Name: זיהוי סוג סיבים של שרירי השלד האנושיים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-22T14:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: למדו את שיטת MyDoBID לזיהוי סוגי סיבי שריר שלד אנושיים לפי איזופורמות של שרשרת כבדת מיוזין. שיטה זו מאפשרת ניתוח הבדלי ביטוי חלבוניים ברמת התא לחקר ביולוגיית שריר השלד.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

הנוגדנים נגד MHC I (A4.840) ו- MHCIIa (A4.74) ששימשו במחקר זה פותחו על ידי ד"ר H. M. Blau והנוגדן נגד MHCIIx (6H1) פותח על ידי ד"ר C. A. Lucas והתקבל מבנק Hybridoma למחקרים התפתחותיים (DSHB), הודות לחסות המכון הלאומי לבריאות הילד והתפתחות האדם ומתוחזק על ידי אוניברסיטת איווה, המחלקה למדעי הביולוגיה (איווה סיטי, IA). אנו מודים לוויקטוריה ל. ויקסמה על שסיפקה את דגימות השריר האנושי למחקר זה. רוב התמונות באיור 1 נלקחו מ-BioRender.com.
מימון: מחקר זה לא זכה למימון חיצוני.

MyDoBID - טכניקה חדשנית לזיהוי יעיל של סוגי סיבי שריר

<ol><li>Schiaffino, S., Reggiani, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiber+types+in+mammalian+skeletal+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Fiber types in mammalian skeletal muscles.</a> Physiological Reviews. 91 (4), 1447-1531 (2011).</li>
<li>Bloemberg, D., Quadrilatero, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+determination+of+myosin+heavy+chain+expression+in+rat%2C+mouse%2C+and+human+skeletal+muscle+using+multicolor+immunofluorescence+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis.</a> PLoS One. 7 (4), e35273(2012).</li>
<li>Wyckelsma, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+specific+differences+in+the+protein+abundances+of+GAPDH+and+Na%28%2B%29%2CK%28%2B%29-ATPase+in+skeletal+muscle+from+aged+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Gerontology%22%5BJournal%5D)">Cell specific differences in the protein abundances of GAPDH and Na(+),K(+)-ATPase in skeletal muscle from aged individuals.</a> Experimental Gerontology. 75, 8-15 (2016).</li>
<li>Morales-Scholz, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+fiber+type-specific+autophagy+responses+following+an+overnight+fast+and+mixed+meal+ingestion+in+human+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Muscle fiber type-specific autophagy responses following an overnight fast and mixed meal ingestion in human skeletal muscle.</a> American Journal of Physiology Endocrinology and Metabolism. 323 (3), e242-e253 (2022).</li>
<li>Tripp, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+course+and+fibre+type-dependent+nature+of+calcium-handling+protein+responses+to+sprint+interval+exercise+in+human+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Time course and fibre type-dependent nature of calcium-handling protein responses to sprint interval exercise in human skeletal muscle.</a> The Journal of Physiology. 600 (12), 2897-2917 (2022).</li>
<li>Frankenberg, N. T., Mason, S. A., Wadley, G. D., Murphy, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+cell-specific+differences+in+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle cell-specific differences in type 2 diabetes.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 79 (5), 256(2022).</li>
<li>Murphy, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+skeletal+muscle+calpain-3+by+eccentric+exercise+in+humans+does+not+result+in+its+translocation+to+the+nucleus+or+cytosol%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Activation of skeletal muscle calpain-3 by eccentric exercise in humans does not result in its translocation to the nucleus or cytosol.</a> Journal of Applied Physiology. 111 (5), 1448-1458 (2011).</li>
<li>Murphy, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+technique+to+measure+proteins+in+single+segments+of+human+skeletal+muscle+fibers%3A+fiber-type+dependence+of+AMPK-alpha1+and+-beta1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Enhanced technique to measure proteins in single segments of human skeletal muscle fibers: fiber-type dependence of AMPK-alpha1 and -beta1.</a> Journal of Applied Physiology. 110 (3), 820-825 (2011).</li>
<li>Christiansen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fast%2C+reliable+and+sample-sparing+method+to+identify+fibre+types+of+single+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A fast, reliable and sample-sparing method to identify fibre types of single muscle fibres.</a> Scientific Reports. 9 (1), 6473(2019).</li>
<li>Skelly, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+skeletal+muscle+fiber+type-specific+responses+to+sprint+interval+and+moderate-intensity+continuous+exercise%3A+acute+and+training-induced+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Human skeletal muscle fiber type-specific responses to sprint interval and moderate-intensity continuous exercise: acute and training-induced changes.</a> Journal of Applied Physiology. 130 (4), 1001-1014 (2021).</li>
<li>Bergstrom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+electrolytes+in+man%5BTitle%5D)+AND+%22Scandinavian+Journal+of+Clinical+and+Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Muscle electrolytes in man.</a> Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation. (SUPPL. 68), 1-110 (1962).</li>
<li>Evans, W. J., Phinney, S. D., Young, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suction+applied+to+a+muscle+biopsy+maximizes+sample+size%5BTitle%5D)+AND+%22Medicine+%26+Science+in+Sports+%26+Exercise%22%5BJournal%5D)">Suction applied to a muscle biopsy maximizes sample size.</a> Medicine & Science in Sports & Exercise. 14 (1), 101-102 (1982).</li>
<li>Wyckelsma, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preservation+of+skeletal+muscle+mitochondrial+content+in+older+adults%3A+relationship+between+mitochondria%2C+fibre+type+and+high-intensity+exercise+training%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Preservation of skeletal muscle mitochondrial content in older adults: relationship between mitochondria, fibre type and high-intensity exercise training.</a> The Journal of Physiology. 595 (11), 3345-3359 (2017).</li>
<li>Bortolotto, S. K., Stephenson, D. G., Stephenson, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiber+type+populations+and+Ca2%2B-activation+properties+of+single+fibers+in+soleus+muscles+from+SHR+and+WKY+rats%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Fiber type populations and Ca2+-activation properties of single fibers in soleus muscles from SHR and WKY rats.</a> American Journal of Physiology Cell Physiology. 276 (3), C628-C637 (1999).</li>
<li>Murphy, R. M., Lamb, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Important+considerations+for+protein+analyses+using+antibody+based+techniques%3A+down-sizing+Western+blotting+up-sizes+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Important considerations for protein analyses using antibody based techniques: down-sizing Western blotting up-sizes outcomes.</a> The Journal of Physiology. 591 (23), 5823-5831 (2013).</li>
<li>Lucas, C. A., Kang, L. H., Hoh, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monospecific+antibodies+against+the+three+mammalian+fast+limb+myosin+heavy+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Monospecific antibodies against the three mammalian fast limb myosin heavy chains.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 272 (1), 303-308 (2000).</li>
<li>MacInnis, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superior+mitochondrial+adaptations+in+human+skeletal+muscle+after+interval+compared+to+continuous+single-leg+cycling+matched+for+total+work%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Superior mitochondrial adaptations in human skeletal muscle after interval compared to continuous single-leg cycling matched for total work.</a> The Journal of Physiology. 595 (9), 2955-2968 (2017).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.

אוסף סיבים בהתבסס על מספר שנות ניסיון, רוב החוקרים יכולים לשלוט בטכניקה זו; עם זאת, תרגול מוביל לאיסוף סיבים מהיר ויעיל יותר לניתוחים במורד הזרם. כדי שניתן יהיה לבודד 30 מקטעי סיבים בודדים באיכות לאיגום, מומלץ לאסוף 50 מקטעי סיבים בכל דגימה. מומלץ ללמוד היטב את סרטון איסוף הסיבים ולאחר ביצוע שני מפגשי תרגול (~50 סיבים בכל מפגש) כדי להשיג סטנדרט סביר. כל הסיבים שנאספים עוברים MyDoBID כדי לזהות את סוג הסיבים, מה שיגלה עד כמה הטכניקה מבוצעת בצורה יעילה. זה ייראה כמספר נמוך של אות MHC 'ללא סיבים' או 'חלש'...

שריר השלד הוא רקמה הטרוגנית, בעלת תכונות מטבוליות והתכווצות תאיות מובהקות התלויות בשאלה אם התא (סיבים) הוא עווית איטית (סוג I) או עווית מהירה (סוג II). ניתן לזהות את סוג הסיב על ידי בחינת איזופורמים של שרשרת מיוזין כבדה (MHC), הנבדלים זה מזה במספר דרכים, כולל זמן התכווצות, מהירות הקיצור ועמידות בפני עייפות1. איזופורמים עיקריים של MHC כוללים סוג I, סוג IIa, סוג IIb וסוג IIx והפרופילים המטבוליים שלהם הם חמצוניים (סוג I ו- IIa) או גליקוליטיים (IIx, IIb)1. חלקם של סוגי סיבים אלה משתנה בסוג השריר ובין המינים. סוג IIb נמצא באופן נרחב בשרירי מכרסמים. שרירי האדם אינם מכילים סיבים מסוג IIb ומורכבים בעיקר מאיזופורמים מסוג MHC מסוג I ו- IIa, עם חלק קטן מסיבי IIx2. פרופילי ביטוי החלבונים משתנים בין סוגי סיבים שונים, וניתן לשנות אותם עם הזדקנות3, פעילות גופנית 4,5 ומחלה6.
לעתים קרובות מתעלמים או לא מאפשרים למדוד תגובות תאיות בסוגים שונים של סיבי שריר השלד בגלל בדיקת הומוגנטים של שרירים (שילוב של כל סוגי הסיבים). כתם מערבי חד-סיבתי מאפשר חקירה של חלבונים מרובים בסיבי שריר בודדים7. מתודולוגיה זו שימשה בעבר לייצור מאפיינים חדשניים ואינפורמטיביים של סיב בודד שלא ניתן היה להשיג באמצעות תכשירים הומוגניים. עם זאת, ישנן כמה מגבלות של המתודולוגיה המערבית המקורית של כתם סיב יחיד, כולל האופי הגוזל זמן, חוסר היכולת לייצר שכפול דגימות, והשימוש בריאגנטים כימילומינסנציה משופרת (ECL) יקרים ורגישים. אם נעשה שימוש ברקמה טרייה, שיטה זו מוגבלת עוד יותר בשל אילוצי הזמן של הצורך לבודד סיבים בודדים במסגרת זמן מוגבלת (כלומר, 1-2 שעות). למרבה המזל, ריסון זה מתמתן על ידי בידוד מקטעים חד-סיביים מרקמה מיובשת בהקפאה8. עם זאת, איסוף סיבים מדגימות מיובשות בהקפאה מוגבל על ידי גודל ואיכות הרקמה הביופסית.
זיהוי סוג הסיבים בשיטת הכתמת נקודות9 הורחב והורחב באופן משמעותי בפרוטוקול מקיף זה. בעבר, הוכח כי מעט כמו ~ 2-10 מ"ג של רקמת שריר במשקל רטוב מספיק לייבוש בהקפאה וניתוח חלבון איזופורם MHC סיב יחיד9. Christensen et al.9 השתמשו ב-30% מקטע סיבים ~1 מ"מ כדי לזהות את איזופורם MHC הקיים על ידי כתם נקודה, אשר אושר על ידי כתם מערבי. עבודה זו הראתה כי על ידי החלפת כתם מערבי בכתמים נקודתיים, העלויות הכוללות הופחתו פי ~ 40 (עבור 50 מקטעי סיבים). לאחר מכן "אוגמו" סיבים לדגימות מסוג I ו-II, שאפשרו שכפול ניסיוני9. עם זאת, התקבלו רק שתי דגימות ספציפיות לסוג הסיבים: סוג I (MHCI חיובי) וסוג II (סיבים חיוביים MHCII), עם דגימות מסוג II המכילות תערובת של MHCIIa ו- MHCIIx 6,10. יש לציין כי הפרוטוקול הנוכחי מדגים כיצד ניתן לזהות סיבי IIx טהורים מסוג IIx ומספק זרימת עבודה מפורטת ביותר (המסוכמת באיור 1), כולל אסטרטגיות לפתרון בעיות נפוצות בפרוטוקול.

<table><tbody><tr><td>1x מאגר דנטורינג</td><td>הכינו לפי המתכון</td><td>ניתן להשיג את המרכיבים מסיגמא-אולדריץ' או מחברות אחרות להפצת כימיקלים</td><td>&nbsp; מאגר דנטורציה 1x מיוצר על ידי דילול מאגר דנטורציה 3x 1 ב-3 v/v עם 1X Tris-HCl (pH 6.8). יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>3x מאגר דנטורינג</td><td>להכין לפי המתכון</td><td>ניתן להשיג את המרכיבים מ-Sigma-Aldrich או ממפיצים כימיים אחרים</td><td>3x מאגר דנטורציה מכיל: 0.125M Tris-HCI, 10% גליצרול, 4% SDS, 4 M אוריאה, 10% 2-מרקפטו-אתנול ו-0.001% ברומופנול כחול, pH 6.8.&nbsp; יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>ניתן להשיג 95% אתנול</td><td>N/A</td><td>100% אתנול מכל חברה</td><td>מדולל ל-95% עם H2O טהור במיוחד.</td></tr><tr><td>אקטין ארנב נוגדן רב-שבטי</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp; A2066</td><td>יש לדלל 1 ל-1,000 עם מאגר BSA.</td></tr><tr><td>סולמות אנליטיים</td><td>מטלר טולדו</td><td>מספר דגם: MSZ042101</td><td></td></tr><tr><td>משפר נוגדנים</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>32110</td><td>שם המוצר הוא Miser Antibody Extender Solution NC.</td></tr><tr><td>(100 מ"ל)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה ספסלית</td><td>Eppendorf</td><td>5452</td><td>שם הדגם: מיני ספין.</td></tr><tr><td>מאגר חוסם: 5% חלב דל שומן במאגר הכביסה.</td>חנות <td>תעודה</td><td>קנתה</td><td></td></tr><tr><td>מאגר BSA: 1% BSA/PBST, 0.02% NaN3</td><td>BSA: Sigma-Aldrich&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; PBS: מעבדות ביו-ראד. NaN3 : Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>BSA: A6003-25G&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 10x PBS: 1610780&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; NaN3: S2002</td><td>אלבומין בסרום בקר (BSA), תמיסת מלח עם חוצץ פוספט (PBS) ונתרן אזיד (NaN3). יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>ידית פתיחת קלטת&nbsp;</td><td>מעבדות ביו-ראד</td><td>4560000</td><td>משמש לפתיחת קלטות הג'ל הטרומיות.</td></tr><tr><td>Chemidoc MP Imager&nbsp;</td><td>מעבדות ביו-ראד</td><td>מספר דגם: מכסה מנוע אוניברסלי III</td><td>כל מערכת הדמיה עם יכולות הדמיית ג'ל ללא כתמים.</td></tr><tr><td>Criterion Blotter</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1704070</td><td>כולל חבילת קרח, מגש העברה, רולר, 2 מחזיקי קלטות, נייר פילטר, רפידות קצף ומכסה עם כבלים.</td></tr><tr><td>תא קריטריון (ביו-רד)</td><td>מעבדות ביו-ראד</td><td>1656001</td><td></td></tr><tr><td>ECL (כימילומינסנציה משופרת)</td><td>מעבדות ביו-ראד</td><td>1705062</td><td>שם המוצר: מצע ECL Clarity Max Western.</td></tr><tr><td>חוצץ אלקטרופורזה 1x Tris Glycine SDS (TGS)</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1610772</td><td>לדלל 10x TGS 1 מתוך 10 עם H2O טהור במיוחד.</td></tr><tr><td>נייר סינון, עובי 0.34 מ"מ</td><td>Whatmann</td><td>3030917</td><td>גודל בתפזורת 3 מ"מ, אריזה של 100 גיליונות, 315 x 335 מ"מ.</td></tr><tr><td>מלקחיים לכריתת רקמות עדינות</td><td>Dumont</td><td>F6521-1EA</td><td>Jeweller' מלקחיים מס' 5.</td></tr><tr><td>מגש/מכסה/מגש פלסטיק שטוח&nbsp; &nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>גדול מספיק כדי להניח עליו את הממברנה. ודא שהמשטח שטוח לחלוטין.</td></tr><tr><td>מערכת ייבוש בהקפאה</td><td>Labconco</td><td>7750030</td><td>Freezone 4.5 L עם שלב דגימת תא זכוכית.</td></tr><tr><td>מקפיא -80 oC&nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>כל מקפיא עם טמפרטורה קבועה של -80 מעלות; C מתאים.</td></tr><tr><td>משחררי ג'ל</td><td>1653320</td><td>Bio-Rad</td><td>החליקו מתחת לממברנה כדי לאסוף או להזיז את הממברנה.</td></tr><tr><td>עיפרון עופרת אפור</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; תוכנת מעבדת תדמית&nbsp;</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>N/A</td><td>Figures מתייחס לגרסת התוכנה 5.2.1 אך ניתן להשתמש בגרסאות אחרות.</td></tr><tr><td>חממת</td><td>מעבדות ביו-ראד</td><td>1660521</td><td>כל חממה שניתן להגדיר ל-37 מעלות; C יספיק.</td></tr><tr><td>מנורה</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>בוחש מגנטי עם פרעושים</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>רולר ממברנה&nbsp;</td>ניתן לרכוש את <td>מעבדות ביו-ראד</td><td>1651279</td><td>בחבילת הטרנספר. עם זאת, אם מוצר זה אינו זמין, כל צינור גלילי עם משטח חלק ארוך מספיק כדי להתגלגל על הממברנה יספיק.</td></tr><tr><td>צינורות מיקרוצנטריפוגה&nbsp; (0.6 מ"ל)</td><td>N/</td><td>A N/A</td><td></td></tr><tr><td>עכבר IgG HRP משני</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>31430</td><td>עיזים נגד עכבר IgG (H+L), RRID AB_228341. לדלל ב-1 ל-20,000 במאגר חסימה.</td></tr><tr><td>עכבר IgM HRP משני</td><td>Abcam</td><td>ab97230</td><td>עז נגד עכבר IgM בשרשרת. השתמש באותו דילול כמו IgG של העכבר.</td></tr><tr><td>נוגדן ראשוני Myosin Heavy Chain I (MHCI)</td><td>DSHB</td><td>A4.840&nbsp;</td><td>טווח דילול: 1 ל-200 עד 1 ל-500 במאגר BSA.</td></tr><tr><td>נוגדן ראשוני Myosin Heavy Chain IIa (MHCIIa)</td><td>DSHB</td><td>A4.74&nbsp;</td><td>טווח דילול: 1 ל-200 עד 1 ל-500 במאגר BSA.</td></tr><tr>טווח דילול <td>ראשוני של Myosin Heavy Chain IIx (MHCIIx):</td><td></td><td></td><td>1 ל-200 עד 1 ל-500 במאגר BSA.</td></tr><tr><td>ממברנת ניטרוצלולוזה 0.45 ומיקרו; מ&nbsp;</td><td>מעבדות ביו-ראד</td><td>1620115</td><td>לכתמים מערביים.</td></tr><tr><td>מכסה צלחת פטרי</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>פינצטה מפלסטיק</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>חבילת כוח&nbsp;</td><td>מעבדות ביו-ראד</td><td>164-5050</td><td>שם המוצר: ספק כוח בסיסי.</td></tr><tr><td>סולם חלבון</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26616</td><td>PageRuler סולם חלבון צבוע מראש, 10 עד 180 kDa.</td></tr><tr><td>קרום PVDF 0.2 ומיקרו; m</td><td>מעבדות ביו-ראד</td><td>1620177</td><td></td></tr><tr><td>ארנב HRP משני</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>31460</td><td>עיזים נגד ארנב IgG (H+L), RRID AB_228341. דילול זהה לנוגדנים משניים של עכברים.</td></tr><tr><td>נדנדה</td><td>N / A</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>סרגל</td><td>N / A</td> N <td>/</td> A <td></td></tr><tr><td>מספריים</td><td>N / A</td> N <td>/</td> A <td></td></tr><tr><td>סטריאומיקרוסקופ</td><td>מוטיק</td><td>SMZ-168</td><td></td></tr><tr><td>מאגר הפשטה</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21059</td><td>שם המוצר: שחזר מאגר הפשטת כתם מערבי.</td></tr><tr><td>רקמות (ללא מוך)</td><td>קימברלי-קלארק מקצועית</td><td>34120</td><td>שם המוצר: Kimwipe.</td></tr><tr><td>חוצץ העברה (1x Tris Glycine buffer (TG), 20% מתנול)</td><td>TG: Bio-Rad Laboratories&nbsp; &nbsp; מתנול: מאגר TG של Merck</td><td>: 1610771&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; מתנול: 1.06018</td><td>מדלל 10x TG buffer עם H2O טהור במיוחד ל-1x. הוסף 100% מתנול לריכוז סופי של 20% מתנול. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>מגש העברה</td><td>מעבדות ביו-ראד</td><td>1704089</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; ג'ל טרומי להפעלת UV</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>5678085</td><td>סוג ג'ל: 4&ndash; 15% ג'ל חלבון ללא כתמים Criterion TGX, 26 בארות, 15 &micro;L.</td></tr><tr><td>מערבולת</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>מאגר שטיפה (1x TBST)</td><td>10x TBS: אסטרל סיינטיפיק&nbsp; טווין 20: סיגמא</td><td>&nbsp; מתכון BIOA0027-4L</td><td>1x TBST: 10x תמיסת מלח Tris-buffered (TBS) מדוללת ל-1x עם H2O טהור במיוחד, Tween 20 מתווסף לריכוז סופי של 0.1%. אחסן את המאגר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>מיכלי כביסה שחנות</td><td>Sistema</td><td>קנתה</td><td>כל מיכל טאפרוור, שמתאים למידות המשוערות של הממברנה יספיק.</td></tr></tbody></table>

זיהוי סוג סיבים של שרירי השלד האנושיים

Fiber Type Identification of Human Skeletal Muscle

ניתן להשתמש בטכניקה המתוארת כאן כדי לזהות איזופורמים ספציפיים של שרשרת מיוזין כבדה (MHC) במקטעים של סיבי שריר בודדים באמצעות הכתמת נקודות, להלן זיהוי שרשרת כבדה של האוסין שליעל ידי Dot Blotting for IDentification of muscle fiber type (MyDoBID). פרוטוקול זה מתאר את תהליך הייבוש בהקפאה של שרירי השלד האנושיים ובידוד מקטעים של סיבי שריר בודדים. באמצעות MyDoBID, סיבים מסוג I ו- II מסווגים עם נוגדנים ספציפיים MHCI ו- IIa, בהתאמה. סיבים מסווגים משולבים לאחר מכן לדגימות ספציפיות לסוג הסיבים עבור כל ביופסיה.
סך החלבון בכל דגימה נקבע על ידי אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד נתרן דודציל-סולפט (SDS-PAGE) וטכנולוגיית ג'ל המופעלת על ידי UV. סוג הדגימות של הסיבים מאומת באמצעות כתמים מערביים. מתוארת גם החשיבות של ביצוע נורמליזציה של העמסת חלבונים כדי לשפר את זיהוי חלבון המטרה על פני כתמים מערביים מרובים. היתרונות של איחוד סיבים מסווגים לדגימות ספציפיות לסוג סיבים בהשוואה לסיבים מערביים יחידים, כוללים רב-תכליתיות דגימה, תפוקת דגימה מוגברת, השקעה קצרה יותר בזמן ואמצעים לחיסכון בעלויות, כל זאת תוך שמירה על מידע יקר ערך ספציפי לסוג הסיב שלעתים קרובות מתעלמים ממנו באמצעות דגימות שריר הומוגניות. מטרת הפרוטוקול היא להשיג זיהוי מדויק ויעיל של סיבים מסוג I ו-II שבודדו מדגימות שרירי שלד אנושיים מיובשים בהקפאה.
סיבים בודדים אלה משולבים לאחר מכן ליצירת דגימות ספציפיות לסוג I וסוג II. יתר על כן, הפרוטוקול מורחב וכולל זיהוי של סיבים מסוג IIx, תוך שימוש באקטין כסמן לסיבים שהיו שליליים עבור MHCI ו- MHCIIa, אשר אושרו כסיבי IIx על ידי כתם מערבי. לאחר מכן משתמשים בכל דגימה ספציפית לסוג הסיב כדי לכמת את הביטוי של חלבוני מטרה שונים באמצעות טכניקות קרישה מערביות.

זיהוי סיבי שריר בודדים מסוג MHCI, MHCIIa ו-MHCIIx באמצעות כתם נקודות מאפיין של MyDoBID הוא סיווג של עוצמת האות MHC ו-Actin המשתנה בסיב נתון (איור 4A). סוג הסיבים זוהה על-ידי נוכחות או היעדר איזופורמים MHCI ו-IIa (איור 4B). שישה סיבים לא הראו זיהוי MHC או אקטין (actin), מה שמצביע על כך שלא נאספו סיבים. התוצאות של כתם נקודה ספציפי זה היו זיהוי של 22 סיבים מסוג II, 7 סיבים מסוג I ו-3 סיבים פוטנציאליים מסוג IIx; 2 דגימות לא מזוהות ו-6 דגימות סווג...

פרוטוקול זה מדגים בידוד של סיב יחיד משרירי השלד האנושיים המיובשים בהקפאה וסיווג סוג סיבים על פי איזופורם שרשרת כבדה מיוסין (MHC) באמצעות טכניקת כתמת הנקודות. לאחר מכן ניתן לנתח דגימות סיבים MHC I ו-II מזוהות עבור הבדלים ספציפיים לסוג הסיבים בביטוי חלבונים באמצעות כתמים מערביים.

The technique described here can be used to identify specific myosin heavy chain (MHC) isoforms in segments of individual muscle fibers using dot ...

המחקר שלנו מתמקד בשרירי השלד, המורכבים מתאים בעלי תכונות מטבוליות והתכווצות ייחודיות, המאופיינים כסיבי עוויתות איטיים או מהירים. אנו מתעמקים בגורמים התורמים להבדלים אלה ובוחנים את השלכותיהם בהקשר של הזדקנות, פעילות גופנית ומחלות שונות. לעתים קרובות מתעלמים ממדידת תגובות תאיות בסיבי שריר שלד שונים, או שאינם אפשריים עקב בדיקת הומוגנאטים של שרירים.טכניקת MyDoBID מאפשרת לנו לנתח שוב ושוב הבדלים בחלבון מסוג סיבים שבעבר לא ניתן היה למדוד. פרוטוקול זה מזהה באופן מדויק ויעיל סיבי שריר מסוג 1 וסוג 2 מדגימות שריר שלד אנושיות מיובשות בהקפאה. שיטה מתוקנת זו מספקת גישה פשוטה לחוקרים לחקור את הבדלי החלבונים בשרירי השלד ברמה התאית.יש לציין כי הוא מאפשר זיהוי של סיבים מסוג X מסוג שני, ואלה היו מאתגרים מבחינה היסטורית להבדיל. הטכניקה מאפשרת לחוקרים לשפוך אור על כל סוגי הסיבים, כולל סיב X חמקמק מסוג 2. בעזרת טכניקת MyDoBID ניתן כעת לענות על שאלות רבות.לדוגמה, ניתן לגלות את התכונות של סיבי שריר מסוג X מסוג 2, ולקבוע אם יש ראיות המצביעות על ניוון מועדף של סיבי שריר מסוג X במהלך הזדקנות או מחלה. ניתן גם לראות כיצד התערבות ספציפית בפעילות גופנית משפיעה על כל סוג סיבים.

fiber-type-identification-of-human-skeletal-muscle

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

בסרטון זה, אנו מדגימים את הכנת הדגימה של רקמת שריר השלד האנושית ואת צביעתה למיקרוסקופ אלקטרונים שידור כדי לדמיין ולכמת את התפלגות הגליקוגן התת-תאי.

מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת לכימות התפלגות הגליקוגן בשרירי השלד האנושיים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול סיב שריר מהיר מנתח, המאפשר איכות מכתים משופרת, ובכך רכישה אוטומטית וכימות של אוכלוסיות סיבים באמצעות ImageJ התוכנה הזמין באופן חופשי.

פרוטוקול אוטומאטי ומהיר עבור שריר סיבי ניתוח אוכלוסיית חתכי שריר עכברוש באמצעות שרשרת השרירן כבד אימונוהיסטוכימיה

נוגדן של צולבות הקישור חוטים שרירן שרשרת כבדה איזופורמים התפתחה כמבדיל המדינה-of-the-art של סיבי השריר והשלד-סוג (קרי, סוג, הקלד IIA, הקלד IIX, הקלד IIB). כאן, אנו מציגים פרוטוקול מכתימים יחד עם אלגוריתם חצי אוטומטיות הרומן המקל על הערכה מהירה של מורפולוגיה סיבים מסוג וסיבים.

ניתוח חצי אוטומטי של מורפולוגיה שרירי השלד העכבר והרכב סיבים מסוג

דו"ח טכני זה מתאר וריאציה של טכניקת Bergström שונה לביופסיה של השרירים tibialis הקדמי המגביל את נזק סיבים.

אוסף של ביופסיות שריר השלד מהתאי העליון של השרירים האנושיים Tibialis הקדמי להערכה מכנית

היכולת לזהות במדויק רכיבי צומת נוירו-שרירית חיונית להערכת שינויים בארכיטקטורה שלה בגלל תהליכים פתולוגיים או התפתחותיים. כאן אנו מציגים תיאור מלא של שיטה פשוטה כדי להשיג תמונות באיכות גבוהה של צמתים neuromuscular הר כולו שניתן להשתמש בהם כדי לבצע מדידות כמותיות.

ניתוח של סיבי שריר שלד יחיד עבור ניתוחים אימונופלואורסצנטיים ומורפומטריים של צמתים נוירו-שריריים בהר שלם

עדויות הולכות וגוברות מצביעות על כך שחדירה מוגזמת של שומנים בתוך שרירי השלד גורמת לליפטוקסיות ולסוכרת. כאן אנו מציגים פרוטוקול שלם, כולל עיבוד רקמות, צביעה עם Bodipy, רכישת תמונה וניתוח, כדי לכמת את הגודל, הצפיפות וההתפלגות התת-תאית של טיפות שומנים באופן ספציפי מסוג סיבים.

סוג הסיבים וניתוח ספציפי תת-תאי של תכולת טיפות השומנים בשרירי השלד

אנו מתארים פרוטוקול לקבלת סיבים מנותקים אנזימטית באורכים וסוגים שונים משישה שרירים של עכברים בוגרים: שלושה מהם כבר תוארו (flexor digitorum brevis, extensor digitorum longus, soleus) ושלושה מהם נותקו בהצלחה בפעם הראשונה (extensor hallucis longus, peroneus longus, peroneus digiti quarti).

סיבי שריר שלד שלמים קצרים, בינוניים וארוכים המתקבלים על ידי דיסוציאציה אנזימטית של שישה שרירי גפיים אחוריות של עכברים: Beyond Flexor Digitorum Brevis

פרוטוקול זה מתאר את בידוד סיבי שריר יחיד שלמים מהסולאוס החמצוני ואת הקמת תרביות מיובלסט מטוהרות מאוד שמקורן בסיבים אלו. ההליך האופטימלי מניב באופן אמין כ-300–500 סיבי מיו שלמים לכל עכבר, ומאפשר ניתוחים מולקולריים ותאים במורד הזרם.

מבחן בידוד סיב יחיד להערכת התנהגות סיבי מיו חמצונית

מוצג פרוטוקול לסינתזה של פפטואידים בעלי פונקציונליות קטיונית מעורבת באותו רצף (מונומרים מסוג ליזין וארגינין). מתוארת גם בדיקה עוקבת של תרכובות אלה נגד Leishmania mexicana, הטפילים הפרוטוזואיים הגורמים ללישמניאזיס עורית.

שיטה יעילה עבור הסינתזה של Peptoids עם מעורב ליזין מסוג / ארגינין-סוג מונומרים וערכה של אנטי-leishmanial פעילותם

אנו מציעים פרוטוקול לזיהוי חומצות שומן ללא צורך בטיהורן. הוא משלב מידע על זמני השמירה עם ספקטרום המסה של שלושה סוגים של נגזרות חומצות שומן: אסטרי מתיל של חומצות שומן (FAMEs), נגזרות 4,4-דימתיל אוקסזולין (DMOX) ואסטרי 3-פירידילקרביניל (פיקוליניל).

זיהוי של חומצות שומן ב<em&gt; Cereus בצילוס</em

למדו את שיטת MyDoBID לזיהוי סוגי סיבי שריר שלד אנושיים לפי איזופורמות של שרשרת כבדת מיוזין. שיטה זו מאפשרת ניתוח הבדלי ביטוי חלבוניים ברמת התא לחקר ביולוגיית שריר השלד.

זיהוי סוג סיבים של שרירי השלד האנושיים

גלה סרטונים נוספים