Name: הדמיית סידן ברשתית שטוחה עם גירוי חשמלי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-08-18T14:25:00.000+00:00
Description: חקור תגובות נוירונים ברשתית בעזרת הדמיית סידן בתכנית שטוחה מבודדת מעכברוש. שיטה זו מאפשרת בחינת תגובות תאים לגירוי חשמלי וקידום פיתוח שתלים רטינליים מתקדמים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים למרס ריבאס, אנחל סנדובל, חסוס פלאנגומה, ג'ורדי קורטס, סנדרה אורטונובס לארה ואלינה הירשמן (ICFO-Institut de Ciències Fotòniques) על תמיכתם הטכנית, לאנה דוארי (VHIR, מכון המחקר ואל ד'חברון) מקבוצת המחקר לרפואת עיניים על תמיכתם בזריקות התוך ויטריאליות ובהדמיית הרשתית in vivo .
גופי המימון שתמכו בעבודה זו הם: Fundació CELLEX; פונדאסיו מיר-פויג; Ministerio de Economía y Competitividad - Severo Ochoa תוכנית למרכזי מצוינות במו"פ (CEX2019-000910-S, [MCIN/AEI/10.13039/501100011033]); Generalitat de Catalunya באמצעות תוכנית CERCA; לייזרלאב-אירופה (EU-H2020 GA מס' 871124); קרן La Caixa (LCF/HR19/52160003); ו-Fondo Social Europeo (PRE2020-095721, M.C).

הערכת פעילות הסידן בשכבת תאי גנגליון ברשתית

<ol><li>Bourne, R. R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+and+causes+of+vision+loss+in+high-income+countries+and+in+Eastern+and+Central+Europe+in+2015%3A+Magnitude%2C+temporal+trends+and+projections%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Prevalence and causes of vision loss in high-income countries and in Eastern and Central Europe in 2015: Magnitude, temporal trends and projections.</a> British Journal of Ophthalmology. 102 (5), 575-585 (2018).</li>
<li>Li, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+and+incidence+of+age-related+macular+degeneration+in+Europe%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Prevalence and incidence of age-related macular degeneration in Europe: a systematic review and meta-analysis.</a> British Journal of Ophthalmology. 104 (8), 1077-1084 (2020).</li>
<li>Roska, B., Sahel, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoring+vision%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Restoring vision.</a> Nature. 557 (7705), 359-367 (2018).</li>
<li>Hornig, R., Velikay-Parel, M. Retina implants. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHornig%2C+R+%22Implantable+Sensor+Systems+for+Medical+Applications%22">Implantable Sensor Systems for Medical Applications</a>. , Elsevier. 469-496 (2013).</li>
<li>Lewis, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+implantable+bionic+devices+for+blindness%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22ANZ+Journal+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Advances in implantable bionic devices for blindness: a review.</a> ANZ Journal of Surgery. 86 (9), 654-659 (2016).</li>
<li>Weiland, J. D., Walston, S. T., Humayun, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+stimulation+of+the+retina+to+produce+artificial+vision%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Vision+Science%22%5BJournal%5D)">Electrical stimulation of the retina to produce artificial vision.</a> Annual Review of Vision Science. 2, 273-294 (2016).</li>
<li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neural+activity+in+worms%2C+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nature Methods. 6, 875-881 (2009).</li>
<li>Chen, T. -W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499, 295-300 (2013).</li>
<li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+signal-to-noise+Ca2%2B+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A high signal-to-noise Ca2+ probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 19, 137-141 (2001).</li>
<li>Sahu, B., Chug, I., Khanna, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ocular+gene+delivery+landscape%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">The ocular gene delivery landscape.</a> Biomolecules. 11 (8), 1135(2021).</li>
<li>Hanlon, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+retinal+ganglion+cell+promoter+for+utility+in+AAV+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A novel retinal ganglion cell promoter for utility in AAV vectors.</a> Frontiers in Neuroscience. 11, (2017).</li>
<li>Weitz, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+response+of+the+retina+to+electrical+stimulation+with+genetically+encoded+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Imaging the response of the retina to electrical stimulation with genetically encoded calcium indicators.</a> Journal of Neurophysiology. 9 (7), 1979-1988 (2013).</li>
<li>Briggman, K. L., Euler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bulk+electroporation+and+population+calcium+imaging+in+the+adult+mammalian+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Bulk electroporation and population calcium imaging in the adult mammalian retina.</a> Journal of Neurophysiology. 105 (5), 2601-2609 (2011).</li>
<li>Baden, T., Berens, P., Franke, K., Román Rosón, M., Euler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+diversity+of+retinal+ganglion+cells+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The functional diversity of retinal ganglion cells in the mouse.</a> Nature. 529, 345-350 (2016).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+sensitive+GCaMP+calcium+indicators+for+imaging+neural+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fast and sensitive GCaMP calcium indicators for imaging neural populations.</a> Nature. 615, 884-891 (2023).</li>
<li>Meyer, E. L., Jenkins, C., Rengarajan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Guidelines+April+2019%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Biosafety%22%5BJournal%5D)">NIH Guidelines April 2019.</a> Applied Biosafety. 24, Preprint at https://doi.org/10.1177/1535676019871146 (2019).</li>
<li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+GCaMP+calcium+indicator+for+neural+activity+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging.</a> Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).</li>
<li>Chang, Y. -C., Walston, S. T., Chow, R. H., Weiland, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GCaMP+expression+in+retinal+ganglion+cells+characterized+using+a+low-cost+fundus+imaging+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neural+Engineering%22%5BJournal%5D)">GCaMP expression in retinal ganglion cells characterized using a low-cost fundus imaging system.</a> Journal of Neural Engineering. 14 (5), 056018(2017).</li>
<li>Weitz, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+spatial+resolution+of+epiretinal+implants+by+increasing+stimulus+pulse+duration%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Improving the spatial resolution of epiretinal implants by increasing stimulus pulse duration.</a> Science Translational Medicine. 7 (318), 1-12 (2015).</li>
<li>Chang, Y. C., Ghaffari, D. H., Chow, R. H., Weiland, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+strategies+for+selective+activation+of+retinal+ganglion+cell+soma+and+threshold+reduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neural+Engineering%22%5BJournal%5D)">Stimulation strategies for selective activation of retinal ganglion cell soma and threshold reduction.</a> Journal of Neural Engineering. 16 (2), 026017(2019).</li>
<li>Im, M., Fried, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+properties+of+network-mediated+responses+to+repetitive+stimuli+are+dependent+upon+retinal+ganglion+cell+type%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neural+Engineering%22%5BJournal%5D)">Temporal properties of network-mediated responses to repetitive stimuli are dependent upon retinal ganglion cell type.</a> Journal of Neural Engineering. 13 (2), 025002(2016).</li>
<li>Jensen, R. J., Ziv, O. R., Rizzo, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thresholds+for+activation+of+rabbit+retinal+ganglion+cells+with+relatively+large%2C+extracellular+microelectrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Thresholds for activation of rabbit retinal ganglion cells with relatively large, extracellular microelectrodes.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (4), 1486-1496 (2005).</li>
<li>Ramos, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-reported+complications+after+intravitreal+injection+and+their+predictive+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology+Retina%22%5BJournal%5D)">Patient-reported complications after intravitreal injection and their predictive factors.</a> Ophthalmology Retina. 5 (7), 625-632 (2021).</li>
<li>Vandenberghe, L. H., Auricchio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+adeno-associated+viral+vectors+for+retinal+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Novel adeno-associated viral vectors for retinal gene therapy.</a> Gene Therapy. 19 (2), 162-168 (2012).</li>
<li>Zin, E. A., Ozturk, B. E., Dalkara, D., Byrne, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+new+vectors+for+retinal+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Developing new vectors for retinal gene therapy.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. , a041291(2023).</li>
<li>Haggerty, D. L., Grecco, G. G., Reeves, K. C., Atwood, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+viral+vectors+in+neuroscience+research%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy-Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated viral vectors in neuroscience research.</a> Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 17, 69-82 (2020).</li>
<li>Hellström, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+tropism+and+transduction+properties+of+seven+adeno-associated+viral+vector+serotypes+in+adult+retina+after+intravitreal+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Cellular tropism and transduction properties of seven adeno-associated viral vector serotypes in adult retina after intravitreal injection.</a> Gene Therapy. 16 (4), 521-532 (2009).</li>
<li>Resendez, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+cortical%2C+subcortical+and+deep+brain+neural+circuit+dynamics+during+naturalistic+mammalian+behavior+with+head-mounted+microscopes+and+chronically+implanted+lenses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Visualization of cortical, subcortical and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses.</a> Nature Protocols. 11, 566-597 (2016).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+calcium+sensor+GCaMP-X+overcomes+the+calcium+channel+perturbations+induced+by+the+calmodulin+in+GCaMP%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Improved calcium sensor GCaMP-X overcomes the calcium channel perturbations induced by the calmodulin in GCaMP.</a> Nature Communications. 9, 1504(2018).</li>
<li>Nieuwenhuis, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+adeno-associated+viral+%28AAV%29+vector-mediated+transgene+expression+in+retinal+ganglion+cells%3A+comparison+of+five+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Improving adeno-associated viral (AAV) vector-mediated transgene expression in retinal ganglion cells: comparison of five promoters.</a> Gene Therapy. 30, 503-519 (2023).</li>
<li>Cunquero, M., Aguilar, E., Loza-Alvarez, P., Planagumà, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+neuronal+cultures+to+detect+and+study+new+pathogenic+antibodies+involved+in+autoimmune+encephalitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Hippocampal neuronal cultures to detect and study new pathogenic antibodies involved in autoimmune encephalitis.</a> Journal of Visualized Experiments. 184, e63829(2022).</li>
<li>Behrend, M. R., Ahuja, A. K., Humayun, M. S., Chow, R. H., Weiland, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+of+the+epiretinal+prosthesis+is+not+limited+by+electrode+size%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Neural+Systems+and+Rehabilitation+Engineering%22%5BJournal%5D)">Resolution of the epiretinal prosthesis is not limited by electrode size.</a> IEEE Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 19 (4), 436-442 (2011).</li>
<li>Grienberger, C., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+calcium+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging calcium in neurons.</a> Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).</li>
</ol>

למחברים אין גילויים להוסיף לכתב היד.

הפרוטוקול המתואר כאן משמש לחקר דינמיקת הסידן המתרחשת ברשתית החולדה GCL לאחר גירוי חשמלי המסופק עם MEA. זוהי שיטה אמינה וניתנת לניהול אך דורשת הכשרה מסוימת, במיוחד כדי לתייג באופן אחיד את ה- GCL ביעילות ולהרכיב את הרשתית כראוי כדי להבטיח מגע אופטימלי בין רקמה לאלקטרודה. פרוטוקול זה הוא ספציפי למכרסמים ויש להתאים אותו אם הוא מיושם על מין מעבדה אחר. הנקודות הקריטיות, השינויים והמגבלות של המתודולוגיה מוצגים בפירוט.
זריקות תוך ויטריאליות זריקות נמצאות בשימוש נרחב להעברת גנים עיניים, כאשר זריקות תוך ויטריאליות הן ההליך המועדף. הם הוכחו כבטוחים יותר ופחות פולשניים בהשוואה לזריקות תת-רשתית, אשר מציגות את המולקולות המעניינות ישירות בין הפוטורצפטורים לבין אפיתל פיגמנט הרשתית (RPE), ומסתכנות בהיפרדות רשתית10. עם זאת, ישנן מגבלות, במיוחד בעת ביצוע זריקות אלה במודלים מכרסמים. הומור הזגוגית הוא ג'לטיני, מעכב דיפוזיה ויראלית. יתר על כן, העדשה בעיני מכרסם היא גדולה, מה שהופך את זה לא טריוויאלי להחדיר את המחט מבלי לשרוט אותה. מחטי המזרק המדויקות עדינות ויש להחליף אותן לעתים קרובות. כדי למנוע חסימה, שטפו אותם במים נטולי יונים, לפני ואחרי כל שימוש והחליפו אותם באופן קבוע. בנוסף, יש להזריק את התוכן באיטיות כדי למנוע ריפלוקס תמיסה ושינויים בלחץ התוך עיני. השגת פלואורסצנטיות גדולה ואחידה על פני הרשתית עשויה לדרוש תרגול.
התמרה של תאי רשתית וקטורים נגיפיים הם שיטה מצוינת להעברת גנים in vivo, ו- AAVs נמצאים בשימוש נרחב להמרת תאי רשתית10. הם אושרו כטיפול בכמה רטינופתים הגורמים לעיוורון אנושי24. עם זאת, קיבולת הנשא שלהם מוגבלת ל- 5 קילו-בתים, כולל האלמנטים הרגולטוריים הנדרשים (למשל, המקדם)10,25. ישנם מספר סרוטיפים זמינים, כל אחד עם טרופיזם שונה. בחר את AAV המתאים ביותר בהתבסס על הגנים שיועברו והתאים שיועברו26. עבור תיוג RGCs, מומלץ להשתמש AAV227.
חלון ביטוי גנים הביטוי הנגיפי האופטימלי עבור AAV2-CAG-GCaMP5G הוא 2 עד 3 שבועות לאחר הזרקת12,18. מעבר לפרק זמן זה, הגרעינים של תאים נגועים הופכים פלואורסצנטיים, תאים מפסיקים להגיב לגירויים, ובסופו של דבר מתים 7,28,29. זאת בשל ביטוי יתר של מחוון GCaMP, אשר translocated לתוך הגרעין. חלון הזמן לביטוי גנים אופטימלי ישתנה בהתאם לווקטור הנגיפי ולמקדםשנבחר 30 ויש לקבוע אותו באופן ניסיוני לפני שתמשיך בפרוטוקול זה.
מגע רקמות-אלקטרודות לקבלת תוצאות אופטימליות וניתנות לשחזור, השגת מגע טוב בין רקמה לאלקטרודה היא חיונית. מגע לקוי נובע בדרך כלל מהעקמומיות הטבעית של הרשתית. גישה אחת היא לחתוך את הרשתית לרבעים, להרכיב ולצלם קטע אחד בכל פעם. חלקים קטנים של הרשתית יכולים להיות שטוחים טוב יותר, וכתוצאה מכך מגע יעיל יותר עם פני השטח של MEA. סיבה אפשרית נוספת למגע לקוי היא נוכחות של הומור זגוגית. בעת ביצוע ניסויי גירוי המדמים שתל אפי-רשתית, חשוב להסיר בזהירות את הומור הזגוגית במהלך כריתת הרשתית מכיוון שהוא יכול לשמש כמבודד לזרם. כאן, שיטה פשוטה מתוארת כדי לבדוק אם המגע מספיק על ידי הדמיה של האלקטרודה והתאים באותו מישור מוקד.
חלופה למדידות רשתית ex vivo היא לגדל נוירונים ישירות על פני השטח של האלקטרודות. תרבית ראשונית של נוירונים, כגון נוירונים בהיפוקמפוס31, יכולה להיות שימושית לבדיקות ראשוניות כדי להעריך את הפונקציונליות של המכשיר המגרה החדש. עם זאת, גישה זו עדיין דורשת שימוש בחיות מעבדה ואינה מייצגת את המורכבות של רשת הרשתית, החשובה להערכת תגובות סינפטיות לגירוי.
כדי להמחיש את התאים שמתחת לעקבות האלקטרודות והאלקטרודות, MEAs המיוצרים מחומרים שקופים כגון תחמוצת בדיל אינדיום (ITO) יכולים לשמש 19,20,32. בנוסף למדידות אופטיות, ניתן להעריך את פעילות GCL על גירוי חשמלי באמצעות הקלטות חשמליות. ניתן להשתמש ב-MEA כדי לרשום את פוטנציאל השדה המקומי (LFP) של הרקמה. עם זאת, הדבר פוגע ברזולוציה המרחבית, שכן כל אלקטרודה לוכדת פעילות מספר תאים בו זמנית (בהתאם לממדי האלקטרודה). הקלטה אופטית מתגברת על מגבלה זו ומציעה מיפוי ברזולוציה מרחבית גבוהה יותר. היתרון העיקרי שלה הוא היכולת להבחין בין תאים פעילים ולא פעילים תוך מדידת FOV גדול עם רזולוציה של תא בודד. מבין כל מדווחי הפעילות התאית, מדדי סידן מתוארים היטב ונמצאים בשימוש הנפוץ ביותר33.

הרשתית מכילה פוטורצפטורים, שהם תאים האחראים על חישת אור. הם לוכדים פוטונים וממירים אותם לדחפים עצביים. דחפים אלה מעובדים בתוך הרשתית ומועברים לקליפת המוח הראייתית, וכתוצאה מכך נוצרת תמונה חזותית1. רטיניטיס פיגמנטוזה (RP) וניוון מקולרי תלוי גיל (AMD) הן מחלות ניווניות המאופיינות באובדן פרוגרסיבי של פוטורצפטורים. רטינופתיה זו היא בין הגורמים המובילים לעיוורון ברחבי העולם1, משפיעה על מיליוני אנשים ויש לה השלכות רפואיות, אישיות וסוציו-אקונומיות משמעותיות על חולים, מערכות בריאות והחברה כולה. יתר על כן, עם הזדקנות האוכלוסייה, צפוי כי מקרי AMD יגדל ב -15% עד 20502.
כיום, נעשים מאמצי מחקר רבים כדי לשחזר את הראייה בחולים שנפגעו ממצבים אלה3. גישה מבטיחה אחת היא השימוש בתותבות רשתית, אשר הוכיחו יעילות בשחזור חלקי של ראייה 4,5. מכשירים אלה לוכדים אור מהסצנה החזותית וממירים אותו לפולסים חשמליים. פולסים אלה מועברים באמצעות אלקטרודות בתוך מערך מיקרואלקטרודות (MEA) המושתל בעין, מגרה את תאי העצב ששרדו ועוקף את תפקודם של הפוטורצפטורים שאבדו. תאי גנגליון הרשתית המופעלים (RGCs) מעבירים את הפלט למוח, שם הוא מתפרש כתפיסה חזותית. עם זאת, המגבלות העיקריות של השתלים הנוכחיים טמונות ברזולוציה של ממשק אלקטרודה-רקמה6 וגירוי לא סלקטיבי של סוגי תאים שונים. לכן, כדי לייעל את התכנון של התקנים מושתלים חדשים לשיקום ראייה יעיל יותר, חיוני להבין כיצד ניתן לפתח פרדיגמות גירוי כדי להפעיל באופן סלקטיבי תאים בסמיכות לאלקטרודות.
הדמיית סידן היא טכניקה נפוצה לחקר פעילות עצבית, המציעה מספר יתרונות על פני שיטות לא אופטיות 7,8. ראשית, הוא מספק רזולוציה סלולרית ותת-תאית. שנית, סמני סידן יכולים להתמקד בסוגי תאים ספציפיים. שלישית, היא מאפשרת מעקב ארוך טווח, ורביעית, היא מאפשרת תצפית על אוכלוסיות תאים שלמות תוך הבחנה בין תאים פעילים ללא פעילים. שיטה זו מספקת עדות עקיפה לפעילות תאית ברזולוציה טמפורלית בטווח של מאות אלפיות השנייה. מדדי סידן פלואורסצנטיים המקודדים גנטית, כגון חיישני GCaMP, עוברים שינוי קונפורמציה עם קשירה לסידן, וכתוצאה מכך פלואורסצנטיות מוגברת9. וקטורים נגיפיים רקומביננטיים הקשורים באדנו (AAVs) הם אמצעי יעיל להמרת תאי רשתית עם GCaMP10.
פרוטוקול זה מציג שיטה יעילה המנצלת הדמיית סידן לבדיקת פרוטוקולי גירוי של שתלי רשתית. באופן ספציפי, אנו מתמקדים ברקמת הרשתית של חולדה ex vivo ומספקים הוראות מפורטות שלב אחר שלב, החל מרכישת דגימה ועד ניתוח נתונים. על ידי הצעת מדריך מקיף זה, חוקרים מרקעים שונים יכולים להתחיל ניסויים גירוי חשמלי בביטחון.

<table><tbody><tr><td>20x NA 0.75 S פלואור אוויר אובייקט</td><td>ניקון</td><td>CFI סופר פלואור 20X-3.5</td><td></td></tr> <tr><td>ס"מ צלחת תרבית תאים</td><td>Nunc</td><td>12-565-90-30</td><td></td></tr> <tr><td>G מחט</td><td>VWR</td><td>613-5373-36</td><td></td></tr> <tr><td>G מחט קהה</td><td>World Precision Instruments</td><td>NF36BL-2-6</td><td></td></tr> <tr><td>ס"מ צלחת תרבית תאים</td><td>Nunc</td> 12-565-94-AAV2-CAG-GCaMP5G <td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>וקטור ביולאבס</td> <td>-</td><td></td></tr> <tr><td>סיגמא אולדריץ</td>' <td>A1420-להב</td><td></td> <td>Swann-morton 0308 של איימס</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>- מצלמה</td><td>Hamamatsu</td><td>ORCA פלאש v4.0-קרבוגן</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>אוויר נוזלי</td> <td>-</td><td></td></tr> <tr><td>מלקחיים מעוקלים&nbsp;</td><td>-</td><td>--</td><td></td></tr> <tr><td>מספריים קפיצים עדינים</td><td>FST</td><td>91501-09-FITC</td><td></td></tr> <tr><td>קוביית פילטר</td><td>Nikon</td><td>Standard סדרה</td> <td>-</td></tr> <tr><td>מנורת פלורסנט</td><td>Nikon&nbsp;</td><td>C-HGFI-סטריאומיקרוסקופ</td><td></td></tr> <tr><td>פלואורסצנטי&nbsp;</td><td>ניקון</td><td>SMZ25-HBSS</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>מזל גדי</td><td>HBSS-1A-ImageJ</td><td></td></tr><tr><td>/FIJI&nbsp;</td><td>NIH</td><td>v1.50i-מערכת</td><td></td></tr> <tr><td>הדמיית רשתית in vivo&nbsp;</td><td>מעבדות המחקר של פיניקס</td><td>מיקרון III</td> <td>-</td></tr> <tr><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך</td><td>Nikon</td><td>Eclipse</td><td></td></tr> <tr><td>Ti-Isofluorane</td><td>Arrane Baxter Laboratories</td><td></td>-<td>-</td></tr><tr><td>Long-Evans rat</td><td>Janvier</td><td></td>-<td>-</td></tr><tr><td>MATLAB (גרסה R2021b)&nbsp;</td><td>Mathworks</td> <td>-</td><td></td></tr> <tr><td>מסנני מדיה</td><td>Merckmillipore</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>SCGPS02RE-Methocel 2%</td> <td>Omni Vision</td> <td>-</td> <td>מערך</td></tr> <tr><td>מיקרואלקטרודות (MEA)</td> <td>-</td> <td>NaHCO</td><td></td></tr><tr><td>3</td><td>Thermofisher</td><td>42427-פניצילין</td><td></td></tr><tr><td>/סטרפטומיצין 100x</td><td>Thermofisher</td><td>15140122</td><td>- </td></tr><tr><td>פנילפרין</td><td>אלקון Cus&iacute; מעבדות</td><td>653437.3</td><td>100 מ"ג/מ"ל</td></tr><tr><td>פיפטה מפלסטיק</td><td>VWR</td><td>612-1793-ממברנה</td><td></td></tr> <tr><td>נקבובית</td><td>Merckmillipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>#JVWP01300-מזרק מדויק</td><td>מכשירי דיוק עולמיים</td><td>10 ומיקרו; l ננופיל-פרסקאינה</td><td></td></tr><tr><td></td> לורנס-אוקסיבופרוקאין <td></td><td></td><td>כלורוהידרט (2 מ"ג/מ"ל), הרדמה מקומית</td></tr><tr><td>מסכת אף עכברוש</td><td>Xenotec</td><td>XRK-RA-מלקחיים</td><td></td></tr> <tr><td>מעוקלים קטנים&nbsp;</td><td>Bbraun</td><td></td><td></td> AESCBD311R-מספריים-קפיץ</tr><tr><td>&nbsp;</td><td>FST</td><td>15040-11-מיקרוסקופ</td><td></td></tr> <tr><td>סטריאו</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000-מלקחיים</td><td></td></tr> <tr><td>ישרים&nbsp;</td><td>FST</td><td>11252-20-חוט</td><td></td></tr> <tr><td>תפר</td><td>ויטרקס רפואי</td><td>4328</td><td>מונופילמנט נילון, 7/0, DS12</td></tr><tr><td>Tobradex</td><td>Alcon Cus&iacute; </td><td>מעבדות-טוברמיצין (3 מ"ג/מ"ל) ודקסמתזון (1 מ"ג/מ"ל)</td><td></td></tr><tr><td>טרופיקמיד</td><td>אלקון Cus&iacute; מעבדות</td><td>653486</td> מכונת כביסה <td>10 מ"ג/מ"ל</td></tr><tr><td></td><td>Thorlabs</td><td>W8S038</td><td>-</td></tr></tbody></table>

הדמיית סידן ברשתית שטוחה עם גירוי חשמלי

Calcium Imaging In Electrically Stimulated Flat-Mounted Retinas

ניוון רשתית הוא גורם מוביל לעיוורון ברחבי העולם. מאמצים נרחבים נעשים לפתח תותבות רשתית מתקדמות שיכולות לעקוף את תאי קולטני האור הלקויים ברשתית המנוונת, במטרה לשחזר חלקית את הראייה על ידי גרימת תפיסת ראייה. אפיק חקירה נפוץ אחד כרוך בתכנון וייצור של התקנים מושתלים בעלי מבנה פיזי גמיש, המאכלס מספר גבוה של אלקטרודות. זה מאפשר יצירה יעילה ומדויקת של תפיסות חזותיות. עם זאת, עם כל התקדמות טכנולוגית, מתעורר צורך בשיטת ex vivo אמינה וניתנת לניהול כדי לאמת את הפונקציונליות של המכשיר לפני התקדמות לניסויים in vivo , שבהם גורמים מעבר לביצועי המכשיר נכנסים לפעולה. מאמר זה מציג פרוטוקול מקיף לחקר פעילות הסידן בשכבת תאי גנגליון הרשתית (GCL) בעקבות גירוי חשמלי. באופן ספציפי, השלבים הבאים מתוארים: (1) תיוג פלואורסצנטי של רשתית החולדה באמצעות מחווני סידן מקודדים גנטית, (2) לכידת האות הפלואורסצנטי באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך תוך יישום דפוסים ברורים של גירוי חשמלי, ו-(3) חילוץ וניתוח עקבות הסידן מתאים בודדים בתוך GCL. על ידי ביצוע הליך זה, חוקרים יכולים לבדוק ביעילות פרוטוקולי גירוי חדשים לפני ביצוע ניסויים in vivo .

הפרוטוקול המתואר במחקר זה מבוסס על מחקרי הדמיה פלואורסצנטית וגירוי חשמלי שנערכו על ידי וייץ ואחרים.12. הפרוטוקול מורכב משלושה חלקים עיקריים: (1) תיוג פלואורסצנטי של GCL והרכבה שטוחה של הרשתית על MEA (איור 1-משמאל), (2) הדמיה של פעילות הסידן ב-GCL במהלך גירוי חשמלי (איור 1-באמצע), ו-(3) מיצוי, עיבוד ופענוח של נתוני הדימות (איור 1-מימין).
ראשית, כפי שמתואר באיור 1-משמאל, חולדות Long Evans מוזרקות תוך ויטוויט עם AAV2-CAG-GCaMP5G לפני סשן ההדמיה. הביטוי הנגיפי האופטימלי לווקטור זה מתרחש 2 עד 3 שבועות לאחר הזרקת12,18. לאחר הרדמה מלאה של החיה, חור פיילוט נעשה באמצעות מחט 30 גרם, ולאחר מכן 5 μL של AAV2-CAG-GCaMP5G מוזרק לאט לתוך הזגוגית באמצעות מחט 36 G קהה מחובר מזרק מדויק כדי למנוע ריפלוקס. במהלך ביטוי ויראלי, מערכת דימות רשתית in vivo משמשת להערכת מצב הרשתית לאחר הניתוח, עם תמונות OCT המספקות הדמיה מפורטת של שכבות הרשתית. לאחר השגת ביטוי גנים, הרשתית מופקת בזהירות מכוס העין באמצעות מיקרוסקופ סטריאופוני וכלי דיסקציה מדויקים. מנקודה זו ואילך, הרקמה עוברת מניפולציה במדיה מחומצנת כדי לשמר את הדגימה. הרשתית הנכרתה, כאשר ה-GCL פונה כלפי מעלה, מורכבת לאחר מכן על פלטפורמה המיועדת להרכבה שטוחה כדי להבטיח יציבות ולמנוע ציפה של דגימה. הדגימה מותקנת על משטח MEA כאשר ה-GCL פונה לאלקטרודות.
לאחר מכן, MEA מורכב על לוח הממשק שלו במיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך (איור 1-באמצע). דגימת הרשתית מחוררת עם מדיה מחומצנת ב 33 ° C באמצעות מערכת זילוח. ניתן לשמור את הדגימה בתצורה זו במשך מספר שעות. ערכת הגירוי הרצויה מתוכנתת, והתמונות נרכשות בקצב של 10 מסגרות לשנייה. מומלץ לתת שמות לסרטים בהתאם לפרמטרים של גירוי חשמלי. רכישת תמונה צריכה להתחיל לפני תחילת הגירוי כדי להשיג כמה מסגרות בסיסיות ללא גירוי, אשר ישמש שליטה שלילית.
לבסוף, כפי שמודגם באיור 1-מימין, הנתונים מופקים מתמונות קיטועי הזמן על-ידי פילוח הסומות של התא. אפקטים של הלבנה מתוקנים על-ידי התאמת הנתונים, ותאים מגיבים מזוהים. תאים מגיבים מוגדרים כתאים עם שיאי פלואורסצנטיות במהלך גירוי העולה על קו הבסיס שלהם פי 2.5. אם תא מגיב לשלושה מתוך חמשת פרצי הגירוי, הוא נחשב כמגיב לאותה רכבת גירוי ספציפית.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65705/65705fig01v4.jpg"> איור 1: סקירה כללית של המחקר. המחשה סכמטית של פרוטוקול התיוג הפלואורסצנטי (משמאל) של ה-GCL של הרשתית והרכבת הדגימה, (באמצע) הכנה להקלטות ex vivo עם גירוי חשמלי המסופק על ידי MEA, וניתוח (מימין) של נתוני דימות הסידן כדי לסווג תאים מגיבים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65705/65705fig01largev2.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
רשתית תוך ויטריאלית מוזרקת שכיחות הסיבוכים הקשורים לזריקות תוך ויטריאליות נמוכה מאוד. עם זאת, ישנם כמה סיבוכים שיכולים לנבוע מהניתוח עצמו, ללא קשר למרכיב המוזרק. סיבוכים אלה כוללים היווצרות קטרקט, דימום בזגוגית, העלאת לחץ תוך עיני ואנדופתלמיטיס23. כדי לקבוע אם סיבוכים אלה נגרמים על ידי הניתוח, בעל החיים צריך לעבור הערכה לפני ההליך באמצעות פונדוסקופיה ו OCT. שלושה ימים לאחר ההזרקה, בעלי החיים צריכים להיות במעקב. באיור 2A-D מוצגת הרשתית של חיה מוזרקת בריאה. לאחר שבועיים של הזרקה, ה-RGCs מתחילים לבטא פלואורסצנטיות, אשר ניתן לדמיין באמצעות פונדוסקופיה פלואורסצנטית (איור 2B,C). תמונות OCT מספקות הדמיה מפורטת של הנטייה והעובי של שכבות הרשתית (איור 2D), ומציעות רזולוציה גבוהה יותר בהשוואה לפונדוסקופיה, במיוחד בעת הערכת היפרדות רשתית. ברגע שהרשתית מותקנת שטוחה ומצולמת באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך, ניתן להבחין בין התאים וצרורות האקסונים. שלא כמו מדדי סידן אחרים, מחוון GCaMP מוגבל לציטופלסמה7, ופלואורסצנטיות אינה נכללת בגרעין (איור 2E).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65705/65705fig02.jpg"> איור 2: תמונות מייצגות של הרשתית התוך ויטריאלית. (A) פונדוסקופיה, (B) פונדוסקופיה פלואורסצנטית, (C) זום אין של פונדוסקופיה פלואורסצנטית, (D) תמונת OCT, ו-(E) תמונת אפי-פלואורסצנטיות של הרשתית הנכרתת המורכבת על MEA מותאם אישית עם אלקטרודות מבוססות גרפן על זכוכית בורוסיליקט בעובי 500 מיקרומטר. ב- (E), קווים שחורים תואמים לעקבות Ti/Au. פסי קנה מידה: 115 מיקרומטר (D) ו- 100 מיקרומטר (E). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65705/65705fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
אלקטרודות ומגע GCL על מנת לעורר תגובות עצביות ביעילות, חיוני לוודא כי הרשתית השטוחה נמצאת במגע הדוק עם פני השטח של MEA. דרך פשוטה לאמת זאת היא על-ידי אישור חזותי אם התאים והאלקטרודות ממוקמים באותו מישור מוקד (איור 3A). אם התאים אינם נמצאים באותו מישור מוקד כמו האלקטרודות (איור 3B), הדבר מצביע על כך שהמגע אינו אופטימלי, מה שיגרום לגירוי פחות יעיל.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65705/65705fig03.jpg"> איור 3: אלקטרודות ומגע GCL. (A) תאים והאלקטרודה (כוכבית) באותו מישור מוקד. (B) תאים ואלקטרודות שאינם באותו מישור מוקד, דבר המצביע על מגע תת-אופטימלי לגירוי חשמלי באותו אזור. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65705/65705fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
הדמיית סידן Ex vivo על גירוי חשמלי המסופק על ידי MEA הנתונים המתקבלים מהדמיית סידן מורכבים מתמונות בהילוך מהיר המנטרות את הפעילות העצבית של מאות תאים בתגובה לגירוי חשמלי. גירויי Suprathreshold גורמים לזרימת סידן לתוך הסומות של התא, וכתוצאה מכך שינוי פתאומי בעוצמת הפלואורסצנטיות (וידאו 1). פרוטוקול זה מאפשר לקבוע אם אלקטרודה, MEA ו/או אלגוריתם גירוי מעוררים את התגובה הרצויה ברקמה העצבית. הגודל והגובה של האלקטרודות ב-MEA, כמו גם שיעור הרקמה הנחקרת, יקבעו את ההגדלה האובייקטיבית המתאימה לבחירה. בדרך כלל, עבור מחקרים על גירוי אלקטרודה בודדת בקטרים הנעים בין 5 מיקרומטר ל-100 מיקרומטר, הגדלה אובייקטיבית של פי 20-25 מתאימה (איור 4A), המספקת FOV של כ-600 מיקרומטר x 600 מיקרומטר. עבור ניסויים הכוללים גירוי עם אלקטרודות מרובות, הגדלה אובייקטיבית של 4-10x עשויה להיות נחוצה כדי להעריך שטח רחב יותר של סביב 2 מ"מ x 2 מ"מ. ניתן לזהות בקלות תאים מגיבים על-ידי יצירת הקרנת תמונה בסטיית תקן של סרט קיטועי זמן (איור 4B ווידאו 1).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65705/65705fig04.jpg"> איור 4: הדמיית סידן של GCL עם גירוי חשמלי המסופק על-ידי אלקטרודה בקוטר 25 מיקרומטר. (A) הקרנה מרבית של סרט בהילוך מהיר של 60 שניות ו-(B) הקרנה בסטיית תקן המתארת בבירור תאים המגיבים לגירויים חשמליים מאלקטרודה נקבובית המבוססת על גרפן בקוטר 25 מיקרומטר. האלקטרודה המגרה מסומנת בכוכבית. סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65705/65705fig04large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
ניתוח דינמיקת הסידן לאורך זמן לאחר גירוי מבוקר עבור כל סומא תאים שזוהה, ערכי העוצמה הממוצעת חולצו לאורך זמן. איור 5A מראה את עקבות הסידן המתוקנות בפוטו-אקונומיקה מהתאים המגיבים. בדוגמה זו, חמישה התפרצויות של רכבות פולס דו-פאזיות (קתודיות-ראשונות, 40 מחזורים, משך 1 אלפיות השנייה, משרעת 2 מיקרו-אמפר) נמסרו כל 10 שניות (מסומנות בקווים שחורים) במהלך רכישת תמונה של 60 שניות. בתוך ניסוי נתון, אותן חמש רכבות פולס מופעלות כדי לבחון את עקביות התגובה. המסגרות שצולמו בתקופות שאינן מעוררות (מודגשות באדום) משמשות לביצוע התאמה ליניארית, תוך תיקון אפקט ההלבנה.
לאחר זיהוי התאים המגיבים, והקואורדינטות שלהם (x,y) ידועות ביחס לאלקטרודה המעוררת, ניתן לבחון את הקשר בין הזרם הדרוש להפעלת התאים לבין המרחק מהאלקטרודה המעוררת (איור 5B). כצפוי, תאים הממוקמים קרוב יותר לאלקטרודה המגרה דורשים ערכי זרם נמוכים יותר כדי לעורר תגובה.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65705/65705fig05.jpg"> איור 5: ייצוג התגובות החשמליות. (A) עקבות סידן של סומות תאים על 5 התפרצויות של רכבות פולס (דו-פאזית, קתודית-ראשונה, 40 מחזורים, משך אלפית שנייה אחת, משרעת 2 מיקרו-אמפר) כל 10 שניות (קווים שחורים) במהלך רכישת תמונה של 60 שניות. מוצגות נקודות לא מגרה (מסגרות עם סימון אדום) ונקודות גירוי (מסגרות עם סימון צהוב). עקבות העולות על אות הבסיס (ריבוע ממוצע השורש של התקופות הלא מעוררות) פי 2.5 נחשבות לתגובות מעוררות. תאים המגיבים בשלוש מתוך חמש תקופות הגירוי מסווגים כתאים מגיבים. (B) מפת התפלגות פעילות סידן המציגה את האלקטרודה המגרה (עיגול שחור מסומן) ואת התאים (עיגול אפור עם קווי מתאר). קוד הצבע מייצג את משרעת הפולס המינימלית הדרושה כדי לעורר תגובה תאית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65705/65705fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
וידאו 1: הדמיית סידן של GCL עם גירוי חשמלי המסופק על ידי אלקטרודה בקוטר 25 מיקרומטר. הסרטון מציג הבדלים בעוצמת הפלואורסצנטיות עקב גירוי חשמלי מאלקטרודה נקבובית מבוססת גרפן בקוטר 25 מיקרומטר. הצד השמאלי מציג את הסרט המקורי, והצד הימני מציג את הקרנת סטיית התקן שבה ניתן לזהות בקלות תאים מגיבים. סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65705/Figure_S1.avi" target="_blank">אנא לחץ כאן להורדת סרטון זה.</a>

תותבות רשתית יש את היכולת ליצור תפיסות חזותיות. כדי לקדם את הפיתוח של תותבות חדשות, יש צורך בשיטות ex vivo כדי לבדוק מכשירים לפני ההשתלה. מאמר זה מספק פרוטוקול מקיף לחקר פעילות הסידן בשכבת תאי גנגליון הרשתית כאשר הוא נתון לגירוי חשמלי.

Retinal dystrophies are a leading cause of blindness worldwide. Extensive efforts are underway to develop advanced retinal prostheses that can bypass the ...

למרות שהיו ניסיונות לבדוק התקנים מושתלים ברשתית בשיטות ex vivo, פרוטוקול יסודי ומפורט מאיסוף דגימות לניתוח נתונים היה חסר. בעבודה זו, אנו שואפים למלא את הפער הזה ולספק לחוקרים מרקעים שונים את הכלים הדרושים כדי להתחיל בביטחון בניסויים לגירוי רשתית עצבית. דימות סידן היא טכניקה פופולרית לחקר פעילות עצבית המציעה מספר יתרונות על פני שיטות לא אופטיות.הוא מספק רזולוציה תאית ויכול להתמקד בסוגי תאים ספציפיים. הוא שימושי במיוחד לבדיקת MEAs חדשים מכיוון שהוא מאפשר הבחנה בין תאים פעילים ולא פעילים בעת גירוי חשמלי. אנו מציגים מתודולוגיה חזקה לחקר התגובות של נוירוני הרשתית באמצעות הדמיית סידן.גישה זו יכולה להציע תובנה לגבי עירור סלקטיבי של התאים, צעד קריטי בפיתוח פרוטוקולי גירוי טובים יותר, שיפור ביצועי השתל וקידום מצב האמנות. המעבדה שלנו מתמקדת בפיתוח טכניקות מיקרוסקופיה מתקדמות. כיום, אנו עובדים על רישום דינמיקת סידן בתלת-ממד כדי להשיג הבנה טובה יותר של האינטראקציה השלילית ברקמה כולה.

calcium-imaging-in-electrically-stimulated-flat-mounted-retinas

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

כאן אנו מתארים פרוטוקול להכנת אגר, מוטבע פרוסות רשתית המתאימים electrophysiology ו Ca2 + הדמיה. שיטה זו מאפשרת ללמוד סרט מסוג הסינפסות microcircuits הרשתית באמצעות תיקון ישיר, מהדק הקלטות של אחד מסופי העצב presynaptic.

Patch-clamp מדידות קיבול ו Ca 2 + הדמיה על מסופי עצב יחיד ב Slices רשתית

פעילות ספונטנית של פיתוח רשתות נוירונים ניתן למדוד באמצעות AM-אסתר צורות של סידן רגיש צבעים אינדיקטור. שינויים סידן תוך תאי, המציין ההפעלה העצבית, מזוהים כמו שינויים חולפות הקרינה אינדיקטור עם אחד או שני פוטונים הדמיה. פרוטוקול זה יכול להיות מותאמים עבור מגוון של רשתות נוירונים התפתחותית...

סידן הדמיה תפקודית בפיתוח רשתות קליפתיים

מקור: Zhilyakov, N. V. et al., רישום מעברי סידן בצומת עצבי-שרירי של עכבר עם רזולוציה זמנית גבוהה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. J. Vis. Exp. (2021)סרטון זה מדגים את טכניקת ההדמיה של הקלטת מעברי סידן מהירים בקצות העצבים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. על ידי גירוי העצב ולכידת שינויים פלואורסצנטיים מצבעים קושרי סידן, הוא מדמיין זרם סידן דינמי ופינוי בקצה העצב, ומציע תובנות מדויקות לגבי פעילות סינפטית ואיתות עצבי-שרירי.

הדמיה של מעברי סידן מהירים בקצות עצבים של עכברים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית

פרוטוקולי אימונוהיסטוכימיה משמשים ללמוד את הלוקליזציה של חלבון מסוים ברשתית. טכניקות הדמיה סידן מועסקות ללמוד דינמיקת סידן בתאי הגנגליון ברשתית והאקסונים שלהם.

שיטות הדמיה אימונוהיסטוכימיים וסידן בWholemount עכברוש הרשתית

אנו מתארים פרוטוקול לעקוב אחר דינמיקת 2 + Ca במסופים האקסון של קולטני האור חרוט באמצעות הכנת פרוסה לשעבר vivo של רשתית העכבר. פרוטוקול זה מאפשר מחקרים מקיפים של איתות קונוס Ca 2 + במערכת מודל של יונקים חשוב, העכבר.

ההדמיה Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Dynamics בסופי קון קולטי האור אקסון של רשתית העכבר

הוסר לאחר מהגוף, רקמה עצבית היא השפיעה מאוד על ידי תנאים סביבתיים, המוביל השפלה הסופי של רקמות לאחר 6 - 8 שעות. באמצעות שיטת דגירה ייחודית, אשר מקיימים מעקב קפדני אחרת ומסדירה את הסביבה התאית של הרקמות, כדאיויות רקמות ניתן להאריך באופן משמעותי עבור&gt; 24 שעות.

דגירה ממושכת של רקמות חריפות עצביות עבור Electrophysiology ו-הדמית סידן

כאן אנו מציגים פרוטוקול סידן התמונה איתות באוכלוסיות של סוגי תאים בודדים באזור צומת עצב-שריר מאתר.

לשעבר Vivo הדמיה של סידן לתא ספציפי איתות על הסינפסה התלת-צדדי של הסרעפת העכבר

הדמיית סידן תאים היא מתודולוגיה רב-תכליתית לחקר איתות דינמי של תאים בודדים, על אוכלוסיות מעורבות בתרבית או אפילו על בעלי חיים מתעוררים, המבוססת על הביטוי של ערוצים / קולטנים חדירים לסידן המעניקים חתימות פונקציונליות ייחודיות.

הדמיה של שינויים במעגל נוירון-גליה בטכניקת הדמיית הסידן

הפרוטוקול הנוכחי מתאר יצירת חלון גולגולתי גדול (6 x 3 מ"מ2) באמצעות עטיפת מזון, סיליקון שקוף וזכוכית כיסוי. חלון גולגולתי זה מאפשר ניסויים בהדמיית סידן בשדה רחב ובשני פוטונים באותו עכבר.

אין ויוו הדמיית סידן בשדה רחב ושני פוטונים מעכבר באמצעות חלון גולגולתי גדול

פרוטוקול זה מפרט את ההליך לדימות תגובות סידן בקוליקולוס העליון (SC) של עכברים ערים, כולל הדמיה של פעילות נוירון יחיד במיקרוסקופ של שני פוטונים תוך השארת קליפת המוח שלמה בעכברי בר, והדמיית ה-SC כולו במיקרוסקופ רחב שדה בעכברים מוטנטיים בעלי קליפת מוח חלקית.

הדמיית סידן בעכבר קוליקולוס מעולה

עבודה זו מציגה תכשיר רשתית שטוח חלופי שבו הסרת גופי תאים קולטי אור מאפשרת פיזור נוגדנים מהיר יותר וגישה משופרת של פיפטת טלאי לנוירונים ברשתית הפנימית לצורך אימונוהיסטוכימיה, הכלאה באתרו וניסויים אלקטרופיזיולוגיים.

רשתית מפוצלת כהכנה שטוחה משופרת לחקר נוירונים בשכבה גרעינית פנימית ברשתית בעלי חוליות

חקור תגובות נוירונים ברשתית בעזרת הדמיית סידן בתכנית שטוחה מבודדת מעכברוש. שיטה זו מאפשרת בחינת תגובות תאים לגירוי חשמלי וקידום פיתוח שתלים רטינליים מתקדמים.

הדמיית סידן ברשתית שטוחה עם גירוי חשמלי

גלה סרטונים נוספים