Name: רשתית מפוצלת כהכנה שטוחה משופרת לחקר נוירונים בשכבה גרעינית פנימית ברשתית בעלי חוליות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-16T11:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: חקור הכנת רשתית מפוצלת לחקר נוירונים בשכבה גרעינית פנימית בעכברים. שיטה זו מאיצה פעילות נוגדנים פי עשרים ומשפרת גישה לניסויים פיזיולוגיים ואימונוהיסטוכימיה ברשתית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NIH הבאים: מענק NIH R01EY031596 (ל- C.M.); מענק NIH R01EY029985 (ל-C.M.); מענק NIH P30EY010572 (ל-C.M.); מענק NIH R01EY032564 (לב"ש). אנו מודים לתמי היילי על תמיכתה הטכנית בהכנת מקטעי הרשתית, ולד"ר צ'ארלס אלן על תרומתו הנדיבה של בדיקות mRNA FISH המשמשות בעבודה זו.

חקר תאים עצביים דו-קוטביים ואופקיים ברשתית המפוצלת של מורין

<ol><li>Morgans, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotransmitter+release+at+ribbon+synapses+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+%26+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Neurotransmitter release at ribbon synapses in the retina.</a> Immunology & Cell Biology. 78 (4), 442-446 (2000).</li>
<li>Euler, T., Haverkamp, S., Schubert, T., Baden, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+bipolar+cells%3A+elementary+building+blocks+of+vision%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Retinal bipolar cells: elementary building blocks of vision.</a> Nature Reviews Neuroscience. 15 (8), 507-519 (2014).</li>
<li>Barnes, S., Grove, J. C. R., McHugh, C. F., Hirano, A. A., Brecha, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Horizontal+Cell+Feedback+to+Cone+Photoreceptors+in+Mammalian+Retina%3A+Novel+Insights+From+the+GABA-pH+Hybrid+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Horizontal Cell Feedback to Cone Photoreceptors in Mammalian Retina: Novel Insights From the GABA-pH Hybrid Model.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, (2020).</li>
<li>Walston, S. T., Chang, Y. C., Weiland, J. D., Chow, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+to+remove+photoreceptors+from+whole+mount+retina+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Method to remove photoreceptors from whole mount retina in vitro.</a> Journal of Neurophysiology. 118 (5), 2763-2769 (2017).</li>
<li>Stefanov, A., Novelli, E., Strettoi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inner+retinal+preservation+in+the+photoinducible+I307N+rhodopsin+mutant+mouse%2C+a+model+of+autosomal+dominant+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Inner retinal preservation in the photoinducible I307N rhodopsin mutant mouse, a model of autosomal dominant retinitis pigmentosa.</a> Journal of Comparative Neurology. 528 (9), 1502-1522 (2020).</li>
<li>Matsuoka, R. L., Nguyen-Ba-Charvet, K. T., Parray, A., Badea, T. C., Chédotal, A., Kolodkin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmembrane+semaphorin+signaling+controls+laminar+stratification+in+the+mammalian+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transmembrane semaphorin signaling controls laminar stratification in the mammalian retina.</a> Nature. 470 (7333), 259-263 (2011).</li>
<li>Matsuoka, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidance-Cue+Control+of+Horizontal+Cell+Morphology%2C+Lamination%2C+and+Synapse+Formation+in+the+Mammalian+Outer+Retina%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Guidance-Cue Control of Horizontal Cell Morphology, Lamination, and Synapse Formation in the Mammalian Outer Retina.</a> Journal of Neuroscience. 32 (20), 6859-6868 (2012).</li>
<li>Wässle, H., Puller, C., Müller, F., Haverkamp, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cone+Contacts%2C+Mosaics%2C+and+Territories+of+Bipolar+Cells+in+the+Mouse+Retina%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cone Contacts, Mosaics, and Territories of Bipolar Cells in the Mouse Retina.</a> Journal of Neuroscience. 29 (1), 106-117 (2009).</li>
<li>Thoreson, W. B., Dacey, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+Cell+Types%2C+Circuits%2C+and+Mechanisms+for+Color+Vision+in+the+Vertebrate+Retina%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Diverse Cell Types, Circuits, and Mechanisms for Color Vision in the Vertebrate Retina.</a> Physiological Reviews. 99 (3), 1527-1573 (2019).</li>
<li>Guido, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+to+obtain+retinal+cell+preparations+highly+enriched+in+specific+cell+types.+Suitability+for+lipid+metabolism+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Protocols%22%5BJournal%5D)">A simple method to obtain retinal cell preparations highly enriched in specific cell types. Suitability for lipid metabolism studies.</a> Brain Research Protocols. 4 (2), 147-155 (1999).</li>
<li>Rose, K., Walston, S. T., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+photoreceptor+cell+compartments+in+mouse+retina+for+protein+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurodegeneration%22%5BJournal%5D)">Separation of photoreceptor cell compartments in mouse retina for protein analysis.</a> Molecular Neurodegeneration. 12 (1), 28(2017).</li>
<li>Todorova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+Layer+Separation+%28ReLayS%29+method+enables+the+molecular+analysis+of+photoreceptor+segments+and+cell+bodies%2C+as+well+as+the+inner+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Retinal Layer Separation (ReLayS) method enables the molecular analysis of photoreceptor segments and cell bodies, as well as the inner retina.</a> Scientific Reports. 12 (1), 20195(2022).</li>
<li>Shiosaka, S., Kiyama, H., Tohyama, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+the+separation+of+retinal+sublayers+from+the+entire+retina+with+special+reference+to+application+for+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for the separation of retinal sublayers from the entire retina with special reference to application for cell culture.</a> Journal of Neuroscience Methods. 10 (3), 229-235 (1984).</li>
<li>Ivanova, E., Hwang, G. S., Pan, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+transgenic+mouse+lines+expressing+Cre-recombinase+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Characterization of transgenic mouse lines expressing Cre-recombinase in the retina.</a> Neuroscience. 165 (1), 233-243 (2010).</li>
<li>Sarria, I., Orlandi, C., McCall, M. A., Gregg, R. G., Martemyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intermolecular+Interaction+between+Anchoring+Subunits+Specify+Subcellular+Targeting+and+Function+of+RGS+Proteins+in+Retina+ON-Bipolar+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Intermolecular Interaction between Anchoring Subunits Specify Subcellular Targeting and Function of RGS Proteins in Retina ON-Bipolar Neurons.</a> The Journal of Neuroscience. 36 (10), 2915-2925 (2016).</li>
<li>Orlandi, C., Cao, Y., Martemyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orphan+Receptor+GPR179+Forms+Macromolecular+Complexes+With+Components+of+Metabotropic+Signaling+Cascade+in+Retina+ON-Bipolar+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Orphan Receptor GPR179 Forms Macromolecular Complexes With Components of Metabotropic Signaling Cascade in Retina ON-Bipolar Neurons.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (10), 7153-7161 (2013).</li>
<li>Dikshit, A., Zong, H., Anderson, C., Zhang, B., Ma, X. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+Visualization+of+RNA+and+Protein+Expression+in+Tissue+Using+a+Combined+RNAscopeTM+In+Situ+Hybridization+and+Immunofluorescence+Protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Simultaneous Visualization of RNA and Protein Expression in Tissue Using a Combined RNAscopeTM In Situ Hybridization and Immunofluorescence Protocol.</a> Methods in Molecular Biology. 2148, Clifton, N.J. 301-312 (2020).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAscope%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">RNAscope.</a> The Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).</li>
<li>Morgans, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPM1+is+required+for+the+depolarizing+light+response+in+retinal+ON-bipolar+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">TRPM1 is required for the depolarizing light response in retinal ON-bipolar cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (45), 19174-19178 (2009).</li>
<li>Alessio, E., Zhang, D. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunostaining+of+whole-mount+retinas+with+the+CLARITY+tissue+clearing+method%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Immunostaining of whole-mount retinas with the CLARITY tissue clearing method.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 61 (7), 5054(2020).</li>
<li>Ferguson, L. R., Dominguez, J. M., Balaiya, S., Grover, S., Chalam, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+Thickness+Normative+Data+in+Wild-Type+Mice+Using+Customized+Miniature+SD-OCT%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Retinal Thickness Normative Data in Wild-Type Mice Using Customized Miniature SD-OCT.</a> PLoS ONE. 8 (6), e67265(2013).</li>
<li>Ivanova, E., Toychiev, A. H., Yee, C. W., Sagdullaev, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+Protocol+for+Retinal+Wholemount+Preparation+for+Imaging+and+Immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments+JoVE%22%5BJournal%5D)">Optimized Protocol for Retinal Wholemount Preparation for Imaging and Immunohistochemistry.</a> Journal of Visualized Experiments JoVE. (82), e51018(2013).</li>
<li>Kolb, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotransmitters+in+the+Retina%5BTitle%5D)+AND+%22Webvision%3A+The+Organization+of+the+Retina+and+Visual+System%22%5BJournal%5D)">Neurotransmitters in the Retina.</a> Webvision: The Organization of the Retina and Visual System. , University of Utah Health Sciences Center. (1995).</li>
<li>Chaya, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+functional+roles+of+horizontal+cells+in+the+retinal+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Versatile functional roles of horizontal cells in the retinal circuit.</a> Scientific Reports. 7 (1), 5540(2017).</li>
<li>Egger, V., Diamond, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A17+Amacrine+Cells+and+Olfactory+Granule+Cells%3A+Parallel+Processors+of+Early+Sensory+Information%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A17 Amacrine Cells and Olfactory Granule Cells: Parallel Processors of Early Sensory Information.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 600537(2020).</li>
<li>Dacey, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dopaminergic+amacrine+cell%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">The dopaminergic amacrine cell.</a> The Journal of Comparative Neurology. 301 (3), 461-489 (1990).</li>
<li>Park, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connectomic+analysis+reveals+an+interneuron+with+an+integral+role+in+the+retinal+circuit+for+night+vision%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Connectomic analysis reveals an interneuron with an integral role in the retinal circuit for night vision.</a> eLife. 9, 56077(2020).</li>
<li>Janssen-Bienhold, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin57+is+expressed+in+dendro-dendritic+and+axo-axonal+gap+junctions+of+mouse+horizontal+cells+and+its+distribution+is+modulated+by+light%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Connexin57 is expressed in dendro-dendritic and axo-axonal gap junctions of mouse horizontal cells and its distribution is modulated by light.</a> The Journal of Comparative Neurology. 513 (4), 363-374 (2009).</li>
<li>Jain, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+organization+of+excitation+and+inhibition+in+the+dendrites+of+mouse+direction-selective+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">The functional organization of excitation and inhibition in the dendrites of mouse direction-selective ganglion cells.</a> eLife. 9, 52949(2020).</li>
<li>Marvin, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability%2C+affinity%2C+and+chromatic+variants+of+the+glutamate+sensor+iGluSnFR%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Stability, affinity, and chromatic variants of the glutamate sensor iGluSnFR.</a> Nature Methods. 15 (11), 936-939 (2018).</li>
<li>Strauss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Center-surround+interactions+underlie+bipolar+cell+motion+sensitivity+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Center-surround interactions underlie bipolar cell motion sensitivity in the mouse retina.</a> Nature Communications. 13 (1), 5574(2022).</li>
<li>Marvin, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+encoded+fluorescent+sensor+for+in+vivo+imaging+of+GABA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A genetically encoded fluorescent sensor for in vivo imaging of GABA.</a> Nature Methods. 16 (8), 763-770 (2019).</li>
<li>Beckwith-Cohen, B., Holzhausen, L. C., Wang, T. M., Rajappa, R., Kramer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localizing+Proton-Mediated+Inhibitory+Feedback+at+the+Retinal+Horizontal+Cell-Cone+Synapse+with+Genetically-Encoded+pH+Probes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Localizing Proton-Mediated Inhibitory Feedback at the Retinal Horizontal Cell-Cone Synapse with Genetically-Encoded pH Probes.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 39 (4), 651-662 (2019).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

לאחר שקולטני אור ממירים את בליעת הפוטון לשחרור מוליכים עצביים, BCs ו-HCs הם תאי העצב הראשונים ברשתית שמעבדים את האות החזותי23. בעוד חשיבותם של תאי עצב אלה מוערכת היטב, רבים מהתפקודים שלהם אינם מובנים לחלוטין או לא נחקרים לחלוטין. מחקרים רבים בפיזיולוגיה של BC ו-HC עשויים להפיק תועלת מהכנת רשתית שטוחה המשפרת את הגישה לנוירוני INL תוך שמירה על קישוריות רוחבית. פיתוח שיטת הרשתית המפוצלת מייצג מאמץ לספק פרוטוקול קל לרכישת רישומים אלקטרופיזיולוגיים באיכות גבוהה ונתוני מיקרוסקופיה מBCs ו- HCs בכיוון שטוח. הכנת הרשתית המפוצלת המתוארת כאן יכולה להתבצע בכ-20 דקות לעכבר (10 דקות לכל רשתית) לאחר בידוד הרשתית, ללא שימוש בציוד ייעודי. השיטה שואבת השראה מהליכים קיימים להסרת קולטני אור אך מציעה שיפורים משמעותיים בפשטות, במהירות וברבגוניות 4,10,11,12,13. בניגוד לשיטות קודמות להפרדת שכבות רשתית, פיצול הרשתית אינו דורש הקפאה, ליופיליזציה או מריחה חוזרת של דבקים על הרשתית. עם תרגול, כמעט כל photoreceptors ניתן להסיר בקרע אחד עם קרום nitrocellulose. המהירות והקלות של גישה זו מאפשרות למזער את הזמן שהרשתית מבלה מחוץ לאיימס קרבוגני, מה שמאפשר קיום תאים גבוה לפרקי זמן ארוכים; רשתית מפוצלת יכולה להישמר במדיה איימס קרבוגנית במשך מספר שעות לאחר הפיצול. כעדות לבריאות תאי עצב מסוג INL בהכנה זו, כתם של תאים חיים/מתים (איור 4) ואלקטרופיזיולוגיה של מהדק טלאי (איור 6) מאשרים את הכדאיות של RBCs ו-HCs לאחר פיצול.
הסרת שכבת הפוטורצפטור ברשתית מפוצלת מעבירה יתרון משמעותי במהלך התיוג החיסוני על ידי קיצור דרמטי של זמן הדיפוזיה של נוגדנים לתוך INL. ניתן להשלים תיוג נוגדנים ראשוני ומשני תוך שעתיים, שיפור משמעותי לצביעה שטוחה קונבנציונלית שיכולה להימשך 72 שעות או יותר בהתאם ליעד 5,6,7,8,20,22. כתוצאה מכך, ניתן להשיג נתוני מיקרוסקופיה באותו יום של הכנת רקמות, מה שמאיץ באופן דרסטי את קצב הניסויים האימונופלואורסצנטיים. כדי להקל על חישול בדיקות mRNA, ניסויי FISH ממליצים בדרך כלל על זמני קיבוע ארוכים בהרבה (~ 24 שעות) מאשר תיוג חיסוני18. אולם הניסויים שהוצגו כאן מראים שקיבוע של שעתיים עדיין מייצר תיוג FISH יוצא דופן (איור 5). למרות הארכת זמן הקיבוע מ -30 דקות ל -2 שעות, לא היה צורך לבצע שלבי אחזור אנטיגן כדי להשיג תיוג חיסוני מעולה, אך זה עשוי להשתנות עם הנוגדן או האנטיגן. הטיפול בפרוטאז בפרוטוקול FISH עלול להפריע לסימון נוגדנים, ככל הנראה עקב הרס אפיטופים של מטרה. בעיה זו נעקפה על ידי שימוש בנוגדנים רב-שבטיים המכוונים לאפיטופים מרובים, מה שמקטין את הסבירות שהרס אפיטופים יעכב תיוג חיסוני. בנוסף, נעשה שימוש בטיפול מתון בפרוטאז (ACD protease III) כדי למנוע שינוי אפיטופ מוגזם תוך מתן חדירה מספקת לרקמות.
לעיתים, הרשתית תתפצל במקום זאת דרך השכבה הגרעינית החיצונית (ONL), ותשאיר מאחוריה שכבות של סומות קולטניות אור ללא תאי INL גלויים. כדי למנוע זאת, יש לוודא כי הרשתית מונחת שטוחה לחלוטין על הזכוכית, וכי כל שאריות נוזל סביב הרשתית הוסרו. לחיצה חזקה יותר על הניטרוצלולוז עם המברשת עשויה גם לסייע במניעת פיצול דרך ה- ONL. אם הממברנה נעשית רטובה מדי או שהרשתית מקופלת על עצמה, הסיכויים לפיצול מוצלח יפחתו מאוד. שימוש ב- DAPI להכתמת גרעיני תאים שימושי להערכת איכות הפיצול ולקביעת הכיסוי של קולטני האור הנותרים. גרעיני קולטני אור הם קטנים יותר, בהירים יותר ושטחיים יותר (איור משלים 3A), בעוד שגרעיני BC הם גדולים יותר, עמומים יותר ועמוקים יותר (איור משלים 3B). במקרים מסוימים, מישור הקרע ישתנה מעט על פני פיסת הרשתית, וכתוצאה מכך ייווצרו טלאים שבהם גופי התאים של קולטני האור לא הוסרו לחלוטין (איור משלים 3C). עבור יישומים במיקרוסקופ ואלקטרופיזיולוגיה, זה לא מפריע ליכולת לאסוף נתונים איכותיים מאזורים שבהם פוטורצפטורים הוסרו כראוי; שדות גדולים של רשתית פנימית חשופה ניתן למצוא בקלות בעת הדמיה או הקלטה עם פיפטה טלאי. אם רוצים הסרת פוטורצפטור מלאה יותר, ניתן לבצע קרע שני עם חתיכה נוספת של קרום ניטרוצלולוז, אם כי הסרת 100% פוטורצפטור אינה מובטחת. לכן מומלץ להיזהר בעת שימוש ברשתית מפוצלת במחקרי ביטוי גנים או פרוטאומיקה שבהם חומר פוטורצפטור שיורי עשוי להשפיע על התוצאות. עבור יישומים של תא בודד, חשש זה אינו מוצדק, מכיוון שניתן להוציא נתונים מפוטורצפטורים מהניתוח.
היתרונות של הכנת הרשתית המפוצלת הם אולי הבולטים ביותר בהקלטות אלקטרופיזיולוגיות של נוירונים בין-עצביים רחבי שדה. בעוד פרוסות אנכיות מסורתיות קוטעות את התהליכים הנרחבים של תאים רחבי שדה, הכנת הרשתית המפוצלת משאירה את OPL ו- IPL ללא פגע, ומאפשרת ללכוד קלט מתאים רחבי שדה כגון HCs24, A17s 25, TH ACs 26 ו- NOS-1 ACs27 שאחרת היו מתעלמים מהם בפרוסות אנכיות. לכן, פענוח התוצאות והשוואה לנתונים קודמים שנאספו מפרוסות רשתית דורשים מחשבה מעמיקה. עם זאת, בניסויים שהשתמשו בחיקויים פרמקולוגיים של גירוי אור, תוצאות אלה דומות לנתונים שנרשמו מפרוסות רשתית19. על ידי ביטוי ChR2 תחת מקדמים ספציפיים לתא, ניתן לעורר אוכלוסיית תאים רצויה תוך כדי הקלטה מ- BCs ב- INL כדי לחקור את השפעת התא הרצוי על מסלול המידע האנכי. הקלטה ישירה מנוירוני INL עמוקים יותר, כגון תאים אמקריניים, אפשרית גם ברשתית המפוצלת. בעוד שבמקרה זה אלקטרודת המדבקה חייבת לנוע תחילה דרך נוירוני INL שטחיים יותר, יש הרבה פחות רקמה שחוסמת את דרכה בהשוואה להכנה מסורתית של הר שלם.
בנוסף למדידת ההשפעה של תאי שדה רחב על תאי עצב אחרים, שיטה זו מאפשרת הידוק טלאי ישיר של תא בודד מתאי HC, שהדנדריטים שלהם יוצרים רשת מצומדת נרחבת של צומת מרווחים ב-OPL28. תאים אופקיים שולחים משוב קריטי לפוטורצפטורים אשר מעצב את העברת המידע האנכי דרך הרשתית. עם זאת, מאחר שהשדות הדנדריטיים של HCs נחתכים בפרוסות אנכיות, חסרים נתוני רישום של תא בודד. עבודה זו מציגה HCs שלמים מבחינה אנטומית ופיזיולוגית שמהם נרשמים זרמים מעוררי ChR2 בקו עכבר מהונדס משולש (איור 6 C-E). מחוץ לגירוי ChR2, הרשתית המפוצלת יכולה לשמש לחקר זרמי HC אנדוגניים וצימוד צומת פער28. בעוד הרשתית המפוצלת מספקת מודל נוח לחקר קישוריות סינפטית ופעילות עצבית הנגרמת על ידי יישום כימי או גירוי ChR2, היעדר פוטורצפטורים מונע כל חקירה ישירה של תגובות אור טבעיות או מנגנוני הסתגלות לאור.
הדמיה באתרו ברשתית התקדמה באופן ראוי להערכה בשנים האחרונות. עם זאת, רוב מחקרי ההדמיה מוגבלים לשכבת תאי הגנגליון בתכשירי רשתית הר שלמים29. המחברים צופים כי היעדר פוטורצפטורים ברשתית המפוצלת יהפוך אותה למודל אידיאלי להדמיית סידן חיה ב-OPL וב-INL. מעבר להדמיית סידן, למודל זה יש פוטנציאל גדול לשימוש עם ביו-חיישנים מקודדים גנטית כגון iGluSnFR30,31, iGABASnFR 32 ו-pHluorin 33. בשילוב עם הכנת הרשתית המפוצלת, כלים רבי עוצמה אלה עשויים להציע גישה יעילה לחקר האינטראקציות הסינפטיות והתכונות הביופיזיקליות של BCs ו- HCs התורמים לעיבוד האור ברשתית.

הרשתית היא רקמה עצבית דקה הממוקמת בעין האחורית שבה האור מיורט ומעובד לאות אלקטרוכימי שיכול להתפרש על ידי המוח. בחלק האחורי של הרשתית, photoreceptors מוט חרוט מגורה על ידי אור, אשר מפחית את קצב שחרור טוניק של נוירוטרנסמיטר, גלוטמט1. תאי העצב הראשונים שחווים ומגיבים לשינוי זה בריכוז הגלוטמט הנגרם על ידי האור הם התאים הדו-קוטביים (BCs) והתאים האופקיים (HCs), שהסומות שלהם שוכנות באזור החיצוני ביותר של השכבה הגרעינית הפנימית (INL). תאי עצב אלה מסדר שני מבצעים את השלב הראשון של עיבוד אותות ברשתית ומעצבים תכונות קריטיות של ראייה כגון הסתגלות לאור, רגישות לניגודיות והתנגדות מרחבית/צבע2. בעוד שפונקציות אלה יוחסו ל-BCs ול-HCs, המעגלים החשמליים והמנגנונים הביוכימיים שבבסיס תהליכים אלה אינם מובנים במלואם3. לכן, קידום כלים ושיטות לחקר הפיזיולוגיה של BC ו- HC הוא בעל חשיבות עליונה.
קטעי רשתית אנכיים (רוחביים) הוכיחו זה מכבר את המודל המעשי ביותר לחקר BCs ו- HCs; עם זאת, היבטים מסוימים של הפיזיולוגיה BC ו- HC אינם נגישים לנסיין תחת מודל זה. רישומים ישירים מHCs או מדידות עקיפות של השפעתם על BCs אינם משקפים את הקישוריות האנדוגנית של הרשתית מכיוון שהתהליכים הרוחביים של תאים אלה נקטעים במהלך החיתוך. תכשירי רשתית שלמים עוקפים בעיה זו על ידי שימור תהליכים רוחביים אלה, אך שכבות הרשתית שמסביב מציבות אתגר לגישה לתאים אלה4. אמנם יש דוגמאות רבות של immunostaining 5,6,7,8 והקלטות מהדק תיקון9 מנוירונים INL ברשתית הר שלם, יש הזדמנות לזרז ולפשט את איסוף הנתונים האלה. המגבלות המובנות של חתכים רוחביים והאתגרים של דגם ההר כולו היוו אפוא השראה לפיתוח תכשיר רשתית שטוח חלופי זה.
העבודה הבאה מתארת פרוטוקול להסרה קלה של שכבת קולטני האור מרשתיות חיות ושטוחות כדי לשפר את הגישה ל-BCs ול-HCs לקבלת הידוק טלאים פשוט יותר ותיוג חיסוני מהיר ויעיל יותר. קילוף שתי חתיכות של קרום ניטרוצלולוז המחוברות משני צדי הרשתית המבודדת קורע את הרקמה דרך אקסוני קולטני האור, ומותיר רשתית מפוצלת השומרת על שכבת הפרספקס החיצונית (OPL) ועל כל שכבות הרשתית הפנימיות. בעוד שאחרים תיארו פרוטוקולים להפרדה מכנית של שכבות הרשתית, שיטות אלה אינן מתאימות ליישומי הידוק טלאים ומיקרוסקופ או דורשות מניפולציה מייגעת של הרקמה. כמה משיטות אלה דורשות רקמות קפואות או ליופיליות להפרדת שכבות, מה שהופך אותן ללא תואמות לניסויים אלקטרופיזיולוגיים10,11,12. אחרים מיועדים לרקמה חיה, אך דורשים 5-15 קילופים עוקבים עם נייר סינון 4,11 או טיפול בטריפסין 13 כדי להסיר את הפוטורצפטורים. הטכניקה המתוארת כאן משפרת את קודמותיה על ידי פישוט הליך הסרת קולטני האור והרחבת הרפרטואר של יישומים במורד הזרם.

<table><tbody><tr><td>#1.5 כיסויי זכוכית</td><td>פישרברנד</td><td>12544E</td><td></td></tr><tr><td>2 זוגות מלקחיים של Dumont #5</td><td>טד פלה</td><td>38125</td><td></td></tr><tr><td>מחט 25 גייג'</td><td>בקטון דיקנסון</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>470 ננומטר LED</td><td>THORLABS</td><td>M470L2</td><td></td></tr><tr><td>מספריים מעוקלים 5-306</td><td>מילטקס</td><td>5-306</td><td></td></tr><tr><td>פיפטות פסטור חד-פעמיות 9" &nbsp;</td><td>פישרברנד</td><td>13-678-20D</td><td>לבניית פיפטת העברה מותאמת אישית</td></tr><tr><td>עכבר Ai80d</td><td>מעבדות ג'קסון</td><td>25109</td><td>RRID: IMSR_JAX:025109</td></tr><tr><td>Ames Medium עם L-גלוטמט</td><td>ביולוגי אמריקאי</td><td>A1372-25</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת בקרת מגברים</td><td>מכשירים מולקולריים</td><td>תוכנת Clampex 10.3</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן D28K אנטי-קלבינדין</td><td>Invitrogen</td><td>PA-5 85669</td><td>RRID: AB_2792808, מיני מארח = ארנב; דילול 1:100</td></tr><tr><td>נוגדן אנטי-CtBP2</td><td>BD ביוסיינסס</td><td>612044</td><td>RRID:&nbsp; AB_399431, מיני מארח = עכבר; דילול 1:5000</td></tr><tr><td>נוגדן אנטי-GPR179</td><td>NA</td><td>NA</td><td>מתנה מקיריל מרטמיאנוב; מכון המחקר סקריפס, יופיטר, פלורידה; מיני מארח = כבשים; דילול 1:1000</td></tr><tr><td>נוגדן אלפא אנטי-PKC</td><td>סיגמא-אלדריץ'</td><td>P4334</td><td>RRID: AB_477345, מין מארח = ארנב; דילול 1:5000</td></tr><tr><td>נוגדן אלפא אנטי-PKC</td><td>ביוטכנולוגיה של סנטה קרוז</td><td>sc8393 AF594</td><td>RRID: AB_628142, מיני מארח = עכבר; דילול 1:1000</td></tr><tr><td>נוגדן אנטי-PSD95</td><td>מעבדות BD Transduction</td><td>610495</td><td>RRID:&nbsp; AB_397862, מין מארח = עכבר; דילול 1:1000</td></tr><tr><td>נוגדן אנטי-RGS11</td><td>NA</td><td>NA</td><td>מתנה מטד ונזל; מכללת הרפואה ביילור, יוסטון, טקסס; &nbsp; מין מארח = ארנב; בין 1:1000 ל-1:5000 דילול</td></tr><tr><td>נוגדן אנטי-סינפטופיזין P38</td><td>סיגמא</td><td>S-S5768</td><td>RRID: AB_477523, מיני מארח = עכבר; דילול 1:1000</td></tr><tr><td>מדיה להרכבה של Aquamount</td><td>אפרדיה</td><td>13800</td><td>מדיה להרכבה על שקופית</td></tr><tr><td>עכבר C57BL/6J</td><td>מעבדות ג'קסון</td><td>000664</td><td>RRID: IMSR_JAX:000664</td></tr><tr><td>מיכל קרבוגן</td><td>מת'סון</td><td>NA</td><td>95% O2 ו-5% CO2</td></tr><tr><td>פיפטת העברה מותאמת אישית</td><td>בנייה מותאמת אישית</td><td>NA</td><td>הוראות: השתמשו במספריים כדי לחתוך את קצה פיפטת העברה פלזיטית בנקודה שבה היא מתחילה להצטמצם. השתמש בפלייר כדי לשבור בבטחה את 2-3 האינצ'ים האחרונים של פיפט פסטור מזכוכית. הכניסו את הקצה הצר של פיפטת הפסטור הזכוכית לקצה הרחב של פיפטת ההעברה הפלסטית. עטוף פאראפילם סביב המפרק של שני החלקים כדי להעצים את האטם.</td></tr><tr><td>מד הספק אופטי דיגיטלי</td><td>THORLABS</td><td>&nbsp; PM100D</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ דיסקציה</td><td>צייס</td><td>סטמי 2000</td><td></td></tr><tr><td>מגבר אלקטרופיזיולוגיה</td><td>מכשירים מולקולריים</td><td>אקסופאטש 200B</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ אלקטרופיזיולוגי</td><td>אולימפוס</td><td>אולימפוס, BX50WI</td><td>מיקרוסקופ ניגודיות גרדיאנט של Dodt</td></tr><tr><td>פלואורומאונט-G</td><td>סאות'רן ביוטק</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>HC PL APO CS2 40x/1.3&nbsp;</td><td>לייקה</td><td>506358</td><td></td></tr><tr><td>HC PL APO CS2 63x/1.40&nbsp;</td><td>לייקה</td><td>15506350</td><td></td></tr><tr><td>תנור היברידיזציה</td><td>רובינס סיינטיפיק</td><td>דגם 1000</td><td>לפרוטוקול RNAscope בלבד</td></tr><tr><td>עט מחסום הידרופובי אימדג'</td><td>מעבדות וקטור</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>איזופלוראן</td><td>טיפול נמרץ פירמל</td><td>66794-017-25</td><td></td></tr><tr><td>קימווייפ (מגב משימה עדין)</td><td>מדעי קים-טק</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Leica HC PL APO CS2 40x/1.3 מטרה לטבילה בשמן</td><td>לייקה</td><td>506358</td><td></td></tr><tr><td>Leica HC PL APO CS2 63x/1.40 מטרת טבילה בשמן</td><td>לייקה</td><td>15506350</td><td></td></tr><tr><td>Leica TCS SP8 X מיקרוסקופ קונפוקלי &nbsp;</td><td>לייקה</td><td>הופסק</td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי בינונית 15 מ"מ</td><td>קורנינג</td><td>25060-60</td><td>העיניים נשמרות כאן במהלך ניתוח הרשתית</td></tr><tr><td>מספריים מפלדה Merit 97-275</td><td>כישורים</td><td>97-275</td><td></td></tr><tr><td>מושך מיקרופיפטות</td><td>סאטר אינסטרומנט</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>גשושית mRNA של Mm-Gabrd-C2</td><td>ACD</td><td>459481-C2</td><td></td></tr><tr><td>תא המתת חסד בעכברים</td><td>NA</td><td>NA</td><td>בנייה בהתאמה אישית; צלחת פטרי מזכוכית המכסה צנצנת זכוכית קטנה.</td></tr><tr><td>מסנני ממברנת ניטרוצלולוז</td><td>GE Healthcare Life Sciences; ווטמן</td><td>7184-005</td><td>0.45 ומיקרו; גודל נקבוביות M</td></tr><tr><td>פיקוספריצר</td><td>חברת ג'נרל וואל</td><td>פיקוספריצר II&nbsp;</td><td>בטקסט מכונה יחידת הזרקה מיקרותאלית</td></tr><tr><td>פיפטות העברה מפלסטיק</td><td>פישרברנד</td><td>13-711-7M</td><td>לבניית פיפטת העברה מותאמת אישית</td></tr><tr><td>צינורות פלסטיק</td><td>טייגון</td><td>R-603</td><td>לחיבור למיכל קרבוגן</td></tr><tr><td>נבל פלטינום</td><td>בנייה מותאמת אישית</td><td>NA</td><td>לעיגון רשתיות מפוצלות בתוך תא ההקלטה האלקטרופיזיולוגי. &nbsp;</td></tr><tr><td>מברשת צבע בגודל 0</td><td>גנרי</td><td>NA</td><td>להטחת הרשתית במהלך פיצול.</td></tr><tr><td>ריאגנט אנטי-פייד זהב SlowFade</td><td>גשושיות מולקולריות</td><td>S36937&nbsp;</td><td>בטקסט מכונה מדיה נגד דעיכה</td></tr><tr><td>צלחת פטרי קטנה בקוטר 10 מ"מ</td><td>פלקון</td><td>353001</td><td>העיניים מונחות כאן לאחר הסרת השיער</td></tr><tr><td>זכוכית קטנה (7.5 ס"מ x 5 ס"מ)</td><td>גנרי</td><td>NA</td><td>חלקי רשתית מבודדים מונחים עליו לצורך הליך הפיצול</td></tr><tr><td>שקופיות סופרפרוסט פלוס מיקרוסקופ</td><td>פישרברנד</td><td>12-550-15</td><td>שקופיות זכוכית טעונות אלקטרוסטטית</td></tr><tr><td>פיפטות זכוכית בורוסיליקטיות עבות עם חוט&nb;</td><td>סאטר אינסטרומנט</td><td>BF150-86-10HP</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Scissors; ישר</td><td>טיטאן מדיקל</td><td>TMS121</td><td>לא ספציפי למותג; כל מספריים דומים יעבדו</td></tr><tr><td>vGATFLPo mouse</td><td>מעבדות ג'קסון</td><td>29591</td><td>RRID: IMSR_JAX:029591</td></tr><tr><td>עכבר vGlut2Cre</td><td>מעבדות ג'קסון</td><td>28863, 016963</td><td>RRID: IMSR_JAX:028863, RRID: IMSR_JAX:016963</td></tr><tr><td>ערכת תיקון NIR זומבים</td><td>ביולג'נד</td><td>423105</td><td>בטקסט מכונה MI-NIR</td></tr></tbody></table>

רשתית מפוצלת כהכנה שטוחה משופרת לחקר נוירונים בשכבה גרעינית פנימית ברשתית בעלי חוליות

Split Retina as an Improved Flatmount Preparation for Studying Inner Nuclear Layer Neurons in Vertebrate Retina

תאים דו-קוטביים ותאים אופקיים ברשתית בעלי החוליות הם תאי העצב הראשונים שמעבדים מידע חזותי לאחר זיהוי פוטונים על-ידי פוטורצפטורים. הם מבצעים פעולות בסיסיות כגון התאמת אור, רגישות לניגודיות והתנגדות מרחבית וצבע. הבנה מלאה של המעגלים המדויקים והמנגנונים הביוכימיים השולטים בהתנהגותם תקדם את המחקר במדעי המוח החזותיים ואת רפואת העיניים. עם זאת, ההכנות הנוכחיות לבדיקת תאים דו-קוטביים ואופקיים (תושבות שלמות רשתית ופרוסות אנכיות) מוגבלות ביכולתן ללכוד את האנטומיה והפיזיולוגיה של תאים אלה. בעבודה זו, אנו מציגים שיטה להסרת גופי תאים קולטי אור מרשתיות עכבר חיות ושטוחות, המספקות גישה משופרת לתאים דו-קוטביים ואופקיים להידוק טלאים יעיל ותיוג חיסוני מהיר. רשתיות מפוצלות מוכנות על ידי כריכת רשתית עכבר מבודדת בין שתי חתיכות של ניטרוצלולוז, ואז מקלפים אותן בעדינות זו מזו. ההפרדה מפצלת את הרשתית ממש מעל שכבת הפרספקס החיצונית ומניבה שתי חתיכות של ניטרוצלולוז, אחת מכילה את גופי התא קולטני האור והשנייה מכילה את הרשתית הפנימית שנותרה. בניגוד לפרוסות רשתית אנכיות, הכנת הרשתית המפוצלת אינה קוטעת את התהליכים הדנדריטיים של נוירוני הרשתית הפנימיים, ומאפשרת הקלטות מתאים דו-קוטביים ואופקיים המשלבים את התרומות של רשתות מצומדות למרווחים ותאים אמקריניים רחבי שדה. עבודה זו מדגימה את הרבגוניות של הכנה זו לחקר תאים אופקיים ודו קוטביים באלקטרופיזיולוגיה, אימונוהיסטוכימיה וניסויי הכלאה באתרם .

עבודה זו מציגה תכשיר רשתית שטוח חלופי שבו הסרת גופי תאים קולטי אור מאפשרת פיזור נוגדנים מהיר יותר וגישה משופרת של פיפטת טלאי לנוירונים ברשתית הפנימית לצורך אימונוהיסטוכימיה, הכלאה באתרו וניסויים אלקטרופיזיולוגיים.

Bipolar cells and horizontal cells of the vertebrate retina are the first neurons to process visual information after photons are detected by ...

הקבוצה שלנו מתעניינת במעגלים העצביים ובמנגנונים הסינפטיים שבבסיס עיבוד הראייה ברשתית. מעבדת מורגן חוקרת מנגנונים מולקולריים של הסתגלות לאור בתאים דו-קוטביים, ומעבדת סיוויר מתעניינת באופן שבו נוירונים ברשתית הפנימית תורמים לתפקוד תאי הגנגליון. גישה לנוירונים בשכבה הבין-גרעינית ברשתית הר שלמה היא אתגר למחקרים אנטומיים ופיזיולוגיים כאחד.נוירונים בשכבה הבין-גרעינית נגישים במקטעים אנכיים, אבל הם מעט מאוד נוירונים בשדה הראייה. יתר על כן, חיתוך מנתק תהליכים וקשרים רוחביים שיכולים להשפיע על מחקרים פיזיולוגיים. הסרת הפוטורצפטורים בטכניקת הרשתית המפוצלת משפרת באופן דרמטי את דיפוזיית הנוגדנים לתוך הרשתית הפנימית, מה שהופך את התיוג החיסוני של מטרות הרשתית הפנימית למהיר פי 20 בהשוואה לרשתית שלמה מסורתית.הרשתית המפוצלת גם משפרת מאוד את הגישה לנוירונים בשכבה הבין-גרעינית במהלך אלקטרופיזיולוגיה של מהדק טלאי. טכניקת הרשתית המפוצלת תפתח דלתות לגישות חדשות ותאיץ את קצב הניסויים שלנו. לדוגמה, אנו מתכננים להשתמש בטכניקה זו כדי לחקור קלט תאים דו-קוטביים לתאי גנגליון מלנופסין על ידי ביטוי צ'אנלרודופסין בתאים הדו-קוטביים.

split-retina-as-an-improved-flatmount-preparation-for-studying-inner

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

באופן מסורתי פרוסה האנכי והכנת כל הר של הרשתית שימשו ללימוד פונקציה של מעגלים הרשתית. כאן, אנו מתארים את הרומן חיתוך שיטה לשמר את המורפולוגיה הדנדריטים של נוירונים ברשתית ללא פגע.

פורסים הכנה אופקי של הרשתית

פרימטים שאינם בני אדם היא מין translational חשוב להבנת התפתחות והזדקנות. הארגון האנטומי של הרשתית הפרימטים עשויה לספק תובנות חשובות בתנאים נורמליים ופתולוגיים אצל בני אדם.

השער המוח: בניתוח עיניים הפרימאטים

אנו מתארים את ההכנה של פרוסות רשתית דקות ממימיות נמר סלמנדרות...

כל תא הקלטות בו זמנית מקולטני אור ועל נוירונים מסדר שני בהכנה פורסים רשתית אמפיבי

הפרוטוקול המתואר כאן מיועד להערכה מבנית של תכשיר רשתית שלם. זה כולל תיאורים של דיסקציה של רקמות, הרכבה על תוספת ממברנה פוליטטרפלואורואתילן הידרופילית (PTFE), העמסת בולוס עם סמנים פלואורסצנטיים, והשוואה של קיבוע עם קרבודימיד ופרפורמלדהיד לניתוח אימונוהיסטוכימי של רכיבים תאיים וסינפטיים.

פרוטוקול אופטימלי עבור רשתית Wholemount הכנה להדמיה ואימונוהיסטוכימיה

הרשתית המכרסם כבר זמן רב מוכרת כחלון נגיש למוח. במאמר זה טכני אנו מספקים פרוטוקול אשר מעסיק את מודל העכבר של מחלת רשתית הנגרמת חמצן כדי ללמוד את המנגנונים שיובילו לכישלון של התחדשות כלי דם במערכת העצבים המרכזית, לאחר פגיעה איסכמית. המערכת המתוארת גם ניתן לרתום לבחון אסטרטגיות לקידום צמיחה מחודשת של כלי דם פונקציונליים בתוך הרשתית ומערכת העצבים המרכזית.

הערכה של כלי דם התחדשות במערכת העצבים המרכזית באמצעות רשתית העכבר

פרוטוקול זה מדגים כיצד לבצע הקלטת תיקון מהדק כל תא על נוירונים ברשתית מן הכנת שטוח הר.

צמד תיקון הקלטה של ​​תאי הקרנות amacrine בתוך הכנת שטוח הר Deafferentated רשתית העכבר

פתחנו תכשיר חתך אופקי של הרשתית היונקת הבוגרת עם המטוס של חתך במקביל לפני שטח הרשתית. שדות דנדריטים של נוירונים ברשתית אוריינטציה nonradially לא היו מקוצץ, המאפשר חקר עיבוד אותות עם טכניקות תיקון- clamp והדמיה.

הכנת פרוסות אופקיות של רשתית למבוגרים עכבר עבור אלקטרו מחקרים

הדמיה רקמת רשתית יכול לספק מידע מתא בודד לא יכול להיות שנאספו שיטות ביוכימיות מסורתיות. פרוטוקול זה מתאר הכנה של הרשתית פרוסות דג זברה הדמיה קונפוקלי. פלורסנט מקודדים גנטית חיישנים או מחוון צבע לאפשר הדמיה של תהליכים ביולוגיים רבים סוגי תאים ברשתית ברורים.

הכנת פרוסות דג זברה למבוגרים עבור לשעבר Vivo הדמיה ניסויים ברשתית טריים

רטינופתיה סוכרתית היא אחד הגורמים המובילים לעיוורון. היסטולוגיה, בדיקת פירוק מחסום רשתית דם, ואנגיוגרפיה פלואורסצנטית הן טכניקות בעלות ערך להבנת הפתופיזיולוגיה של הרשתית, אשר יכול לשפר עוד יותר את ההקרנה היעילה של סמים נגד רטינופתיה סוכרתית.

הערכה פתופיפיזיולוגית של רשתית במודל חולדה

אנו מתארים שיטה להפרדה יעילה של אפיתל פיגמנט הרשתית (RPE) מהרשתית בעיניים אנושיות ויצירת שטוחים שלמים של RPE/כורואידים לצורך ניתוחים היסטולוגיים ומורפומטריים של ה-RPE.

ייצור יעיל ועקבי של אפיתל פיגמנט רשתית/כורואיד שטוח מעיני אדם לניתוח היסטולוגי

חקור הכנת רשתית מפוצלת לחקר נוירונים בשכבה גרעינית פנימית בעכברים. שיטה זו מאיצה פעילות נוגדנים פי עשרים ומשפרת גישה לניסויים פיזיולוגיים ואימונוהיסטוכימיה ברשתית.

רשתית מפוצלת כהכנה שטוחה משופרת לחקר נוירונים בשכבה גרעינית פנימית ברשתית בעלי חוליות

גלה סרטונים נוספים