Name: הזרקה תוך-תטית של עכבר שזה עתה נולד לצורך עריכת גנום ואספקת תרופות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 33 s
Description: למד את פרוטוקול ההזרקה התוך-תטית בעכברים שזה עתה נולדו לעריכת גנום ואספקת תרופות למערכת העצבים המרכזית. שיטה זו מאפשרת מסירה יעילה ובטוחה יותר מזריקות תוך-חדריות מסורתיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

XNL נתמך על ידי הקרן לפוסט-דוקטורט תרפויטי של תסמונת אנג'למן (FAST). YHJ נתמך גם על ידי FAST ו-NIH Grant R01HD110195 ו-R01MH117289.

הנהלים והפרוטוקולים המתוארים היו בהתאם להנחיות המפורטות במדריך המכונים הלאומיים לבריאות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. בנוסף, ההליכים קיבלו אישור מהוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת ייל. עכברים ונקבות מסוג בר שזה עתה נולדו (WT) C57BL/6J שימשו למחקר שהוצג. בעלי החיים התקבלו ממקור מסחרי (ראו טבלת חומרים).
1. הכנת סביבת העבודה
<ol><li>הכינו תחילה את הפריטים הבאים: קרח רטוב להרדמה בהקפאה, כלוב ריק להפרדת הגורים מהסכר, מיקרוסקופ נתיחה, מקור אור, משטח נקי להנחת בעל החיים בזמן ההזרקה, צמר גפן, כרית חימום, מזרק 25/10 מיקרוליטר ומחט 34 גרם / 0.375 אינץ' / 12 DEG (ראה טבלת חומרים). הערה: הרדמה Cryo-רדמה עבור גורי עכברים באמצעות קרח רטוב היא צעד אופציונלי שנועד להקל על הטיפול, להפחית את תנועת הגורים ולמזער אי נוחות פוטנציאלית לבעלי חיים. שלב זה של הרדמה בהקפאה עשוי גם לספק את היתרון של הורדת לחץ תוך גולגולתי והפחתת סיבוכים הקשורים לנפח 9,10.</li>
	<li>העבירו את הגורים לכלוב נפרד הרחק מהסכר בזמן הטיפול בהם.</li>
	<li>שקלו כל גור ותעדו את משקלו.</li>
	<li>נגב את גב העכבר באמצעות גזה ואתנול. אשר את החלל הבין חולייתי או, לכל הפחות, את קו האמצע של תעלת עמוד השדרה (שאמור להופיע אדום בגורי P1) באמצעות המיקרוסקופ המנתח (וידאו משלים 1).</li>
</ol>2. הליך הזרקה
<ol><li>כדי להרדים גור בודד, הניחו אותו בעדינות על מחסום עמיד למים כגון שרוול לטקס או רדיד אלומיניום על אמבט קרח למשך 3-5 דקות. חשוב להימנע מלהשאיר את בעל החיים על הקרח לתקופה ממושכת, שכן הדבר עלול להוות סיכונים פוטנציאליים לסיבוכים הקשורים להיפותרמיה, כולל פרפור חדרים, היפוקסיה של רקמות וחמצת מטבולית. הערה: משך הזמן של 3-5 דקות עשוי להשתנות בכל מקרה לגופו. להעריך את סימני ההרדמה, כגון חוסר תגובה צביטת בוהן, כדי לקבוע את משך הזמן המתאים.</li>
	<li>בזמן שהחיה נמצאת על הקרח, טען את המזרק עם 10 μL של נוסחת התרופה, הכנת וירוסים, או לשלוט בנוזל עמוד השדרה המלאכותי וכו '. הערה: במהלך שלב הלמידה, שקול את האפשרות להזריק את אותו נפח של צבע ירוק מהיר 1% מעורב עם חומרי המשלוח (ראה טבלת חומרים). זה יכול לסייע בהדמיה של תהליך ההזרקה ולסייע בלמידה ושכלול של הטכניקה. גורים המוזרקים להם צבע ירוק מהיר או חומרים דומים צריכים לעבור המתת חסד זמן קצר לאחר ההזרקה בהתאם לפרוטוקול המאושר, שכן חומרים אלה עלולים לגרום לתגובות דלקתיות או לתופעות לוואי אחרות בבעלי חיים.</li>
	<li>לאחר שהחיה מורדמת במלואה, כפי שאושר על ידי תנועת גוף מופחתת או נעדרת, מקמו בעדינות את הגורים מתחת למיקרוסקופ.</li>
	<li>בעזרת האצבע המורה והאגודל השמאליים, יש למשש בזהירות את החלל הבין חולייתי לאורך קו האמצע, הממוקם בין חגורות האגן הדו-צדדיות (סרטון משלים 1). סובב מעט בעדינות את בסיס הזנב כדי לסייע בזיהוי קו האמצע של עמוד השדרה.</li>
	<li>כוונן את שיפוע המחט לכיוון ראש החיה לפני ההזרקה.</li>
	<li>הכנס בזהירות את המחט, הטה אותה מעט לזווית של 70°-80° בנקודה שבה השקע מצטלב, תוך הקפדה על כך שהמזרק נשאר מיושר עם מישור הקשת המרכזי. כאשר המחט יוצרת מגע עם העצם, להקטין בהדרגה את הזווית עד כ 30°, ולאחר מכן לקדם את המחט על 2 מ"מ לתוך החלל הבין חולייתי. הערה: היכולת של המחט להרים מעט את כל הגוף היא סימן לכניסה מוצלחת לחלל התוך-דוראלי.</li>
	<li>להזריק באיטיות עד 10 μL נפח בתוך 50-60 שניות. שמור את המחט במקום במשך 10-20 שניות לאחר השלמת הלידה. משכו את המחט בסיבוב עדין כדי למנוע דליפה. הערה: המוח הקטן יהפוך לירוק לפני משיכת המחט. כמו כן, הדחיפה האיטית היא קריטית כדי למנוע עלייה בלחץ תוך גולגולתי הקשור ללידה ולמזער סיבוכים פוטנציאליים. בהתבסס על הניסיון שלנו עם זריקות ביותר מ-500 גורים, אספקת נפח של 10 μL במשך 50-60 שניות היא אופטימלית.</li>
</ol>3. לאחר הזרקה
<ol><li>יש למרוח צמר גפן על אתר ההזרקה אם יש דליפה או דם. הערה: לא אמור להיות כזה ברוב המקרים. מניסיוננו, גורים שטופלו עם עקבות של דליפה או דם עדיין שמישים, אך ייתכן שיהיה צורך לשקול מינון מופחת של תרופות או טיפולים במהלך ניתוח הנתונים.</li>
	<li>הניחו את הגור על כרית חימום והמתינו 10-15 דקות עד שהגורים יתאוששו לחלוטין ויתחממו מחדש. התבוננו היטב בגורים כדי לוודא שהם ערניים ונעים באופן פעיל לפני החזרתם לכלוב הביתי שלהם. התאוששות נאותה של עכבר מסומנת על ידי שחזור צבע העור הוורוד, תנועת גוף ספונטנית מוגברת ותגובות תגובה למגע.</li>
	<li>החזירו את הגור לכלוב הביתי וודאו שהגור מכוסה כראוי במצעים, בקן או בשניהם. זה מבטיח שהגור יקבל את הטיפול האימהי הדרוש מהסכר.</li>
	<li>להעריך את המראה הכללי ואת הפעילות מדי יום לפחות 3 ימים לאחר ההזרקה. הופעה חולנית ופעילות מופחתת עלולים להעלות את האפשרות לזיהום, תופעות לוואי הקשורות לטיפול או סיבוכים אחרים וכו'. במידת הצורך, יש להתייעץ עם רופא וטרינרי.</li>
</ol>

פרוטוקול מקיף למתן זריקות תוך-תאיות בעכברי יילודים

<ol><li>Hoy, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Onasemnogene+abeparvovec%3A+first+global+approval%5BTitle%5D)+AND+%22Drugs%22%5BJournal%5D)">Onasemnogene abeparvovec: first global approval.</a> Drugs. 79 (11), 1255-1262 (2019).</li>
<li>Ramos, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+SMN+expression+in+disease-relevant+tissue+and+implications+for+SMA+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Age-dependent SMN expression in disease-relevant tissue and implications for SMA treatment.</a> J Clin Invest. 129 (11), 4817-4831 (2019).</li>
<li>Fedorova, E., Battini, L., Prakash-Cheng, A., Marras, D., Gusella, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+gene+delivery+to+CNS+by+spinal+intrathecal+administration+to+neonatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gene+Med%22%5BJournal%5D)">Lentiviral gene delivery to CNS by spinal intrathecal administration to neonatal mice.</a> J Gene Med. 8 (4), 414-424 (2006).</li>
<li>Dindot, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ASO+therapy+for+Angelman+syndrome+that+targets+an+evolutionarily+conserved+region+at+the+start+of+the+UBE3A-AS+transcript%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">An ASO therapy for Angelman syndrome that targets an evolutionarily conserved region at the start of the UBE3A-AS transcript.</a> Sci Transl Med. 15, eabf4077(2023).</li>
<li>Amanat, M., Nemeth, C. L., Fine, A. S., Leung, D. G., Fatemi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antisense+oligonucleotide+therapy+for+the+nervous+system%3A+from+bench+to+bedside+with+emphasis+on+pediatric+neurology%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Antisense oligonucleotide therapy for the nervous system: from bench to bedside with emphasis on pediatric neurology.</a> Pharmaceutics. 14 (11), 2389(2022).</li>
<li>Frangoul, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+gene+editing+for+sickle+cell+disease+and+%CE%B2-Thalassemia%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 gene editing for sickle cell disease and β-Thalassemia.</a> N Engl J Med. 384, 252-260 (2021).</li>
<li>Gillmore, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+in+vivo+gene+editing+for+transthyretin+amyloidosis%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 in vivo gene editing for transthyretin amyloidosis.</a> N Engl J Med. 385, 493-502 (2021).</li>
<li>Krol, A., Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Windows+of+opportunity%3A+timing+in+neurodevelopmental+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Windows of opportunity: timing in neurodevelopmental disorders.</a> Curr Opin Neurobiol. 48, 59-63 (2018).</li>
<li>Birg, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+temperature+influences+intracranial+pressure+and+cerebral+perfusion+pressure+after+traumatic+brain+injury%3A+A+CENTER-TBI+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Neurocrit+Care%22%5BJournal%5D)">Brain temperature influences intracranial pressure and cerebral perfusion pressure after traumatic brain injury: A CENTER-TBI Study.</a> Neurocrit Care. 35, 651-661 (2021).</li>
<li>Rossi, S., Zanier, E. R., Mauri, I., Columbo, A., Stocchetti, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+temperature%2C+body+core+temperature%2C+and+intracranial+pressure+in+acute+cerebral+damage%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Neurosurg+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Brain temperature, body core temperature, and intracranial pressure in acute cerebral damage.</a> J Neurol Neurosurg Psychiatry. 71 (4), 448-454 (2001).</li>
<li>Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracerebroventricular+viral+injection+of+the+neonatal+mouse+brain+for+persistent+and+widespread+neuronal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction.</a> J Vis Exp. 91, e51863(2014).</li>
<li>Petrou, P., Kassis, I., Yaghmour, N. E., Ginzberg, A., Karussis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phase+II+clinical+trial+with+repeated+intrathecal+injections+of+autologous+mesenchymal+stem+cells+in+patients+with+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci+%28Landmark+Ed%29%22%5BJournal%5D)">A phase II clinical trial with repeated intrathecal injections of autologous mesenchymal stem cells in patients with amyotrophic lateral sclerosis.</a> Front Biosci (Landmark Ed). 26 (10), 693-706 (2021).</li>
<li>Kroin, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanisms+of+intracranial+pressure+modulation+by+epidural+blood+and+other+injectates+in+a+postdural+puncture+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22Anesth+Analg%22%5BJournal%5D)">The mechanisms of intracranial pressure modulation by epidural blood and other injectates in a postdural puncture rat model.</a> Anesth Analg. 95 (2), 423-429 (2002).</li>
<li>Møllgård, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mesothelium+divides+the+subarachnoid+space+into+functional+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A mesothelium divides the subarachnoid space into functional compartments.</a> Science. 379 (6627), 84-88 (2023).</li>
<li>Chakrabarty, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capsid+serotype+and+timing+of+injection+determines+AAV+transduction+in+the+neonatal+mice+brain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Capsid serotype and timing of injection determines AAV transduction in the neonatal mice brain.</a> PLoS One. 8, e67680(2013).</li>
<li>Semple, B. D., Blomgren, K., Gimlin, K., Ferriero, D. M., Noble-Haeusslein, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+development+in+rodents+and+humans%3A+Identifying+benchmarks+of+maturation+and+vulnerability+to+injury+across+species%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Brain development in rodents and humans: Identifying benchmarks of maturation and vulnerability to injury across species.</a> Prog Neurobiol. 160-107, 1-16 (2013).</li>
</ol>

YHJ הוא מייסד שותף של Couragene אך אין ניגוד אינטרסים בפרויקט זה.

מתואר הליך שלב אחר שלב להזרקה תוך-תאית בעכברים יילודים (P1), וכתוצאה מכך הפצה נרחבת של תרופות במוחם. בהשוואה לשיטת ההזרקה התוך-מוחית הנפוצה למתן תרופות לעכברי יילודים, הכוללת פירסינג בקליפת המוח11, הזרקה תוך-תאית מונעת פגיעה ישירה במוח העכבר של היילוד עקב חדירת מחט. בשל פולשניות מינימלית, הזרקה intrathecal יכול להתבצע שוב ושוב בעת הצורך, המדמה מתן חוזר בבני אדם במסגרת קלינית12.
שינויים בלחץ התוך גולגולתי קשורים בדרך כלל להזרקה תוך-תאית13, מה שעלול להוביל לדחיית הסכר וסירוב להאכיל עקב שינויים התנהגותיים אצל הגורים. עם זאת, לא נצפו שינויים חריפים בהתנהגות או הישרדות מופחתת בקרב גורים מוזרקים. באופן דומה, התנהגויות חריגות או חריגות הקשורות לזריקות תוך תאיות במבוגרים לא הבחינו (הנתונים לא מוצגים).
ייתכן שמספר טיפים טכניים תרמו להצלחה וכדאי לשים עליהם דגש. קצב ההזרקה האיטי יותר הוא ככל הנראה גורם חשוב. בנוסף, הרדמה קריו-הרדמה עשויה להפחית את הלחץ התוך גולגולתי לפני ההזרקה, למזער את הזרימה האחורית במהלך ההזרקה התוך-תאית ולהפחית סיבוכים אחרים. לבסוף, הדיוק של אתר ההזרקה עשוי להשפיע גם על שיעור ההצלחה.
כדי להשיג את היעילות הטובה ביותר באמצעות מתן תוך-תיקלי, ביצוע ההליך בהקדם האפשרי לאחר לידת הגורים הוא קריטי. תרופות וחומרים אחרים המועברים באמצעות הזרקה תוך-תאית נכנסים לחלל התוך-תאי, שהוא החלל שבין שכבות הארכנואיד מאטר והפיה מאטר של קרומי המוח המקיפים את המוח וחוט השדרה. לכן, התרופות המועברות באמצעות הזרקה תוך-תאית עוברות דרך שכבות אלה של קרומי המוח12. במכרסמים, כמו בבני אדם, קרומי המוח מורכבים משלוש שכבות: דורה מאטר, מאטר ארכנואיד ופיה מאטר14. קרומים אלה נוצרים במהלך ההתפתחות העוברית והם בשלים לחלוטין ביום 2 (P2)15 שלאחר הלידה. לכן, מומלץ להשתמש בפרוטוקול גנוטיפ מהיר כדי להקצות את הגורים לקבוצות ניסוי תוך מספר שעות, במיוחד בניסויים הכוללים גנוטיפים של בעלי חיים, כגון ניסויים בעריכת גנים. ככל שהגורים מוזרקים מוקדם יותר, כך התוצאה טובה יותר. הזריקות מסתיימות בדרך כלל תוך 3 שעות לאחר הלידה. חלון זמן זה מאפשר לתרופות המוזרקות לעקוב אחר זרימת הנוזל השדרתי לתוך פרנכימה במוח בעוד רירית אפנדימל עדיין לא בשלה ופחות מושפעת מגודל חלקיקי הסמים. ראוי לציין את ההבדלים ההתפתחותיים בין בני אדם לעכברים. עכברי יילודים P1 מתאימים לשלב ההריון המאוחר של התפתחות המוח האנושי16. תוצאות מניסויים בעכברי יילודים P1 משמשות כהוכחת היתכנות רבת ערך, אך יש לנקוט משנה זהירות כאשר משערים תוצאות אלה לבני אדם בתכנוני מחקר תרגומי.
טכניקה זו מאותגרת על ידי חלון זמן ניהול מוגבל והדרישה לנסיינים מיומנים. תמותה גבוהה עשויה להיות קשורה להליך אם הנסיין חסר ניסיון. עם זאת, מסגרת הזמן הצרה דורשת רמה מוגברת של דיוק וחזרתיות בתוך ובין מחקרים. יתר על כן, עם תרגול נאות, המיומנות ושיעור ההצלחה של שיטה זו ניתן לשפר באופן משמעותי.
אם הזריקות מבוצעות כראוי, הישרדותם של גורים מוזרקים מושפעת בעיקר מטיפול אימהי. מומלץ להכין זוגות נשים אומנה למטרות שלך. אם לגורים המיועדים אין כתם חלב על הבטן בשעות אחר הצהריים של יום ההזרקה, יש להעבירם מיד לנקבת האומנה. נקבות עכברים מזהות את התינוקות שלהן לפי הריח. לכן, חשוב להימנע מהחדרת ריחות לא מוכרים של נסיינים או סכרים לא קשורים לגורים במהלך ההליך ולאחריו. עם זאת, יש לבחון את הצורך בשימוש בנקבות אומנה לצורך ניסויים פרטניים. מומלץ גם לבצע את ההליך בחדר מאוורר היטב, רצוי במנדף ביולוגי. ערבוב הגורים עם מצעי הסכר וצואה מועיל גם הוא. לאחר הבדיקה הראשונית שלאחר ההליך, מומלץ למזער את ההפרעה לסכר למשך 3 ימים לפחות כדי להפחית את הלחץ. כמו כל הליך כירורגי, יש לקחת בחשבון את הסיכון לזיהום לאחר ההליך. לפיכך, יש להקפיד על נוהלי מעבדה טובים להליכים סטריליים במהלך ההזרקה. יש לציין כי לחץ intrathecal הוא גבוה יותר מאשר הסביבה החיצונית, מתן הגנה טבעית מפני זיהום. הניסיון מצביע על כך ששיעור הזיהומים לאחר ההזרקה הוא נדיר. עם זאת, מומלץ לעקוב מדי יום אחר המראה הכללי והפעילות של הגורים לפחות 3 ימים לאחר ההזרקה כדי לזהות סימנים ותסמינים של זיהום או סיבוכים אחרים. במקרים מיוחדים ניתן להצדיק התייעצות עם השירותים הווטרינריים במקום המתת חסד של גורים עם סיבוכים משמעותיים.

הזרקה תוך-תאית (IT) היא הליך קליני נפוץ המשמש למתן תרופות, איסוף נוזל מוחי שדרתי ושמירה על לחץ תוך גולגולתי הן בחולים ילדים והן במבוגרים במרפאות 1,2. מתן תרופות באמצעות הזרקה תוך-תאית הוא גישה יעילה להעלאת ריכוזי התרופות במערכת העצבים המרכזית (CNS) תוך מזעור החשיפה המערכתית. כתוצאה מכך, שיטה זו משפרת את היעילות הטיפולית ומפחיתה תופעות לוואי, במיוחד עבור תרופות רגישות לטמפרטורה וקצרות זמןמחצית חיים 3.
במחקרים פרה-קליניים הבודקים תרופות וטיפולים חדשים באמצעות מודלים של מכרסמים, הכרחי להשתמש בשיטה אמינה של מתן תרופות המציעה דיוק רב יותר ויכולת שחזור תוצאה 4,5. עבור מחקרים פרה-קליניים המעריכים טיפולים חדשים להפרעות נוירוגנטיות ונוירו-התפתחותיות, טיפול מוקדם הוא חיוני למחקרי הוכחת היתכנות ראשוניים מכיוון שהתערבויות מוקדמות יותר צפויות בדרך כלל להניב תוצאות חיוביות יותר 6,7,8.
בהשוואה לזריקות תוך-מוחיות קונבנציונליות (ICV), זריקות IT נושאות סיכונים נמוכים משמעותית מכיוון שהן מייתרות את הצורך בחדירה ישירה דרך קליפת המוח. יתרון זה מפחית באופן משמעותי את הנזק הפוטנציאלי לרקמת קליפת המוח האזורית ולעצבים הסובבים אותה. יתר על כן, הזרקות IT מאפשרות להגדיל לפחות פי חמישה את נפח התרופות באמצעות זריקה אחת, מה שמשפר מאוד את ההיתכנות של מתן חוזר. עם זאת, בשל גודלם הקטן ואופיים השברירי של עכברים שזה עתה נולדו, ביצוע זריקות תוך-תיקליות בגורים שזה עתה נולדו הוא מאתגר מבחינה טכנית ודורש טכניקות מיוחדות, ציוד וטיפול קפדני.
מאמר זה מספק פרוטוקול מפורט עם הוראות שלב אחר שלב לביצוע זריקות intrathecal בגורי P1 שזה עתה נולדו. השיקולים המרכזיים ונוהלי מעבדה טובים מודגשים כאן כדי להבטיח את עקביות הניהול ואת הבטיחות והרווחה של בעלי החיים במהלך ההליך. על ידי ביצוע פרוטוקול זה, החוקרים יכולים לבצע ניסויים בביטחון בדיוק וביכולת שחזור תוך מזעור סיכונים פוטנציאליים או אי נוחות לבעלי החיים.

<table><tbody><tr><td>עכברי Balance</td><td>Ohaus Corporation</td><td>30253017</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J</td><td>מעבדת ג'קסון</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ דיגיטלי</td><td>RWD</td><td>DOM-1001</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>ThermoFisher</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green</td><td>Sigma</td><td>F7252-5G</td><td></td></tr><tr><td>כרית חימום</td><td>RWD</td><td>69020</td><td></td></tr><tr><td>מחטים</td><td>המילטון</td><td>6PK (34/0.375 אינץ'/4/12DEG)S</td><td></td></tr><tr><td>מזרק</td><td>המילטון</td><td>1702RN</td><td></td></tr><tr><td>מסנני מזרק</td><td>סיגמא</td><td>SLGVM33RS</td><td></td></tr></tbody></table>

הזרקה תוך-תטית של עכבר שזה עתה נולד לצורך עריכת גנום ואספקת תרופות

Intrathecal Injection of Newborn Mouse for Genome Editing and Drug Delivery

הזרקה תוך-תאית היא הליך נפוץ הן במרפאות ילדים והן במרפאות מבוגרים, ומשמשת כאמצעי יעיל למתן תרופות וטיפולים. על ידי העברה ישירה של תרופות וטיפולים לנוזל השדרה של מערכת העצבים המרכזית, שיטה זו משיגה ריכוזי תרופות מקומיים גבוהים יותר תוך הפחתת תופעות לוואי מערכתיות בהשוואה למסלולים אחרים כגון זריקות תוך ורידי, תת עוריות או תוך שריריות. חשיבותו משתרעת מעבר להגדרות קליניות, שכן הזרקה תוך-תאית ממלאת תפקיד חיוני במחקרים פרה-קליניים המתמקדים בטיפול בהפרעות נוירוגנטיות במכרסמים ובבעלי חיים גדולים אחרים, כולל פרימטים שאינם אנושיים. עם זאת, למרות היישום הנרחב שלה, הזרקה intrathecal בצעירים, במיוחד גורי יילודים, מציב אתגרים טכניים משמעותיים בשל גודלם הקטן ואופיים השברירי. מתן מוצלח ואמין של זריקות תוך-תיקליות בעכברים שזה עתה נולדו דורש תשומת לב קפדנית לפרטים והתחשבות זהירה בגורמים השונים. לפיכך, יש צורך חיוני בפרוטוקול סטנדרטי שלא רק מספק הוראות, אלא גם מדגיש שיקולים טכניים מרכזיים ונוהלי מעבדה טובים כדי להבטיח עקביות פרוצדורלית, כמו גם את בטיחותם ורווחתם של בעלי החיים.
כדי לענות על צורך זה שלא נענה, אנו מציגים פרוטוקול מפורט ומקיף לביצוע זריקות תוך תאיות במיוחד בגורים שזה עתה נולדו ביום 1 שלאחר הלידה (P1). על ידי ביצוע ההוראות שלב אחר שלב, חוקרים יכולים לבצע בביטחון זריקות intrathecal בגורים יילודים, המאפשר משלוח מדויק של תרופות, אוליגוס אנטיסנס, וירוסים עבור החלפת גנים או טיפולים מבוססי עריכת גנום. יתר על כן, מודגשת החשיבות של הקפדה על שיטות מעבדה טובות כדי לשמור על רווחתם של בעלי חיים ולהבטיח תוצאות ניסוי אמינות. פרוטוקול זה נועד להתמודד עם האתגרים הטכניים הקשורים לזריקות תוך-תיקליות בעכברים יילודים, ובסופו של דבר להקל על התקדמות בתחום המחקר הנוירוגנטי שמטרתו לפתח התערבויות טיפוליות פוטנציאליות.

הזרקה אינטרתאית מוצלחת הביאה מיד להפצה נרחבת של התמיסה המנוהלת, אם כי החדירה התאית בפועל הייתה תלויה באופי התרופות והחומרים המועברים. במחקר הזה השתמשנו בירוק מהיר כדי להמחיש את התוצאות המיידיות לאחר הזרקה תוך-תאית (IT) בילודים מסוג בר (איור 1A-K) והשווינו זאת להזרקה תוך-מוחית קונבנציונלית (ICV) (איור 1L-N). התוצאות ארוכות הטווח (10 ימים לאחר ההזרקה) נבדקו גם באמצעות עכברי כתב YFP שהופעלו על ידי מתן עריכה גנטית מבוססת CRISPR/Cas97. ביטוי YFP נצפה באופן נרחב בכל מוח העכבר בהשוואה לעכברים שלא טופלו ב-CRISPR/Cas9 (איור 2). ביטוי YFP נצפה ברוב התאים תחת הגדלה גבוהה יותר. הזריקות בוצעו ביותר מ-500 גורים שזה עתה נולדו, ויותר מ-98% מהגורים שהוזרקו שרדו את ההליך. לא נצפו השפעות מזיקות על הישרדותם ובריאותם לטווח ארוך של גורים מטופלים (איור משלים 1).
<img alt="מוח עוברי מוזרק לעומת מוח עוברי שלא מוזרק, חלוקת צבעים, מחקר מהלך זמן, השוואה של 15 תמונות." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65761/65761fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> איור 1: התפלגות טמפורלית ומרחבית של צבע ירוק מהיר במוחות עכברים. (A) תצפית גסה על עכברים, השוואה בין עכברים מוזרקים ללא מוזרקים 5 דקות לאחר הזרקה תוך-תקלית. (B) הדמיה של התפלגות הצבע הירוק המהיר במוח העכבר לפני נתיחה. (ג-ה) פיזור הצבע במוחות מנותחים 5 דקות לאחר מתן תוך-תיקלי. (פ-ח) פיזור הצבע במוחות מנותחים 30 דקות לאחר מתן תוך-תיקלי. (ט-ק) פיזור הצבע במוחות מנותחים 60 דקות לאחר מתן תוך-תיקלי. (יב-נ) לשם השוואה, התפלגות הצבע במוחות מנותחים 40 דקות לאחר מתן תוך-מוחי. סרגל קנה מידה: 1 מ"מ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65761/65761fig01large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="דיאגרמת חתכי מוח היסטולוגיים; צביעת YFP ו- DAPI, ניתוח המוח הקטן וקליפת המוח, תמונה ממוזגת." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65761/65761fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> איור 2: השפעות ארוכות טווח של עריכת גנים CRISPR/Cas9 תוך תתי. ביטוי נרחב של כתב YFP במוח העכבר בעקבות הזרקה תוך-תאית של עריכת גנים CRISPR/Cas9: המוח הקטן (A-F), קליפת המוח האחורית (D-F) וקליפת המוח הקדם-מצחית (G-I). סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65761/65761fig02large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
איור משלים 1: עקומת הישרדות של עכברי תסמונת אנג'למן לאחר עריכת גנים תוך-תאיים של CRISPR. עקומת הישרדות המתארת את התוצאות של עכברי תסמונת אנג'למן שקיבלו עריכה גנטית של CRISPR באמצעות מתן תוך-תאי, בהשוואה לעכברים מסוג לא מטופל ופראי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65761/Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
סרטון משלים 1: הליך הזרקה תוך-תאי בעכברי יילודים. סרטון המדגים את תהליך מתן הזריקות התוך-תאיות לעכברים יילודים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65761/Supplementary%20Video%201.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד סרטון זה.</a>

הפרוטוקול הנוכחי מתווה הוראות שלב אחר שלב לביצוע זריקות תוך-תיקליות בעכברים יילודים לצורך עריכת גנים והעברת תרופות.

Intrathecal injection is a commonly employed procedure in both pediatric and adult clinics, serving as an effective means to administer medications and ...

הקבוצה שלנו מיישמת גישה בין-תחומית הכוללת גילוי גנומי ומידול פונקציונלי לחקר גנטיקה ובסיס אפיגנטי של הפרעה נוירו-התפתחותית. אנו מבצעים אנליזה מולקולרית, נוירופיזיולוגית ונוירו-התנהגותית באמצעות תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי המטופל, או iPSC, בעכברים מוטנטיים כדי לנתח את הפתופיזיולוגיה של הפרעה נוירו-התפתחותית. אנו שואפים לפתח טיפול מבוסס עריכה גנטית למחלה זו.הזרקה תוך-מוחית, המכונה גם ICV, היא רק שיטה לספק טיפול ישיר למערכת העצבים המרכזית של עכברים ילודים. עם זאת, הוא צריך לחדור דרך קליפת המוח. הזרקת intrathecal, IT, היא הליך נפוץ במרפאות, המשמש אמצעי יעיל לניהול טיפולים ישירות לתוך מערכת העצבים המרכזית.עם זאת, הזרקה תוך-תאית בגורים בילודים עלולה להציב אתגרים טכניים משמעותיים בשל גודלם הקטן ואופיים השברירי. אנו מנסים לפתח שיטת העברה יעילה ואמינה לבדיקת היעילות והעריכה הגנטית במוח עכבר שאינה ויראלית ואינה ננו-חלקיקית. בהשוואה להזרקת ICV קונבנציונלית, הזרקה תוך תאית מהווה סיכון נמוך משמעותית, שכן היא מונעת את הצורך בחדירה ישירה דרך קליפת המוח.זה מוסיף יתרון כדי למזער נזק פוטנציאלי לרקמת קליפת המוח האזורית ולעצבים שמסביב. זריקות תוך-תאיות גם מאפשרות להגדיל לפחות פי חמישה את נפח התרופות באמצעות זריקה אחת ומשפרות מאוד את ההיתכנות של מתן חוזר.

intrathecal-injection-newborn-mouse-for-genome-editing-drug

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

מקור: Zamboni, M., et al., אינדוקציה של שינוי תאי לפטומנינגיאלי באמצעות הזרקה תוך-ציסטרנלית. J. Vis. Exp. (2020)סרטון זה מדגים את ההליך של העברת תרופה משרה לבור המים של עכבר מורדם. ההזרקה גורמת באופן סלקטיבי לביטוי סמן פלואורסצנטי בתאי פני המוח הנגישים באמצעות נוזל מוחי שדרתי, שאושר על ידי הדמיה פלואורסצנטית.

מתן תרופות ממוקד במודל עכבר באמצעות הזרקת Cisterna Magna

סרטון זה מתאר טכניקה יעילה לגרימת גליובלסטומות (GBM) באמצעות דנ"א טרנספוזוני המוזרק לחדרים של עכברים ילודים. תאים של האזור התת חדרי, אשר לוקחים את פלסמיד, לשנות, להתרבות וליצור גידולים עם מאפיינים היסטופתולוגיים של GBM אנושי.

השראת גליובלסטומה באמצעות טרנספוזיציה בתיווך SB: טכניקה ליצירת מודל עכבר חדשני באמצעות שילוב מתווך טרנספוזון של פלסמיד SB במוח עכבר יילודים

מקור: Fricano-Kugler, C. J., et al. תכנון, אריזה ואספקה של CRISPR רטרו ולנטי-וירוסים עם טיטר גבוה באמצעות הזרקה סטריאוטקסית. J. Vis. Exp. (2016)סרטון זה מדגים הזרקה ויראלית סטריאוטקסית לעריכה מדויקת של גנים עצביים במוח העכבר. הפרוטוקול מבטיח העברת וירוסים מדויקת לבליטה המשוננת, ומאפשר תיוג פלואורסצנטי ונוקאאוט גנים בתיווך CRISPR לחקור מעגלים עצביים, תפקוד גנים ומנגנוני מחלה in vivo.

הזרקה ויראלית סטריאוטקסית לעריכה גנטית עצבית ממוקדת במוח העכבר

מקור: Li, D., et al. הזרקה תוך-תקלית ישירה של נגיפים רקומביננטיים הקשורים לאדנו בעכברים בוגרים. J. Vis. Exp. (2019)סרטון זה מדגים את הליך ההזרקה התוך-תקלית של נגיפים הקשורים לאדנו (AAV) לנוזל המוח (CSF) של עכבר ער, המכסה הכנת מזרק, יישור עמוד השדרה והחדרת מחט מדויקת. שיטה זו מאמתת העברת גנים ממוקדת, ותומכת בפוטנציאל שלה לטיפולים במערכת העצבים המרכזית.

העברה תוך-תקלית של וירוסים במודל עכבר לטיפול במחלות מערכת העצבים המרכזית

דו"ח זה מתאר טכניקה פשוטה ומהירה של נקב מחט intrathecal עבור transfection מקומי של siRNA בחוט השדרה המותני בעכבר תחת הרדמה קצרה אור בר קיימא.

בVivo siRNA Transfection וג&#39;ין מציאה בחוט השדרה באמצעות ראפיד פולשנית מותני intrathecal זריקות בעכברים

כאן אנו מדגימים טכניקה להתמרה עצבית נרחבת על ידי הזרקה תוך-חדרית של נגיף הקשור לאדנו למוח העכבר היילוד.  שיטה זו מספקת דרך מהירה וקלה להשיג ביטוי לכל החיים של טרנסגנים המועברים באופן ויראלי.

הזרקת נגיפי Intracerebroventricular של ילודים עכבר המוח לתמרה עצבית מתמשכת ונרחבת

מודלים של בעלי חיים למחלות ילדים יכולים לחוות התפרצות מוקדמת והתקדמות מחלה אגרסיבית. מבחינה קלינית משלוח טיפול רלוונטי למודלים של עכברים צעירים יכול להיות קשה מבחינה טכנית. פרוטוקול זה מתאר שיטת הזרקה תוך ורידית לא פולשנית לעכברים שזה עתה נולדו בתוך שני הימים לאחר הלידה הראשונה של חיים.

זריקות תוך ורידים בעכברים בילוד

אנו מתארים פרוטוקול של ניתוח stereotaxic עם מכשיר ביתי הראש-קבוע עבור ריאגנטים microinjecting לתוך סטריאטום של מוח העכבר neonatal. טכניקה זו מאפשרת מניפולציה גנטית ב תאים עצביים של אזורים ספציפיים של מוח העכבר neonatal.

ניתוח stereotaxic מניפולציה גנטית בתאים Striatal של מוח העכבר Neonatal

בפרוטוקול זה אנו מתארים כיצד להזריק לעכבר את חלל מי השפיר ב-E7.5 עם לנטי-וירוס, מה שמוביל להתמרה אחידה של כל הצלחת העצבית, עם השפעה מזיקה מינימלית על ההישרדות או ההתפתחות העוברית.

מיקוד צלחת עצבית מורין על ידי ננו-הזרקת רחם (NEPTUNE) ביום עוברי 7.5

מתואר הליך כירורגי לביצוע זריקות לתוך בור המים המותני של החולדה הצעירה. גישה זו שימשה להעברה תוך-תאית של וקטורים של ריפוי גנטי, אך צפוי כי גישה זו תוכל לשמש למגוון טיפולים, כולל תאים ותרופות.

משלוח וקטורי תוך-תאי בחולדות צעירות באמצעות הזרקת בור מים מותני

זריקה תוך-מותנית מייצגת דרך מתן רלוונטית לתרגום למתן טיפול גנטי למערכת העצבים המרכזית. פרוטוקול סטנדרטי מקיף זה לזריקות תוך-מותניות בעכברים וחולדות בילודים, צעירים ובוגרים נועד להנחות חוקרים באימוץ טכניקה זו למחקרי ריפוי גנטי פרה-קליניים.

הזרקה תוך-מותנית של וקטורים של ריפוי גנטי למיקוד מערכת העצבים המרכזית בעכברים וחולדות

למד את פרוטוקול ההזרקה התוך-תטית בעכברים שזה עתה נולדו לעריכת גנום ואספקת תרופות למערכת העצבים המרכזית. שיטה זו מאפשרת מסירה יעילה ובטוחה יותר מזריקות תוך-חדריות מסורתיות.

הזרקה תוך-תטית של עכבר שזה עתה נולד לצורך עריכת גנום ואספקת תרופות

גלה סרטונים נוספים