Name: טכניקת פולי-טרנספקציה הפוכה אופטימלית מבוססת תאי גזע עובריים של עכבר לחקירה מהירה של יחסי חומצות גרעין (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 4 s
Description: למד שיטת פולי-טרנספקציה הפוכה לתאי גזע עובריים של עכבר בתרבית 2i ו-LIF. שיטה זו משפרת הישרדות תאים ויעילות שיבוץ גנים לחקירת מניפולציות גנטיות בסיסיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות על התרומות הרבות לתחום שלא צוינו בעבודה זו בשל מגבלות מקום, כמו גם על סוכנויות המימון שסיפקו הזדמנות זו. המחברים מודים על מימון ממועצת המחקר למדעי הטבע וההנדסה של קנדה (NSERC) ומהמכונים הקנדיים לחקר הבריאות (CIHR), שתמכו בעבודה זו. ק.מ. זכה במלגת CGS-M מטעם NSERC ובמלגת קילאם לדוקטורט מאוניברסיטת קולומביה הבריטית. נ.ס. זכה בפרס Michael Smith Health Research BC Scholar Award.

1. הכנת ריאגנטים לתרבית mPSC
<ol><li>הכינו תוסף N2.<ol><li>בתנאים לא סטריליים, הכינו את תמיסות המלאי הבאות (שלב 1.1.1.1) במכסה אדים בטיחותי כימי. מוסיפים את האבקה המוצקה של כל כימיקל לצינור חרוטי במשקל 50 מ"ל במשקל מראש. שקלו כל צינורית לאחר הוספת האבקה והוסיפו כמות מתאימה של ממס כדי להשיג את הריכוזים הבאים. עבור אצווה אחת של מדיה, הכן את הסכום המינימלי הרשום. הערה: הריאגנטים הבאים מסוכנים ויש לטפל בהם בהתאם להנחיות בטיחות כימיות מקומיות. ודא PPE תקין בעת הטיפול, ועבוד רק עם צורות האבקה המוצקה של כימיקלים אלה במכסה אדים כימי כדי למנוע שאיפה.<ol><li>מינימום של 0.05 מ"ל נתרן סלניט במים ב 0.518 מ"ג / מ"ל, 0.5 מ"ל של putrescine במים ב 160 מ"ג / מ"ל, 0.165 מ"ל של פרוגסטרון ב 100% אתנול ב 0.6 מ"ג / מ"ל (ראה טבלה של חומרים).</li>
			<li>אחסן פתרונות בטמפרטורה של -20°C למשך עד שנתיים.</li>
		</ol></li>
		<li>בארון בטיחות ביולוגית (BSC), הוסף את הפרטים הבאים ל- 58.035 מ"ל של DMEM-F12.<ol><li>0.05 מ"ל של תמיסת נתרן סלניט 0.518 מ"ג/מ"ל, 0.5 מ"ל של תמיסת פוטרסין 160 מ"ג/מ"ל, 0.165 מ"ל של תמיסת פרוגסטרון 0.6 מ"ג/מ"ל.</li>
			<li>סנן לעקר את התערובת לעיל עם מסנן 0.22 מיקרומטר.</li>
		</ol></li>
		<li>עדיין BSC, להכין פתרון 100 מ"ג / מ"ל של apotransferrin.<ol><li>הוסף 5 מ"ל של DMEM-F12 ל 500 מ"ג של apotransferrin (ראה טבלה של חומרים). לאט resuspend ולשטוף את המיכל, הימנעות בועות.</li>
			<li>לאחר השעיה מחדש והסרה ככל האפשר עם 5 מ"ל, להוסיף אותו לתמיסת סלניט / פוטרסין / פרוגסטרון. קח יותר של הפתרון הקודם לשטוף את בקבוק apotransferrin, מקבל כמה שיותר ממנו החוצה.</li>
		</ol></li>
		<li>הוסף 5 מ"ל של 7.5% BSA חלק V (ראה טבלת חומרים) לתמיסה.</li>
		<li>מערבבים ו aliquot 6.875 מ"ל לכל צינור. אחסן aliquots ב -80 ° C למשך עד 1 שנה.</li>
		<li>בעת שימוש ב- aliquots N2 לעיל לייצור מדיה N2B27, להפשיר את aliquot הרצוי ולהוסיף 3.125 מ"ל של תמיסת אינסולין 4 מ"ג / מ"ל (ראה טבלה של חומרים) ל 6.875 N2 עבור 10 מ"ל של 100x N2.</li>
	</ol></li>
	<li>הכן מדיה בסיסית N2B27.<ol><li>הפשירו תוספי N2 ו-B27 במקרר בטמפרטורה של 4°C למשך מספר שעות או למשך הלילה.</li>
		<li>ב-BSC, יש לערבב 484.5 מ"ל של DMEM-F12 ו-484.5 מ"ל של מדיה נוירובזאלית (ראו טבלת חומרים) בבקבוק סטרילי של 1 ליטר.</li>
		<li>הוסף 10 מ"ל של B27 ו 10 מ"ל של תוספת N2 למדיה.</li>
		<li>הוסף 1 מ"ל של 55 מ"מ בטא-מרקפטואתנול (ראה טבלת חומרים). הוסף 10 מ"ל של 100x glutamax. מערבבים במרץ על ידי ערבול הבקבוק.</li>
		<li>Aliquot את הנפח הרצוי לכל aliquot (בדרך כלל 100 מ"ל) ולאחסן ב -80 ° C עד 1 שנה. יש לאחסן בשימוש לאחר ההפשרה בטמפרטורה של 4°C למשך עד 3 שבועות.</li>
	</ol></li>
	<li>הכן מדיה NBiL.<ol><li>הפשירו אליציטוט של 100 מ"ל של מדיה בזאלית N2B27 מ -80 °C במקרר 4 °C.</li>
		<li>ב-BSC, הוסיפו LIF (ראו טבלת חומרים) לריכוז סופי של 10 מיקרוגרם/ליטר.</li>
		<li>הוסף CHIR99021 (3 מיקרומטר סופי) ו- PD0325901 (1 מיקרומטר סופי) (ראה טבלת חומרים). מערבבים היטב עם פיפטה סרולוגית 50 מ"ל. יש לאחסן ב-4°C למשך עד שבועיים.</li>
	</ol></li>
	<li>הכינו תמיסת ג'לטין 0.2%.<ol><li>מעבירים 500 מ"ל של H2O מזוקק כפול לבקבוק זכוכית 1 ליטר.</li>
		<li>מדדו 1 גרם ג'לטין (ראו טבלת חומרים) והוסיפו אותו למים. מערבבים על ידי ניעור הבקבוק עד שהוא מומס ברובו.</li>
		<li>Autoclave תערובת ג'לטין ומים ב 15 psi, 121 ° C במשך 35 דקות. לאחר הקירור, סנן לעקר אותו עם מסנן 0.22 מיקרומטר ב BSC. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C.</li>
	</ol></li>
	<li>הכינו את אמצעי הכביסה.<ol><li>ב-BSC, יש לערבב 160 μL של 7.5% BSA לכל 10 מ"ל של DMEM-F12.</li>
		<li>הרחב את האמור לעיל והתכונן בכמויות גדולות לשימוש עתידי קל (למשל 8 מ"ל של 7.5% BSA עד 500 מ"ל של DMEM-F12). יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C.</li>
	</ol></li>
</ol>2. הכנת ריאגנטים לפולי-טרנספקציה mPSC
הערה: הערכים הבאים מסופקים עבור באר אחת של צלחת 24 בארות. ניתן לשנות את קנה המידה של ערכים בהתאם. הרצפים של כל הדנ"א/פלסמידים מפורטים בקובץ משלים 1.
<ol><li>חשב את נפח תמיסת ה- DNA הדרושה לכל טיפול.<ol><li>הכינו 500 ננוגרם של דנ"א לכל באר/מצב.<ol><li>אם מדביקים פלסמיד יחיד בתמיסת DNA של 100 ננוגרם/μL, הכינו צינור אחד עם 5 מיקרוליטר DNA.</li>
			<li>אם אתם מדביקים שני פלסמידים ב-100 ננוגרם/מיקרוליטר כל אחד, הכינו שני צינורות עם 2.5 מיקרוליטר בכל אחד, אחד לכל פלסמיד.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>ב- BSC, בצע את הפעולות הבאות: עבור כל טיפול טרנספקציה של 500 ng (ראה טבלת חומרים), aliquot 25 μL של OptiMEM לתוך צינור 1.5 מ"ל.<ol><li>קנה מידה זה בהתאם - לדוגמה לעיל, הכן שני צינורות, כל אחד עם 250 ng של DNA (2.5 μL) ו 12.5 μL של OptiMEM.</li>
	</ol></li>
	<li>הוסף את נפח הדנ"א הדרוש לטיפול זה ל-OptiMEM שבצינור.</li>
	<li>עבור כל צינור עם 500 ng DNA ו-OptiMEM, צור צינור תואם עם עוד 25 μL של OptiMEM ו-1 μL של מגיב טרנספקציה קטיוני מבוסס שומנים.<ol><li>שוב, יש לשנות את קנה המידה של ערכים אלה בהתאם. עבור הדוגמה לעיל, להכין שני צינורות, כל אחד עם 12.5 μL של OptiMEM ו 0.5 μL של מגיב transfection. הערה: בעת שינוי קנה מידה של ערכים, השתמש במסת הדנ"א שנוספה ולא בנפח הדרוש לכמות זו של DNA. תגובות עם מגיב טרנספקציה ודנ"א ניתנות לשינוי קנה מידה (למשל, אם 5 בארות אמורות להיות נגועות באותו דנ"א). שמור על יחסי ריאגנטים זהים, אך קנה מידה בהתאם (לדוגמה, 1000 ng DNA: 50 μL OptiMEM: 2 μL מגיב טרנספקציה: 50 μL OptiMEM).</li>
	</ol></li>
</ol>3. הכנת mPSCs עבור transfection
הערה: עבור טרנספקציה הפוכה, הכן את כלי התרבית והעבר את mPSCs ישירות לפני הוספת ריאגנטים transfection. עבור טרנספקציה קדימה, מעבר צלחת את התאים 12-18 שעות לפני transfection כדי לאפשר לתאים להיצמד לצלחת.
<ol><li>הכינו כלי תרבית תאים מצופה ג'לטין 0.2%.<ol><li>תכננו את מספר הבארות הדרושות לטרנספקציה (באר אחת מתוך צלחת של 24 בארות לכל טיפול/קבוצה).</li>
		<li>הוסף 200 μL של תמיסת ג'לטין 0.2% לכל אחת מהבארות הרצויות בצלחת 24 הקידוחים.</li>
		<li>נערו בעדינות את הצלחת כדי לפזר את התמיסה באופן שווה, וודאו שהיא מכסה את כל תחתית הבאר.</li>
		<li>אפשר לצפות את הבארות לפחות 15 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>בעזרת שואב ואקום, הסר בזהירות את שאריות הג'לטין מהבארות (הטה את הצלחת כדי להבטיח הסרת כל הנוזלים מבלי לגרד את שכבת הג'לטין).</li>
		<li>הוסיפו 0.5 מ"ל של מדיה NBiL (שלב 1.3) לכל באר והשאירו את הצלחת באינקובטור תרבית רקמות לחימום מוקדם.</li>
	</ol></li>
	<li>מעבר mPSCs.<ol><li>Aliquot 30 מ"ל של מדיה לשטוף (שלב 1.5) לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל.</li>
		<li>שאפו את המדיה הישנה מצלחת תרבית הרקמה של mESCs. הערה: מספר טכניקות שאיפה מותרות. לא משנה באיזו טכניקה נבחרת, ודא שהתאים אינם נשארים יבשים לפרקי זמן ממושכים (כ -30 שניות לכל היותר).</li>
		<li>הוסף את הכמות הנדרשת של אמצעי ניתוק תאים זמין מסחרית (1.5 מ"ל עבור צלחת של 10 ס"מ, קנה מידה בהתאם, ראה טבלת חומרים).</li>
		<li>המתינו 3-5 דקות לפני שתעלו וירדו 15-20 פעמים עם פיפטה P1000 כדי לקבל מתלה חד-תאי. הצג תאים תחת מיקרוסקופ כדי להבטיח השעיה של תא יחיד.</li>
		<li>מעבירים את התאים בתווך הניתוק לצינור 50 מ"ל המכיל אמצעי שטיפה.</li>
		<li>צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. יש לשאוף לשטיפת מדיה, כדי להבטיח שלא יישארו שאריות נוזל בצינור.</li>
		<li>השהה מחדש את הגלולה בנפח קטן של אמצעי כביסה (~ 300 μL). ספור את תרחיף התא באמצעות המוציטומטר כדי לקבל את צפיפות התא.</li>
	</ol></li>
</ol>4. טרנספקציה הפוכה של mPSCs
<ol><li>הכן ריאגנטים poly-transfection על פי שלב 2.</li>
	<li>הכינו את כלי תרבית התאים והעבירו קליפות קדם-גזעיות (mPSC) לפי שלב 3.</li>
	<li>Aliquot 200 μL של מדיה NBiL לצינורות 1.5 מ"ל, אחד לכל טיפול.</li>
	<li>הוסף 26 μL של תערובת מגיב OptiMEM:transfection לתערובת DNA:OptiMEM. מערבבים את הריאגנטים במהירות ובמרץ על ידי פיפטינג כ-10 פעמים. תנו לתערובת לדגור בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.</li>
	<li>בהתבסס על צפיפות התא, העבר את נפח התאים הנדרש מתרחיף התאים של 300 μL לצינורות NBiL של 200 μL כדי לקבל 25,000 תאים לכל צינור.</li>
	<li>לאחר 5 דקות של דגירה של Lipofectamine 2000 (L2K, מגיב transfection) ותערובת DNA, להוסיף אותו צינור 1.5 מ"ל של תאים ולערבב היטב על ידי pipetting. אפשר לתאים לדגור עם מגיב במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. פיפטה החוצה את הנוזל, משאיר כ 50 μL.</li>
	<li>להשעות מחדש את גלולת התא עם 100 μL של מדיה NBiL. מעבירים את התאים לצלחת ומניחים את הצלחת באינקובטור. שנה את המדיה 24 שעות מאוחר יותר עם מדיה NBiL טרייה.</li>
</ol>5. העברה קדימה של mPSCs
<ol><li>12-18 שעות לפני הטרנספקציה, הכינו את כלי תרבית התאים ועברו mPSCs לפי שלב 3.</li>
	<li>בהתבסס על צפיפות התא, להעביר את נפח התאים הנדרש מתערובת תאים 300 μL לזרע 25,000 תאים לכל באר. מניחים את הצלחת באינקובטור.</li>
	<li>1 שעה לפני transfection, לשאוף את התקשורת מכל הבארות ולהחליף אותו עם 0.5 מ"ל של מדיה NBiL. מניחים את הצלחת באינקובטור.</li>
	<li>בזמן הטרנספקציה, הכינו ריאגנטים פולי-טרנספקציה mPSC לפי שלב 2.</li>
	<li>הוסף 26 μL של תערובת מגיב OptiMEM:transfection לתערובת DNA:OptiMEM. מערבבים את הריאגנטים במהירות ובמרץ על ידי פיפטינג כ-10 פעמים. תנו לתערובת המשולבת לדגור בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.</li>
	<li>מוסיפים את התערובת המשולבת לבארות טיפתית. מניחים את הצלחת באינקובטור. שנה את המדיה 24 שעות מאוחר יותר.</li>
</ol>6. ציטומטריית זרימה
<ol><li>לשאוף את התקשורת מן צלחת 24-באר transfected 48 שעות לאחר transfection.</li>
	<li>הוסיפו 200 מיקרוליטר טריפסין לכל באר, ערבלו ודגרו במשך 30 שניות ב-37°C. הקש על דפנות הצלחת והוסף 200 μL של מאגר FACS קר כקרח (2% FBS ב- PBS).</li>
	<li>פתח ותייג צלחת V תחתונה של 96 בארות, החל מ- A1. ערבבו את התוכן של כל באר על הצלחת הנגועה כדי לעקור תאים וליצור תמיסות חד-תאיות עם פיפטה P200. מעבירים 200 μL מכל באר לבאר המתאימה על צלחת 96 בארות.</li>
	<li>הוסף 15 מ"ל של מאגר FACS למאגר מגיבים של 50 מ"ל. צנטריפוגה את הצלחת ב 300 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. השליכו את הסופרנאטנט על ידי היפוך צלחת 96 הבארות לתוך הכיור בתנועה מהירה וחלקה.</li>
	<li>השתמש פיפטה רב ערוצית כדי להשעות מחדש את הכדוריות על צלחת 96 באר ב 150 μL של חיץ FACS מן המאגר מגיב. חזור על שלבים 6.4-6.5 פעמיים. הניחו את הצלחת בת 96 הבארות בקופסה מלאה בקרח המוגנת מפני אור.</li>
	<li>הפעל את הדגימות דרך ציטומטר זרימה כדי לקבל את התפלגות האוכלוסייה של כתבי הפלואורסצנט.<ol><li>ודא שהציטומטר מתאים מבחינת שילובי לייזר ומסנן לביצוע הניסוי (למשל, אל תשתמש בכתב אינפרא אדום אם לא ניתן לעורר או לזהות בספקטרום האדום הרחוק).</li>
		<li>כלול דוגמאות נוספות לחרוזי תקינה כדי לאפשר המרת נתונים באמצעות MEFL במהלך הניתוח. ודא כי מספיק תאים נאספים לכל מדגם לניתוח סטטיסטי מתאים9.</li>
	</ol></li>
	<li>המר יחידות פלואורסצנטיות מקבצי הציטומטר הגולמי ונתח את הנתונים באמצעות כל אחת מכמה שיטות, כגון צינורות מבוססי Python או MATLAB או תוכנה זמינה מסחרית 9,13.</li>
</ol>

ניתוח השוואתי של שיטות העברה קדימה ואחורה על mPSCs

<ol><li>Shakiba, N., Jones, R. D., Weiss, R., Del Vecchio, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Context-aware+synthetic+biology+by+controller+design%3A+Engineering+the+mammalian+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Systems%22%5BJournal%5D)">Context-aware synthetic biology by controller design: Engineering the mammalian cell.</a> Cell Systems. 12 (6), 561-592 (2021).</li>
<li>Fus-Kujawa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+methods+and+tools+for+transfection+of+eukaryotic+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">An overview of methods and tools for transfection of eukaryotic cells in vitro.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, (2021).</li>
<li>FAU, K. T. K., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+cell+transfection%3A+the+present+and+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mammalian cell transfection: the present and the future.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).</li>
<li>Tamm, C., Galitó, S. P., Annerén, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+of+protocols+for+mouse+embryonic+stem+cell+culturing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A comparative study of protocols for mouse embryonic stem cell culturing.</a> PLoS One. 8 (12), 81156(2013).</li>
<li>Morgani, S., Nichols, J., Hadjantonakis, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+many+faces+of+pluripotency%3A+in+vitro+adaptations+of+a+continuum+of+in+vivo+states%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The many faces of pluripotency: in vitro adaptations of a continuum of in vivo states.</a> BMC Developmental Biology. 17 (1), (2017).</li>
<li>Mulas, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defined+conditions+for+propagation+and+manipulation+of+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Defined conditions for propagation and manipulation of mouse embryonic stem cells.</a> Development. 146 (6), Cambridge, England. 173146(2019).</li>
<li>Tamm, C., Kadekar, S., Pijuan-Galitó, S., Annerén, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+efficient+transfection+of+mouse+embryonic+stem+cells+using+non-viral+reagents%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Fast and efficient transfection of mouse embryonic stem cells using non-viral reagents.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 12 (5), 584-591 (2016).</li>
<li>Chong, Z. X., Yeap, S. K., Ho, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+types%2C+methods+and+strategies%3A+A+technical+review%5BTitle%5D)+AND+%22PeerJ%22%5BJournal%5D)">Transfection types, methods and strategies: A technical review.</a> PeerJ. 9, 11165(2021).</li>
<li>Gam, J. J., DiAndreth, B., Jones, R. D., Huh, J., Weiss, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+%26%2334%3Bpoly-transfection%26%2334%3B+method+for+rapid%2C+one-pot+characterization+and+optimization+of+genetic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A &#34;poly-transfection&#34; method for rapid, one-pot characterization and optimization of genetic systems.</a> Nucleic Acids Research. 47 (18), 106(2019).</li>
<li>Jones, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+endoribonuclease-based+feedforward+controller+for+decoupling+resource-limited+genetic+modules+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">An endoribonuclease-based feedforward controller for decoupling resource-limited genetic modules in mammalian cells.</a> Nature Communications. 11 (1), 5690(2020).</li>
<li>Wauford, N., Jones, R., Van De Mark, C., Weiss, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+development+of+cell+state+identification+circuits+with+poly-transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Rapid development of cell state identification circuits with poly-transfection.</a> Journal of Visualized Experiments. (192), e64793(2023).</li>
<li>Hori, Y., Kantak, C., Murray, R. M., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+extract+based+optimization+of+biomolecular+circuits+with+droplet+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Cell-free extract based optimization of biomolecular circuits with droplet microfluidics.</a> Lab on a Chip. 17 (18), 3037-3042 (2017).</li>
<li>Teague, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoflow%3A+A+python+toolbox+for+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Cytoflow: A python toolbox for flow cytometry.</a> bioRxiv. , (2023).</li>
<li>Qin, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+comparison+of+constitutive+promoters+and+the+doxycycline-inducible+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Systematic comparison of constitutive promoters and the doxycycline-inducible promoter.</a> PLoS One. 5 (5), 0010611(2010).</li>
</ol>

המחברים אינם מדווחים על ניגודי עניינים.

סיבה מרכזית לאימוץ הנרחב של פרוטוקולי טרנספקציה היא יכולת השחזור והנגישות שלהם; עם זאת, פרוטוקולים אלה דורשים אופטימיזציה על פני הקשרים ניסיוניים. לא הוזכרה לעיל הבדיקה הסטנדרטית הנדרשת כאשר מנסים לבצע טרנספורמציה של קו תאים חדש בפעם הראשונה. ראשית, הבחירה בריאגנטים טרנספקציה היא המפתח, מכיוון שריאגנטים הזמינים מסחרית אינם מתאימים לכולם והם ישתנו ביעילות של כדאיות אספקת NA בין סוגי תאים. בנוסף, מציאת הכמות האידיאלית של NA ומגיב טרנספקציה, כמו גם היחס האופטימלי ביניהם, דורשת בדיקה. לעתים קרובות, ביצוע צעדי אופטימיזציה המו...

העברת דנ"א ורנ"א לתאי יונקים משמשת עמוד תווך מרכזי במחקר הביו-רפואי1. שיטה נפוצה להחדרת חומצות גרעין אקסוגניות (NA) לתאי יונקים היא באמצעות טרנספקציה חולפת 2,3. טכניקה זו מסתמכת על ערבוב NA עם ריאגנטים טרנספקציה זמינים מסחרית המסוגלים להעביר אותם לתוך התאים המקבלים. בדרך כלל, NA מועבר באמצעות טרנספקציה קדמית, שבה תאים הנצמדים למשטח דו-ממדי מקבלים את קומפלקס הטרנספקציה. בעוד שטרנספקציה קדימה עבור קווי התאים המבוססים הנפוצים ביותר היא חזקה והפרוטוקולים מפורסמים היטב, סוגי תאים נישתיים יותר עם מורפולוגיות לא חד-שכבתיות אינם עוברים בקלות, ומגבילים את כמות ה-NA שניתן להעביר ואת מספר התאים שמקבלים אותה.
תאי גזע פלוריפוטנטיים (PSC) משמשים מודל אטרקטיבי להבנת ההתפתחות וככלי לרפואה רגנרטיבית, בהתחשב ביכולתם להתחלק ללא הגבלת זמן ולייצר כל סוג של תא גוף. עבור PSCs של עכברים (mPSCs), תנאי תרבית חוץ גופית שגרתיים עם 2 מעכבים ו-LIF (2i/LIF) שומרים על מורפולוגיה דמוית מושבה דמוית כיפה, ומגבילים ישירות את מספר התאים החשופים להתמרה קדמית 4,5,6. כדי לטפל בכך, ניתן לבצע טרנספקציה הפוכה: תאים מתווספים לצלחת המכילה מדיה ומגיב טרנספקציה, במקום להוסיף מגיב טרנספקציה לתאים דבקים7. בעוד שזה מגדיל את מספר התאים שנחשפו למגיב, זה גם דורש את התאים לעבור ולהדביק בו זמנית.
מעבר לטרנספקציות פשוטות של אנ-איי יחיד, חוקרים שואפים לעתים קרובות להעביר מספר מבנים של אנ-איי לאוכלוסיית תאים במבחנה. זה מושג בדרך כלל באמצעות טרנספקציה משותפת, שבה NAs מעורבבים ביחס נתון (1:1, 9:1, וכו ') ולאחר מכן משולבים עם מגיב transfection שנבחר8. זה מניב תערובת של NAs וריאגנט המשמר את היחס המקורי של NAs זה לזה - בעוד תאים בטיפול עשויים לקבל כמויות שונות של תערובת זו, כולם מקבלים את אותו יחס9. אמנם זה יתרון כאשר היחס הרצוי של חלקים ידוע, קביעת יחס זה מראש יכול להיות עבודה אינטנסיבית, כאשר כל יחס מהווה תנאי אחר. חלופה אחת היא לבצע "פולי-טרנספקציה", שבה NAs בודדים מעורבבים עם מגיב הטרנספקציה בנפרד זה מזה9. על ידי שילוב קומפלקסים של טרנספקציה המכילים NAs בודדים (במקום שילוב NAs לפני יצירת המכלולים), חוקרים יכולים לחקור מגוון רחב של סטויכיומטריה של NA בניסוי טרנספקציה יחיד9. זה חשוב במיוחד במקרים שבהם המוצרים של מספר NAs צפויים לקיים אינטראקציה זה עם זה, כגון עם מערכות שעתוק אינדוקטיבי או מערכות עם משוב מובנה 1,10,11. עם זאת, כדי לעשות זאת ביעילות, נדרשת יעילות העברה גבוהה. ואכן, ככל שמספר ה-NAs הייחודיים הנגועים גדל, ההסתברות שתא נתון יקבל את כל ה-NAs הרצויים פוחתת באופן אקספוננציאלי 9,12.
הדו"ח הבא מתאר פרוטוקול טרנספקציה הפוכה עבור mPSCs באמצעות מגיב טרנספקציה קטיוני מבוסס שומנים, שבו תאים נחשפים לתערובת מגיב-NA למשך 5 דקות לכל היותר כדי למקסם את הכדאיות ולמזער את הזמן מחוץ לתנאי תרבית טיפוסיים. השוואת פרוטוקול זה לטרנספקציה הקדמית הסטנדרטית של תאים אלה מדגימה יעילות טרנספקציה גבוהה יותר ועלייה במספר הכולל של תאים נגועים ששרדו. על ידי שילוב של טרנספקציה הפוכה זו עם פולי-טרנספקציה תלת-פלסמידית הכוללת כתבים פלואורסצנטיים פשוטים, מודגם פוטנציאל מורחב לסינון יחסי NA עם יעילות טרנספקציה גבוהה.

<table><tbody><tr><td>אקוטאז&nbsp;</td><td>MilliporeSigma</td><td>SCR005</td><td></td></tr><tr><td>אפוטנספרין&nbsp;</td><td>תוסף תזונה MilliporeSigma</td><td>T1147-500MG</td><td></td></tr><tr><td>B27&nbsp;</td><td>תרמו-פישר סיינטיפיק&nbsp;</td><td></td><td></td>17504044</tr><tr><td>בטא-מרקפטואתנול</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>21985023</tr><tr><td>שבר BSA V (7.5%)</td><td>Gibco</td><td>15260-037</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021&nbsp;</td><td>MilliporeSigma</td><td>SML1046-25MG</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>MilliporeSigma</td><td>D6421-24X500ML</td><td></td></tr><tr><td>חרוזי סטנדרטיזציה של ציטומטריית זרימה</td><td>Spherotech</td><td>URCP-38-2K</td><td></td></tr><tr><td>ג'לטין&nbsp;</td><td>תוסף MilliporeSigma</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX&nbsp;</td><td>תרמו-פישר סיינטיפיק&nbsp;</td><td></td><td></td>35050061</tr><tr><td>אינסולין&nbsp;</td><td>גיבקו</td><td>12585-0014</td><td></td></tr><tr><td>ליפופקטמין 2000&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td>מגיב טרנספקציה</td></tr><tr><td>מדיה נוירובזאלית</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>21103049</tr><tr><td>OptiMEM&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>PD0325901&nbsp;</td><td>MilliporeSigma</td><td>PZ0162-25MG</td><td></td></tr><tr><td>פרוגסטרון</td><td>MilliporeSigma</td><td>P8783</td><td>סכנה כימית - התייעץ עם הנחיות הבטיחות המקומיות, ודא שציוד הגנה אישי מתאים נלבש, ועבוד עם צורת האבקה המוצקה רק במכסה אדים כימי</td></tr><tr><td>Putrescine</td><td>MilliporeSigma</td><td>P6780</td><td>סכנה כימית - התייעץ עם הנחיות הבטיחות המקומיות, ודא שציוד הגנה אישי מתאים נלבש ועבוד עם צורת האבקה המוצקה רק במכסה אדים</td></tr> <tr><td>כימיmLIF רקומביננטי&nbsp;</td><td>BioTechne</td><td>8878-LF-500/CF</td><td></td></tr><tr><td>נתרן סלניט&nbsp;</td><td>MilliporeSigma</td><td>S5261-25G</td><td>סכנה כימית - התייעץ עם הנחיות הבטיחות המקומיות, ודא שציוד הגנה אישי מתאים נלבש, ועבוד עם צורת האבקה המוצקה רק במנדף אדים כימי</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>25200056</tr></tbody></table>

טכניקת פולי-טרנספקציה הפוכה אופטימלית מבוססת תאי גזע עובריים של עכבר לחקירה מהירה של יחסי חומצות גרעין

An Optimized Mouse Embryonic Stem Cell Based Reverse Poly-Transfection Technique for Rapid Exploration of Nucleic Acid Ratios

בשל פשטותו היחסית וקלות השימוש בו, טרנספקציה חולפת של קווי תאי יונקים עם חומצות גרעין הפכה לעמוד התווך במחקר הביו-רפואי. בעוד שלרוב קווי התאים הנפוצים ביותר יש פרוטוקולים חזקים לטרנספקציה בתרבית דו-ממדית דבקה, פרוטוקולים אלה לעתים קרובות אינם מתורגמים היטב לקווים פחות נחקרים או לאלה עם מורפולוגיות לא טיפוסיות וקשות להעברה. באמצעות שימוש בתאי גזע פלוריפוטנטיים של עכברים הגדלים במדיה 2i/LIF, מודל תרבית נפוץ לרפואה רגנרטיבית, שיטה זו מתווה פרוטוקול אופטימלי ומהיר של טרנספקציה הפוכה המסוגל להשיג יעילות טרנספקציה גבוהה יותר. תוך מינוף פרוטוקול זה, מבוצעת פולי-טרנספקציה של שלושה פלסמידים, תוך ניצול היעילות הגבוהה מהרגיל במסירת פלסמיד כדי לחקור טווח מורחב של סטויכיומטריית פלסמיד. פרוטוקול פולי-טרנספקציה הפוך זה מאפשר שיטה ניסיונית של סיר אחד, המאפשר למשתמשים למטב את יחסי הפלסמיד בבאר אחת, במקום על פני מספר טרנספקציות משותפות. על ידי הקלת החקירה המהירה של ההשפעה של סטויכיומטריית DNA על התפקוד הכולל של מעגלים גנטיים מועברים, פרוטוקול זה ממזער את הזמן והעלות של טרנספקציה של תאי גזע עובריים.

הן טרנספקציות קדימה והן טרנספקציה לאחור מסתמכות על האינטראקציה בין קרום התא לבין קומפלקסים של מגיב-דנ"א טרנספקציה נכנסים, המאפשרים העברה של NA לתאים המקבלים. ההבדל בין טכניקות אלה הוא מצב התא בעת הלידה - בעוד שהדנ"א מועבר בדרך כלל לחד-שכבות של תאים דבקים בטרנספקציה קדמית מסורתית, טרנספקציה הפוכה מסתמכת במקום זאת על כך שקומפלקס הדנ"א מגיב יפגוש את התאים בזמן השעיה של תא יחיד. הבדל זה יכול להיות מכריע במיוחד במצבים שבהם תאים אינם גדלים כחד-שכבה אחידה ושטוחה ובמקום זאת מאמצים מורפולוגיה בעלת כיפה או מושבה יותר, כמו במקרה של...

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה לפולי-טרנספקציה הפוכה של תאי גזע עובריים של עכברים במהלך תרבית עם מדיה 2i ו-LIF. שיטה זו מניבה כדאיות ויעילות גבוהות יותר מאשר פרוטוקולי העברה קדימה מסורתיים, תוך שהיא מאפשרת גם אופטימיזציה של יחסי פלסמיד בסיר אחד.

Due to its relative simplicity and ease of use, transient transfection of mammalian cell lines with nucleic acids has become a mainstay in biomedical ...

עבודתנו מתמקדת בדרך כלל בשימוש במכשירים גנטיים סינתטיים כדי להשפיע על גורלם והתנהגותם של תאי גזע. על ידי שליטה במצבים תאיים, אנו שואפים לקדם את הפיתוח של הדור הבא של טיפולים תאיים. לאחרונה התבססה הבנה עמוקה יותר של הקשר בין מינון הגן הקובע את הגורל לבין שושלת התא.זה הקל על ידי פיתוח של בקרים גנטיים המסוגלים titrate גן נתון במדויק. טכניקות ביולוגיה מולקולרית קלאסיות כגון טרנספקציה או טרנסדוקציה לנטי-ויראלית עבור גן פשוט על פני ביטוי תמיד יהיו עמוד התווך. עם זאת, התחום שלנו אימץ לאחרונה התקנים סינתטיים המשלבים משוב ליניארי ולא ליניארי על מנת לקבל פלטים מורכבים יותר מדנ"א שנמסר.למינון הגנים יש תפקיד מפתח בקביעת התוצאה של ביטוי גנים. כאשר מספקים גנים אקסוגניים מרובים, גורם ניסויי מרכזי הוא כמה מכל גן ייתן את התוצאה האופטימלית או הרצויה. הפרוטוקול שלנו מאפשר לחוקרים לסרוק במהירות מינונים שונים בטיפול יחיד, בחיפוש אחר היחס הרצוי של מכשירי DNA.

an-optimized-mouse-embryonic-stem-cell-based-reverse-poly

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

העברת גן שיטה למוח עכבר בפיתוח מתואר באמצעות שיטה ניתוחית ייחודית צורה מיוחדת של אלקטרודות. זו טכניקה ייחודית זו מאפשרת transfection של DNA פלסמיד temporally מרחבית, אשר יסייעו מדעני מוח רבים בחקר התפתחות המוח.

עכבר בתוך הרחם Electroporation: ג&#39;ין מבוקרת transfection Spatiotemporal

אנו מתארים assay כתב הקרינה במהירות לזהות ולאפיין את הגנים המווסתים גזע עובריים של עכברים תא תחזוקה עצמית והתחדשות.

Oct4GiP Assay כתב ללמוד גנים המווסתים גזע עובריים עכבר נייד תחזוקה עצמית והתחדשות

שליטה על ההתפשטות של תאי גזע הסומטיים היא גורם מרכזי פוגעות המחקר והשימוש בטיפול שלהם. כאן אנו מתארים מערכת באופן זמני להרחבת שליטה עצבית גזע תאים במהלך ההתפתחות ובגרות, אשר ניתן להשתמש כדי להגדיל את מספר הנוירונים שנוצרו במוח העכבר.

התרחבות של תאי גזע עצביים עובריים ומבוגרים על ידי<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation או הזרקת Stereotaxic ויראלי

שורות תאי כתב להציע אמצעים כדי להמחיש, לעקוב ובודד תאים של ריבית מאוכלוסיות הטרוגניות. עם זאת, באמצעות רקומבינציה הומולוגית קונבנציונלית בתאי גזע עובריים אנושיים מיקוד הגן הוא מאוד לא יעיל. בזאת, אנו מתארים מיקוד מוקד PITX3 CNS המוח התיכון ספציפי גורם שעתוק עם EGFP באמצעות רקומבינציה הומולוגית המשופרת nuclease אבץ האצבע.

ג&#39;ין משופר Nuclease אבץ אצבע מיקוד בתאי גזע עוברי האנושי

מטרת פרוטוקול זה היא לתאר loss- ולהשיג-של שיטת הפונקציה כי הוא ישים לזהות neogenin כמו קולטן בשלב ספציפי שמוביל trophectoderm ותא פנימי בידול המונים עוברי עכברים preimplantation.

Loss- ו-של-פונקצית רווח גישה לחקר תא מוקדם קובעי גורל preimplantation עכבר עובר

חלבונים בדרך כלל מכילים מספר תחומים שיכולים להפעיל פונקציות סלולריות שונות. ג'ין לדפוק-outs (KO) לא מחשיב מגוון תפקודי זו. כאן, אנו מדווחים חילופי קלטת בתיווך רקומבינציה (RMCE) גישת מבנה-תפקוד מבוסס בתאי גזע עוברי KO המאפשרת דיסקציה המולקולרי של תחומים או הגירסות פונקציונליים השונים של חלבון.

מחקרי מבנה-תפקוד תאי גזע עוברי עכבר שימוש recombinase בתיווך Exchange קסטה

כאן, אנו מציגים שיטה ששונתה עבור הקפאת הזמנות של עוברי תא אחד, כמו גם פרוטוקול כי זוגות השימוש של עוברים הקפאת להקפיא ואלקטרופורציה עבור הדור היעיל של עכברים מהונדסים גנטית.

השימוש של עוברים הקפאת-הפשפה לייצור יעילות גבוהה של עכברים ששונו גנטית

פרוטוקול זה מתאר את שיטת Capture Hi-C המשמשת לאפיון הארגון התלת-ממדי של אזורים גנומיים ממוקדים בגודל מגה-מבוסס ברזולוציה גבוהה, כולל גבולות של תחומים משויכים טופולוגית (TADs) ואינטראקציות כרומטין ארוכות טווח בין אלמנטים רגולטוריים ורצפי DNA אחרים.

פענוח ארגון כרומטין תלת-ממדי ברזולוציה גבוהה באמצעות לכידת Hi-C

במאמר זה אנו מתארים טכניקה פשוטה המיועדת לייצור יעיל של עכברים מהונדסים גנטית הנקראת CRISPR RNP Electroporation of Zygotes (CRISPR-EZ). שיטה זו מספקת ריאגנטים לעריכה על ידי אלקטרופורציה לעוברים ביעילות המתקרבת ל-100%. פרוטוקול זה יעיל עבור מוטציות נקודתיות, החדרות גנומיות קטנות ומחיקות בעוברי יונקים.

עריכה גנומית יעילה של עכברים על ידי CRISPR אלקטרופורציה של זיגוטים

כאן אנו מציגים פרוטוקול לפיתוח מודלים של עכברים מהונדסים גנטית באמצעות תאי גזע עובריים, במיוחד עבור דנ"א גדול (KI). פרוטוקול זה מכוונן באמצעות עריכת גנום CRISPR/Cas9, וכתוצאה מכך יעילות KI משופרת באופן משמעותי בהשוואה לשיטת מיקוד הדנ"א הליניארי ההומולוגית הקונבנציונלית בתיווך רקומבינציה.

מיקוד גנים יעיל ביותר בתיווך CRISPR/Cas9 בתאי גזע עובריים לפיתוח מודלים של עכברים שעברו מניפולציה גנטית

מעגלים גנטיים מורכבים גוזלים זמן רב כדי לתכנן, לבדוק ולמטב. כדי להקל על תהליך זה, תאי יונקים נדבקים באופן המאפשר בדיקה של סטויכיומטריה מרובים של רכיבי מעגל בבאר אחת. פרוטוקול זה מתאר את השלבים לתכנון ניסויים, טרנספקציה וניתוח נתונים.

פיתוח מהיר של מעגלי זיהוי מצב התא עם Poly-Transfection

למד שיטת פולי-טרנספקציה הפוכה לתאי גזע עובריים של עכבר בתרבית 2i ו-LIF. שיטה זו משפרת הישרדות תאים ויעילות שיבוץ גנים לחקירת מניפולציות גנטיות בסיסיות.

טכניקת פולי-טרנספקציה הפוכה אופטימלית מבוססת תאי גזע עובריים של עכבר לחקירה מהירה של יחסי חומצות גרעין

גלה סרטונים נוספים