהקשר זה, פרוטוקולי רספירומטריה ברזולוציה גבוהה (HRR) מאפשרים הערכה של כל תפקוד שרשרת הנשימה המיטוכונדריאלית או הפעילות של קומפלקסים מיטוכונדריאליים ספציפיים. יתר על כן, חקר הפיזיולוגיה והביו-אנרגטיקה של המיטוכונדריה דורש מודלים גנטיים וניסיוניים כגון Drosophila melanogaster.
מודל זה מציג מספר יתרונות, כגון הדמיון שלו לפיזיולוגיה האנושית, מחזור החיים המהיר שלו, תחזוקה קלה, עלות-תועלת, יכולות תפוקה גבוהות ומספר מינימלי של בעיות אתיות. תכונות אלה מבססות אותו באופן קולקטיבי ככלי רב ערך לניתוח תהליכים תאיים מורכבים. העבודה הנוכחית מסבירה כיצד לנתח את תפקוד המיטוכונדריה באמצעות מוטציה Drosophila melanogaster PINK1B9-null. הגן pink1 אחראי לקידוד קינאז משוער 1 המושרה על ידי PTEN, באמצעות תהליך המוכר כמיטופגיה, שהוא חיוני לסילוק מיטוכונדריה לא מתפקדת מהרשת המיטוכונדריאלית. מוטציות בגן זה נקשרו לצורה משפחתית אוטוזומלית רצסיבית מוקדמת של פרקינסון. מודל זה יכול לשמש לחקר תפקוד לקוי של המיטוכונדריה המעורב בפתופיזיולוגיה של פרקינסון.

כאן, שטף O2 במצבי OXPHOS CI (P = 0.0341) ו-OXPHOS CI&amp;II (P = 0.0392) מופחת בזבובי PINK1B9 null בהשוואה לזבובי ביקורת (איור 4). תוצאה זו נצפתה גם בממצאים קודמים של הקבוצה שלנו29,30.
CI ו-CII הם רכיבי מפתח של מערכת הובלת האלקטרונים (ETS), שבה CI אחראי על העברת אלקטרונים מ-NADH ליוביקינון, בעוד CII מעביר אלקטרונים מסוקסינט ליוביקינון<...

כאן אנו מציגים פרוטוקול רספירומטריה ברזולוציה גבוהה לניתוח ביו-אנרגטיקה בזבובי פירות מוטנטיים מסוג PINK1B9-null. השיטה משתמשת בפרוטוקול Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration (SUIT).

ניתוח תפקוד מיטוכונדריאלי במוטנט Drosophila melanogaster PINK1B9-Null באמצעות רספירומטריה ברזולוציה גבוהה

Neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s Disease (PD), and cellular disturbances such as cancer are some of the disorders that disrupt energy ...

המחקר שלנו משתמש בדרוזופילה מלנוגסטר כמודל ניסיוני להבנת תפקוד המיטוכונדריה במחלות וברעילות כימית. כמה שאלות שאנו רוצים לענות עליהן הן, כיצד מוטציה PINK-1 משפיעה על תפקוד המיטוכונדריה וכיצד זה קשור למחלת פרקינסון? כיצד נוכל להחזיר, או למנוע, את חוסר התפקוד של המיטוכונדריה הקשור למוטציה זו?רספירומטריה ברזולוציה גבוהה דורשת הכשרה מיוחדת לפעולה מדויקת וניתוח נתונים. בנוסף, המערכת בה השתמשנו אינה מאפשרת עבודה עם מספר דגימות בו זמנית ואינה משכילה לניתוח תפוקה גבוהה. מכיוון שניתן להריץ רק שתי דגימות בו זמנית, תכנון הניסוי חייב להיות מוגדר היטב.הממצאים שלנו מצביעים על פגיעה הדרגתית בתפקוד המיטוכונדריאלי שאנו מתמודדים איתו במוטציות PINK1-Null, המאופיינת בירידה בקישור OXPHOS CI ובקישור ETS CI&CII, ובמעבר מטבולי בייצור ATP מחמצוני לגליקוליטי במסלולים. ממצאים אלה קשורים קשר הדוק לפתופיזיולוגיה של מחלת פרקינסון. אחת מנקודות המפתח של רספירומטריה ברזולוציה גבוהה היא יכולתה לספק מדידות ישירות ומדויקות של צריכת חמצן, מה שמאפשר ניתוח מפורט של תפקוד המיטוכונדריה וחילוף החומרים בתאים.כמו כן, הוא רב-תכליתי. ניתן להשתמש בו למגוון רחב של סוגי דגימות, כולל מיטוכונדריה מבודדים. בהתחשב בכך שתפקוד לקוי של המיטוכונדריה הוא מאפיין נפוץ של מחלות נוירודגנרטיביות, כגון מחלת פרקינסון, בעתיד, נתמקד בחקירת האופן שבו תפקוד מיטוכונדריאלי והעלאת אנרגיה יכולים להיות מטרות חשובות לטיפולים המכוונים למחלות נוירודגנרטיביות.

analyzing-mitochondrial-function-drosophila-melanogaster-pink1b9-null

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

מיטוכונדריה ממלאים תפקידים מרכזיים בוויסות חילוף החומרים וההומאוסטזיס. שינויים עדינים במטבוליזם המיטוכונדריאלי המשפיעים על הפיזיולוגיה של האורגניזם עשויים להיות קשים לאיתור במחקרי מטבולומיקה של אורגניזמים שלמים. כאן אנו מתארים שיטת בידוד המשפרת את הזיהוי של שינויים מטבוליים עדינים בדרוזופילה מלנוגסטר.

הכנת הברים מועשר מיטוכונדריאלי לניתוח חילוף חומרים ב<em&gt; דרוזופילה</em

ניתוח הקשר בין מבנה המיטוכונדריה לתפקוד נדרש להבנה מעמיקה של מנגנוני הרגולציה של פונקציונליות המיטוכונדריה. שיטות ספציפיות לחקר המבנה והתפקוד המיטוכונדריאלי בשחלות דרוזופילה חיות וקבועות מתוארות ומודגמות במאמר זה.

לימוד מבנה ותפקוד מיטוכונדריאלי תסיסנית שחלות

בנייר זה, מתוארת שיטה למדידת צריכת החמצן באמצעות respirometry ברזולוציה גבוהה ב- thoraxes permeabilized של דרוזופילה. טכניקה זו דורשת כמות מזערית של רקמות לעומת הטכניקה בידוד מיטוכונדריאלי קלאסי, התוצאות המתקבלות רלוונטיים יותר מבחינה פיזיולוגית.

מדידה של צריכת חמצן מיטוכונדריאלי של סיבי Permeabilized דרוזופילה באמצעות כמויות מינימליות של רקמות

אנו מציגים פרוטוקול למדידת צריכת החמצן ואת acidification חוץ-תאית במוח זחל ומבוגרים melanogaster דרוזופילה . מנתח חילוף החומרים מנוצל עם פרוטוקול מותאם וממוטב. מיקרו-רקמת ריסון הינם המכריעים של פרוטוקול זה, היו עיצבת ויצרת במיוחד לשימוש שלהם ניתוח זה.

ניתוח מטבולית של melanogaster דרוזופילה Larval ושכל למבוגרים

אנו מציגים פרוטוקול לצורך שיטת הצביעה של פעילות ציטראט ומטריקה לכימות של מסה מיטוכונדריאלי שלמה ברקמת דרוזוהילה .

מטריקה שיטת הצביעה של פעילות ציטראט סינתאז בדרוזופילה מלאנוסטר

ספירומטריה קולומטרית אידיאלית למדידת קצב חילוף החומרים של אורגניזמים קטנים. כאשר הותאם עבור Drosophila melanogaster במחקר הנוכחי, צריכת O2 שנמדדה הייתה בטווח שדווח עבור סוג בר D. melanogaster על ידי מחקרים קודמים. צריכת O2 לכל זבוב על ידי מוטנטים של ASK שהם קטנים יותר ופעילים פחות, הייתה נמוכה משמעותית מזו של ה-wildtype .

מדידת צריכת O2 בדרוזופילה מלנוגסטר באמצעות מיקרו-רספירומטריה קולומטרית

מאמר זה מתאר שיטה להערכת האינטראקציות וההרכבות של חלבוני ממברנה אינטגרליים במבחנה עם גורמים שותפים שונים בסביבה שומנית-פרוקסימלית.

באמצעות הפיגום ליפוזומים כדי לשקם אינטראקציות ליפידים-הפרוקסימלי חלבונים במבחנה

מאמר זה מציג פרוטוקול לעיבוד cryo-EM תמונות באמצעות חבילת תוכנה SPHIRE. הפרוטוקול הנוכחי יכול להיות מיושם עבור כמעט כל חלקיקים יחיד פרויקטים EM כי היעד ברזולוציה אטומית כמעט.

ברזולוציה גבוהה ניתוח החלקיקים יחיד מאת אלקטרונים Cryo-microscopy תמונות באמצעות SPHIRE

פרוטוקול זה מתאר את ההפרדה של מיטוכונדריאלי תפקודי שרשרת התחבורה אלקטרונים מתח (Cx) IV ו supercomplexes מהם באמצעות אלקטרופורזה יליד לחשוף מידע על הרכבה שלהם המבנה. ג'ל הילידים יכול להיות נתון immunoblotting, מבחני ג'ל, וטיהור על ידי electroelution כדי לאפיין עוד קומפלקסים בודדים.

ניתוח Supercomplexes של Mitochondrial אלקטרונים שרשרת התחבורה עם אלקטרופורזה הילידים, ב-מבחני ג&#39;ל, ו Electroelution

כאן, אנו מציגים שני פרוטוקולים עבור המידה של Ca2 + זרם מיטוכונדריאלי המיטוכונדריה מבודד, תאים בתרבית. עבור המיטוכונדריה מבודד, אנחנו פירוט של צלחת המבוסס על הקורא Ca2 + ייבוא assay באמצעות של Ca2 + רגיש לצבוע סידן ירוק-5N. עבור תאים בתרבית, אנו מתארים שיטה מיקרוסקופיה קונפוקלית באמצעות Ca2 + לצבוע רוד-2/AM.

ניתוחים של סידן מיטוכונדריאלי זרם המיטוכונדריה מבודד, תאים בתרבית

חקור תפקוד מיטוכונדריאלי במוטנט PINK1 B9-null של Drosophila melanogaster באמצעות פרוטוקול רספירומטריה ברזולוציה גבוהה. שיטה זו מאפשרת ניתוח ביואנרגטי מדויק לחקר מחלת פרקינסון.

ניתוח תפקוד מיטוכונדריאלי במוטנט Drosophila melanogaster PINK1^B9-Null באמצעות רספירומטריה ברזולוציה גבוהה

גלה סרטונים נוספים