Name: בידוד, תרבית ואפיון תאי גזע במוך השן משיני אדם נשירים וקבועים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-17T13:10:00.000+00:00
Duration: 2 min 33 s
Description: למד בידוד ותרבית תאי גזע רב-פוטנציאליים ממוך השן באמצעות עיכול אנזימטי. השיטה מאפשרת אפיון ההבדלה לאוסטאובלסטים, אדיפוציטים וכונדרוציטים ליישומים ברפואה רגנרטיבית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים אסירי תודה לד"ר מתיו מז'וואנצ'ריל, מנהל וראש מרכז המחקר פושפאגירי בטירובאלה, על תמיכתו בתיעוד ההליכים במרכז המחקר.

הפרוטוקול המתואר כאן תואם את הנחיות ועדת האתיקה המוסדית למחקר אנושי (IRB, Pushpagiri Research Center, Kerala). השימוש בשיניים שנעקרו נעשה על פי סטנדרטים אתיים כדי להבטיח את שלמותם, כבודם וזכויותיהם של המשתתפים. המשתתפים שנבחרו למחקר זה היו אנשים בריאים מתחת לגיל 30 שנזקקו לעקירת שן לצורך טיפול אורתודונטי. אלו עם עששת נרחבת או דלקת חניכיים חמורה לא נכללו במחקר. שיניים נשירות נאספו מילדים שנזקקו לעקירת שיניים שמורים. הסכמה מדעת בכתב התקבלה גם מהנבדקים המעורבים במחקר זה.
1. עקירה והובלה של שיניים
<ol><li>אוסף שיניים נשירות וקבועות<ol><li>הסבירו למשתתפים את מטרת ההליך ואת השימוש האפשרי בשיניים שנעקרו למטרות מחקר.</li>
		<li>ביצוע עקירת שיניים בהרדמה מקומית על ידי מתן חומר הרדמה בקרבת השן לעקירה. באופן ספציפי, 1.75 מ"ל של לידוקאין מעורבב עם אפינפרין (ראה טבלה של חומרים) ביחס של 1:200,000 הוזרק עבור מחקר זה. בחירת שיניים שאינן מציגות עששת חמורה או דלקת חניכיים עדיפה20,21.</li>
	</ol></li>
	<li>הובלת השיניים שנעקרו הערה: מומלץ לעבוד בתנאים אספטיים כדי למנוע זיהום. זה כולל לבישת ציוד מגן אישי, כגון כפפות ומעיל מעבדה, ועבודה בסביבה סטרילית, כגון מכסה מנוע זרימה למינרית מסוכנת ביולוגית.<ol><li>לאחר עקירת השן, שטפו אותה בתמיסת מלח סטרילית חוצצת פוספט (PBS) כדי להסיר את הדם ופסולת אחרת. בעזרת מלקחיים סטריליים ואזמל, הסירו בזהירות את שאריות הרקמה הרכה המחוברת מפני השטח של השן (איור 2A).</li>
		<li>לטבול את השן בתמיסת חיטוי, כגון אתנול 70%, במשך 10 שניות. לאחר החיטוי, שטפו את השן עם PBS סטרילי כדי לשטוף את שאריות חומר החיטוי.</li>
		<li>מניחים את השן במיכל סטרילי המכיל את אמצעי ההובלה. הערה: אמצעי ההובלה כלל את Alpha-MEM, מדיום תרבית מסחרית בתוספת אנטיביוטיקה: 100 U/mL פניצילין/סטרפטומיצין (ראה טבלת חומרים). מדיום זה סיפק חומרים מזינים חיוניים לתאים בתוך השן שנעקרה, והבטיח את הישרדותם עד לעיבוד מעבדה. האנטיביוטיקות שימשו לעיכוב צמיחת חיידקים.</li>
		<li>שמור על טמפרטורה של 4 ° C במהלך ההובלה כדי להאט את הפעילות המטבולית התאית ולעכב מוות תאי. העבירו את השן למעבדה לשלבים הבאים, כולל עיבוד ובידוד תאי הגזע של מוך השן.</li>
	</ol></li>
</ol>2. איסוף רקמת מוך השן
<ol><li>אבטחו את השן באמצעות מלקחיים דנטליים כדי להבטיח שהיא תישאר במקומה במהלך ההליך. השתמשו בדיסק יהלום כדי לחתוך את השן בידית דנטלית (ראו טבלת חומרים) שמחוברת לנוזל קירור מים (איור 2B). הערה: המטרה היא לחשוף את תא מוך השן מבלי לגרום נזק מיותר לרקמת מוך השן שבתוכו.</li>
	<li>השתמש במחפר שיניים (ראה טבלת חומרים) כדי להסיר את רקמת מוך השן. מכשיר זה מאפשר הוצאת מוך השן מבלי לגרום נזק, ובכך משמר את יכולת הקיום של תאי הגזע של מוך השן (איור 2C).</li>
	<li>מניחים את הרקמה המתקבלת על צלחת פטרי זכוכית. לשטוף את רקמת מוך השן עם מלוחים חוצץ פוספט.</li>
</ol>3. עיכול רקמת עיסת השן ובידוד תאים
<ol><li>טחינת רקמות ועיכול<ol><li>בעזרת להב כירורגי סטרילי, טחנו בזהירות את רקמת מוך השן למקטעים קטנים (איור 2D) והניחו אותה במטחנת רקמות קטנה עם PBS כדי לקבל תערובת הומוגנית דקה. תהליך זה מגדיל את שטח הפנים של הרקמה, ומקל על פעולת אנזים יעילה יותר במהלך העיכול.</li>
		<li>מעבירים את מקטעי הרקמה ההומוגנית הטחונה לתוך צינור של 15 מ"ל ומעכלים אנזימטית באמצעות תערובת של 3 מ"ג/מ"ל קולגנאז מסוג I ו-4 מ"ג/מ"ל דיספאס (ראו טבלת חומרים). אנזימים אלה הומסו בתמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS) כדי להשיג את הריכוזים הרצויים.</li>
		<li>לדגור על רקמת מוך השן בתערובת האנזימים (שלב 3.1.2) במשך כשעתיים בטמפרטורה של 37°C. לאחר הדגירה, נטרלו את האנזימים, ואספו את התאים בצנטריפוגה (שלב 3.2.1) לתרבית נוספת.</li>
	</ol></li>
	<li>צנטריפוגה ומתלים<ol><li>לאחר הדגירה, מעבירים את הרקמה המעוכלת לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל ומסתובבים ב 300 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי לגלול את התאים. שלב זה מפריד את התאים מחלקי הרקמה והאנזימים הלא מעוכלים הנותרים. יש להשליך בזהירות את התווך העל-טבעי, ולהבטיח שלא להפריע לגלולת התא בתחתית הצינור.</li>
		<li>השהה מחדש את גלולת התא במדיום תרבית טרי. מדיום זה מספק את החומרים המזינים הדרושים ואת הסביבה עבור התאים המבודדים לשרוד ולהתרבות.</li>
	</ol></li>
</ol>4. תרבית תאים
<ol><li>ציפוי ודגירה של תאים<ol><li>מעבירים בזהירות את התאים המרחפים לצלוחית תרבית בגודל 25 סמ"ר. הערה: כל החומר מעיסה אחת מועבר לצלוחית אחת של25 ס"מ 2 תרבית תאים. נפח מדיה של 5-7 מ"ל מבטיח כיסוי מספיק וזמינות תזונתית עבור התאים. ודא שאמצעי התרבית עבור DPSCs הוא מדיום הנשר המותאם (DMEM) של Dulbecco, בתוספת סרום בקר עוברי (FBS) של 10%-20% (ראה טבלת חומרים) כדי לספק גורמי גדילה נחוצים. יתר על כן, להשלים את המדיום עם 1% פניצילין/סטרפטומיצין כדי למנוע זיהום חיידקי. ודא שהתאים מפוזרים באופן שווה לאורך הבקבוק כדי לקדם צמיחה הומוגנית.</li>
		<li>לדגור את הבקבוק ב 37 ° C באטמוספירה המכילה 5% CO2.</li>
	</ol></li>
	<li>שינוי בינוני ומעקב אחר מפגש<ol><li>שנה את מדיום התרבית כל 2-3 ימים כדי לספק חומרים מזינים טריים ולהסיר פסולת מטבולית. כדי לעשות זאת, בזהירות לשאוף את המדיום הישן באמצעות פיפטה סרולוגית סטרילית ולהחליף אותו עם מדיום טרי.</li>
		<li>עקוב באופן קבוע אחר תרבית התאים תחת מיקרוסקופ כדי לעקוב אחר גדילת התאים ולבדוק אם יש סימני זיהום.</li>
		<li>המשיכו בתהליך זה עד שהתאים מגיעים למפגש של 80%-90%, הנקודה שבה התאים מכסים את רוב שטח הפנים של הבקבוק אך אינם צפופים מדי.</li>
	</ol></li>
	<li>טריפסיניזציה של תאים ומעבר או הקפאה<ol><li>ברגע שהתאים מגיעים למפגש של 80%-90%, הסירו את מדיום התרבית ושטפו את התאים במי מלח חוצצי פוספט (PBS) כדי להסיר את שאריות התווך והתאים שאינם דבקים.</li>
		<li>הוסף תמיסה של 0.25% טריפסין-EDTA לבקבוק כדי לנתק את התאים מפני השטח של הצלוחית. יש לדגור במשך 2-5 דקות בטמפרטורה של 37°C עד שהתאים מתרוממים.</li>
		<li>נטרלו את הטריפסין על ידי הוספת נפח שווה של מדיום תרבית, ולאחר מכן החזירו בעדינות את תרחיף התא למעלה ולמטה כדי להבטיח ניתוק תאים מלא.</li>
		<li>צנטריפוגה את תרחיף התא ב 300 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי pellet את התאים.</li>
		<li>השהה מחדש את התאים במדיום תרבית טרי וצלחת אותם מחדש (מעבר) לצמיחה נוספת או הקפיא אותם לשימוש עתידי. בעת ההקפאה, השתמש באמצעי הקפאה המכיל הגנה קריופרוטקטיבית, כמו DMSO, כדי להגן על התאים מפני נזק במהלך ההקפאה.</li>
	</ol></li>
</ol>5. אפיון DPSCs
<ol><li>ניתוח ציטומטריית זרימה<ol><li>כדי לאשר את אופי תאי הגזע המזנכימליים של התאים המבודדים, בצע ניתוח ציטומטריית זרימה22,23. בתחילה, טריפסינזציה ואיסוף תאים כמתואר בשלב 4.3.</li>
		<li>קבע את כדאיות התא על ידי טכניקת אי הכללת צבע טריפאן. בצע את הניתוח באמצעות מנתח כדאיות התא (ראה טבלת חומרים) במהלך המעברים השניוהשמיני. בצע אנליזה פנוטיפית באמצעות ציטומטר זרימה במהלך המעבריםה-3 וה-7.</li>
		<li>לאחר הדגירה, שטפו את התאים במאגר ציטומטריית זרימה כדי להסיר נוגדנים עודפים ולנתח את התאים באמצעות ציטומטר זרימה. הערה: מאגר ציטומטריית הזרימה מורכב ממלח חוצץ פוספט (1x PBS), 1%-2% סרום בקר עוברי (FBS), ו-0.1% נתרן אזיד (NaN3). ה- FBS או BSA חוסם את הקישור הלא ספציפי של נוגדנים, בעוד שהנתרן אזיד פועל כחומר משמר. אחוז גבוה של תאים צריכים לבטא את הסמנים המזנכימליים של תאי גזע וחסרים את הסמנים ההמטופויטיים, המאשרים את זהותם כ- DPSCs24.</li>
		<li>נתקו את ה-DPSCs והכתימו אותם בנוגדנים אימונופלואורסנטיים לצורך ניתוח ציטומטריית זרימה. הערה: בחירת הסמנים לניתוח ציטומטריית זרימה של תאי גזע מזנכימליים (MSCs) מבוססת על הקונצנזוס שנקבע על ידי האגודה הבינלאומית לטיפול תאי (ISCT), הקובע כי MSCs צריכים לבטא CD105, CD73 ו- CD90, וחסרים את הביטוי של CD45, CD34, CD14 או CD11b, CD79a או CD19, ו- HLA Class II25. סמנים אלה משמשים בדרך כלל במחקרים החוקרים תאי גזע במוך השן26. ריכוזי הנוגדנים להכתמה יכולים להשתנות בהתאם לנוגדן הספציפי בו נעשה שימוש, ומומלץ לעקוב אחר הוראות היצרן (ראה טבלת חומרים) לדילול נוגדנים ותנאי דגירה25.</li>
		<li>לקבוע את קריטריוני הסיווג 27,28 לביטוי סמני CD כאמור: פחות מ-10%, ללא ביטוי; בין 11% ל -40%, ביטוי נמוך; טווח של 41% עד 70%, ביטוי מתון; מעל 71%, ביטוי גבוה.</li>
		<li>בנוסף, לאשר את היעדר סמנים hematopoietic על ידי דגירה תא נפרד aliquot עם נוגדנים נגד CD34 ו CD45.</li>
	</ol></li>
</ol>6. הבחנה בין שושלות מרובות
הערה: השלבים הבאים מתארים פרוטוקולים להתמיינות אוסטאוגנית, אדיפוגנית וכונדרוגנית של תאי גזע דנטליים. התחל על ידי זריעת תרביות בצפיפות של 1 x 105 תאים לכל באר בצלחת תרבית רקמה מצופה פיברונקטין עם מדיום שלם (CM). עקוב אחר צמיחת התאים עד להשגת מפגש של 80%-90% לפני התחלת פרוטוקול ההתמיינות הרצוי. כדי להעריך את פוטנציאל ההתמיינות הרב-שושלתי של DPSCs, התחל את תהליך ההתמיינות כלפי אוסטאובלסטים, אדיפוציטים וכונדרוציטים על ידי זריעת תאים ללוחות של 24 בארות וטיפוחם באמצעי התמיינות מתאימים.
<ol><li>התמיינות אוסטאוגנית<ol><li>התחל על ידי גידול DPSCs במדיום גידול רגיל בתנאים סטנדרטיים עד שהם מגיעים 70%-80% מפגש.</li>
		<li>הסר את מדיום הגידול מהתאים, ולאחר מכן לשטוף את התאים פעם אחת עם 1x PBS. הוסף את מדיום ההתמיינות האוסטאוגני (ODM) לתאים. הערה: ODM מורכב אלפא מינימלי חיוני בינוני (α-MEM) בתוספת 10% FBS, 100 יחידות / מ"ל פניצילין, 100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין, 0.25 מיקרוגרם / מ"ל אמפוטריצין B, 50 מיקרוגרם / מ"ל חומצה אסקורבית, 10 mM בטא גליצרופוספט, ו 100 ננומטר dexamethasone (ראה טבלה של חומרים).</li>
		<li>לדגור על התאים בתווך אוסטאוגני ב 37 ° C עם 5% CO2. שנה את המדיום האוסטאוגני כל 2-3 ימים. הערה: לאחר 14 עד 21 יום, DPSCs היו צריכים להתמיין לתאים דמויי אוסטאובלסט. ניתן לאשר זאת על ידי בדיקת עלייה בביטוי של סמנים ספציפיים לאוסטאובלסט, כגון פוספטאז אלקליין, או על ידי שימוש בטכניקות צביעה כדי לזהות מטריצה מינרליזציה, כגון צביעת Alizarin Red S.</li>
		<li>תקן את התאים על ידי דגירה אותם עם אתנול 70% קר כקרח במשך 1 שעה ב -20 ° C.</li>
		<li>צבעו את התאים הקבועים בתמיסת צביעה 40 ננומטר Alizarin Red S (pH 4.2) בטמפרטורת החדר בחושך למשך 10-15 דקות. דמיינו את הצביעה תחת מיקרוסקופ כדי לאשר התמיינות אוסטאוגנית (איור 3). לאשר את ההבחנה על ידי צביעת התאים עם Alizarin אדום S, אשר מזהה משקעי סידן המעידים על מינרליזציה29,30.</li>
	</ol></li>
	<li>בידול אדיפוגני<ol><li>כפי שפורט בסעיף הקודם, DPSCs תרבית בתנאים סטנדרטיים באווירה לחה עם 5% CO2 ב 37 ° C. עוברים את התאים כשהם מגיעים למפגש של 70%-80%.</li>
		<li>שאפו את המדיום ושטפו את התאים פעם אחת עם 1x PBS. החליפו את המדיום הדהוי במדיום בידול אדיפוגני. מדיום זה מורכב בדרך כלל מ- DMEM, 10% FBS, 10 מיקרוגרם / מ"ל אינסולין, 1 מיקרומטר דקסמתזון, 200 מיקרומטר אינדומתצין ו- 0.5 מילימטר IBMX (ראה טבלת חומרים).</li>
		<li>שנה את מדיום הבידול כל 3-4 ימים. לאחר כ-3 שבועות, שטפו את ה-DPSCs המובחנים באדיפוגנים עם PBS וקיבעו אותם עם 4% פרפורמלדהיד (PFA) למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>צבעו את התאים הקבועים עם שמן אדום O (ראו טבלת חומרים) כדי להמחיש הצטברות טיפות שומנים (איור 4). כדי לאשר עוד יותר התמיינות אדיפוגנית, בצע ניתוח ביטוי גנים של סמנים אדיפוגניים כגון peroxisome proliferator-activated receptor-activated receptor gamma (PPARγ) ו- adiponectin31,32.</li>
	</ol></li>
	<li>התמיינות כונדרוגנית<ol><li>תרביות DPSCs המתוחזקות באטמוספירה לחה עם 5% CO2 ב -37 מעלות צלזיוס משמשות להתמיינות כונדרוגנית. עוברים את התאים כשהם מגיעים למפגש של 70%-80%.</li>
		<li>שאפו את המדיום ושטפו את התאים פעם אחת עם 1x PBS. החלף את המדיום שנשטף במדיום התמיינות כונדרוגני, המכיל בדרך כלל גלוקוז גבוה מדיום הנשר המעובד של דולבקו (DMEM), 1% ITS, 100 ננומטר דקסמתזון, 50 מיקרוגרם/מ"ל אסקורבט-2-פוספט, 40 מיקרוגרם/מ"ל פרולין ו-10 ננוגרם/מ"ל גורם גדילה-בטא 3 (TGF-β3) (ראה טבלת חומרים).</li>
		<li>לשמור על התאים במדיום התמיינות chondrogenic, שינוי המדיום כל 2-3 ימים. לאחר כשלושה שבועות, DPSCs היו צריכים להתמיין לתאים דמויי כונדרוציטים.</li>
		<li>תקן את התאים על ידי דגירה שלהם עם 4% paraformaldehyde (PFA) במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הקיבוע, צבעו את התאים בכחול אלקיאני (ראו טבלת חומרים) ודמיינו אותם תחת מיקרוסקופ כדי לאשר התמיינות כונדרוגנית (איור 5).</li>
		<li>אשר את ההתמיינות של DPSCs לכונדרוציטים באמצעות טכניקות כגון צביעת Alcian Blue עבור פרוטאוגליקנים או ניתוח ביטוי גנים של סמנים כונדרוגניים כמו aggrecan, SOX9 וקולגןמסוג II 33,34.</li>
	</ol></li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

הפרוטוקול מתאר את הבידוד, התרבות והאפיון של תאי גזע במוך השן (DPSCs) משיניים נשירות וקבועות אנושיות. הוא כולל תיאור של אחסון והתפשטות של תאים אלה, כמו גם הערכה של פוטנציאל התמיינות החוץ גופית שלהם לאוסטאובלסטים, אדיפוציטים וכונדרוציטים35.
Chen et al.36 הראו כי ניתן להשיג תאי גזע של מוך השן (DPSCs) ממקורות שונים, כולל שיניים אנושיות חיוניות נגועות הסובלות ממצבים כמו דלקת חניכיים, ספיגת שורשים, פריקורוניטיס ושברים בשיניים, כמו גם שיניים סופר-מספריות ולא מיושרות. ממצא זה אושש עוד יותר על ידי מחקרים מאוחרים יותר שזיהו שיניים חיוניות נגועות כמקורות פוטנציאליים של DPSCs 37,38,39,40. עם זאת, Bernardi et al.10 הצביעו על כך שספיגת שורשים מוגברת עלולה להשפיע לרעה על יכולת הקיום של תאי גזע אלה. משוכה משמעותית בתהליך היא שימור התאים ומניעת התפרקותם, המתחילה מיד לאחר עקירת השן או קילוף. יתר על כן, חשוב לציין כי אין להשתמש בשיניים המושפעות ממצבים חמורים כגון מורסות פריאפיקליות, גידולים או ציסטות כדי לחלץ תאי גזע40,41.
DPSCs ניתן להשיג באמצעות טכניקת העיכול האנזימטי (ED) או הצמיחה משיטת צמחי רקמות (OG), הידועה גם בשם טכניקת הצמיחה הספונטנית14,15. חוקרים משתמשים באסטרטגיות אלה כדי לחקור את היעילות של התפשטות תאים או שמירה על תכונות מורפולוגיות ופנוטיפיות של תאי גזע מבודדים17. מחקרים מצאו כי תאי גזע שבודדו בשיטת OG מראים קצב התרבות איטי יותר וביטוי חלש יותר של סמני תאי גזע18. לעומת זאת, DPSCs שבודדו באמצעות שיטת ED הדגימו התפשטות מהירה יותר, התמיינות וביטוי מוגבר של סמני שטח נוספים מאלה שבודדו בשיטת OG. באופן מעניין, תאי גזע לא בשלים של מוך השן (IDPSCs) שחולצו משיניים נשירות בטכניקת OG הראו כי תרבית תאים עודדה התרבות סלקטיבית של IDPSCs, ובכך מנעה התמיינות מוקדמת42.
טיהור DPSCs חיוני להשגת תאים רגנרטיביים מאוד ודורש סמני תאים ספציפיים. בחירת תאים מתבצעת בשיטות מיון תאים פלואורסצנטיות או מגנטיות. מלבד הסמנים הנ"ל, אנטיגנים רבים אחרים פני השטח משמשים גם בשל האופי ההטרוגני של DSCs43. עם זאת, לא זוהה סמן יחיד המפריד בין תת-האוכלוסיות.
בהשוואה לתאי גזע מזנכימליים שמקורם במח העצם, DPSCs הוכרו כמקור מבטיח לתאים רב-פוטנטיים בשל הפוטנציאל הרב-שושלת שלהם44. גבעול זה הוא ככל הנראה תוצאה של חוסר בשלות יחסית של רקמות המקור, שכן שיני בינה, לעתים קרובות המקור לעקירת DPSCs, הן השיניים הקבועות האחרונות להתפתח ולכן הן פחות בשלות ממח עצם45. פרוטוקול זה חוקר בהצלחה את האופי הרב-עוצמה של תאי גזע במוך השן על ידי גרימת תאים אלה לעבור אדיפוגנזה, אוסטאוגנזה וכונדרוגנזה. יש לציין כי DPSCs הם סוג התא היחיד המווסת את ביטוי DSPP כאשר הם מתורבתים בתנאים אוסטאוגניים, דבר המעיד על התמיינותם העתידית לאודונטובלסטים46.
תאי גזע דנטליים, שבודדו ממקורות שונים, מציגים פוטנציאל ריבוי והתמיינות רבים47. הצעדים המשמעותיים שנעשו במערכות חוץ גופיות השפיעו עמוקות על הביולוגיה והטיפול של תאי גזע. למרות התקדמות זו, נותרו אתגרים בעת תרגום טיפולים בתאי גזע מספסל למיטה. יש להקדיש תשומת לב מיוחדת להישרדותם ויציבותם של תאי גזע כדי להבטיח שטכניקות שימור לא יפגעו בכדאיות של תאים אלה. בעוד שמחקר תאי גזע דנטליים הניב תוצאות מבטיחות במודלים של בעלי חיים, יש צורך דחוף להרחיב ממצאים אלה לניסויים בבני אדם. על ידי המשך הנעת מחקר ופיתוח קפדניים, תאי גזע דנטליים צפויים למלא תפקיד משמעותי בקידום תחום בנקאות תאי הגזע.
בעוד שמשתמשים בה באופן נרחב, גישת העיכול האנזימטי לבידוד תאי גזע במוך השן (DPSCs) מציגה מספר מגבלות. בראש ובראשונה, התהליך עלול לפגוע ביכולת הקיום של התא, שכן אנזימים כמו collagenase ו-dispase יכולים לפגוע בשוגג בקרומי התא, ולהניב פחות תאי גזע חיים17. בנוסף, שיטה זו גורמת לעיתים קרובות לפירוק המטריצה החוץ תאית החיונית (ECM), שהיא חיונית לשימור התכונות הטבועות בתאי גזע48. ההליך עשוי גם לשנות את פני השטח של התא, ולהקשות על זיהוי ואפיון מדויקים של DPSCs43. מעבר לאילוצים ביולוגיים אלה, הגישה גוזלת זמן, ומעלה את הסיכונים לזיהום מיקרוביאלי עקב דגירות ממושכות ב -37 מעלות צלזיוס. יתר על כן, חוסר העקביות בין אצוות אנזימים יכול להוביל לתוצאות משתנות, לאתגר את יכולת השחזור של הליך הבידוד. אי אפשר להתעלם מהנטל הכספי, שכן אנזימים ברמה גבוהה המתאימים לעיכול רקמות הם יקרים49. יתר על כן, לאחר העיכול עלולה להיות פעילות אנזימים שיורית שעלולה להשפיע לרעה על תרביות תאים, להשפיע על בריאותן, שגשוגן והתמיינותן. לבסוף, הפוטנציאל של עיכול אנזימטי להעדיף תת-אוכלוסיות מסוימות של DPSC על פני אחרות עלול להטות בשוגג את מאגר התאים המתקבל, ולהשפיע על הפוטנציאל הטיפולי שלהם50.

מחקר תאי גזע פרח במדע הביו-רפואי בשל היישומים המבטיחים שלו ברפואה רגנרטיבית ובהנדסת רקמות. תאי גזע של מוך השן (DPSCs), שמקורם ברקמת מוך השן של שיניים נשירות וקבועות אנושיות, משכו עניין רב כמקור לתאי גזע בשל זמינותם המוכנה ויכולתם הרב-פוטנטית 1,2. לתאים אלה יש פוטנציאל להתמיין לסוגי תאים שונים, כולל אדיפוציטים, אוסטאובלסטים וכונדרוציטים, כפי שאושר במחקרים רבים3.
במהלך העשורים האחרונים, המחקר והיישומים הטיפוליים של תאי גזע זינקו. הפוטנציאל הרחב של תאי גזע מחייב גיוון המקורות מהם הם מתקבלים. מספר גורמים משפיעים על היעילות, הכדאיות והגבעול של תאים נבחרים. למרות קיומם של מאגרים ידועים שונים של תאי גזע, כגון מח עצם ורקמות שומן, ההליכים הפולשניים, תחלואה באתר וחששות אתיים הקשורים למקורות אלה מגבילים לעתים קרובות את חקירתם 4,5. בין מקורות תאי הגזע השונים, תאי גזע דנטליים זכו לתשומת לב בשל נגישותם הקלה, פלסטיות גבוהה ויישומים פוטנציאליים מגוונים. תאי גזע אנושיים של מוך השן, בפרט, נחקרו בהרחבה עבור הסיכויים הטיפוליים שלהם6. שיניים, שבדרך כלל מושלכות כפסולת רפואית, מכילות שפע של תאי גזע מזנכימליים7. שמירה על מאגר תאי גזע יקר ערך זה דורשת מאמצים קולקטיביים מצד מטופלים, רופאי שיניים ורופאים כדי להבטיח שמשאבים אלה לא יבוזבזו, מה שהופך כל תא גזע במוך השן לזמין לדרישות התחדשות עתידיות.
תאי גזע שמקורם במוך השן, כגון תאי גזע אנושיים בוגרים של מוך השן (DPSCs) ותאי גזע משיניים נשירות אנושיות (SHED), ממוקמים בנישה הפרי-וסקולרית של מוך השן. תאים אלה הם האמינו שמקורם בתאי פסגה עצבית גולגולתית ומציגים סמנים מוקדמים הן עבור תאי גזע מזנכימליים (MSC) והן עבור תאי גזע נוירואקטודרמליים. DPSCs ו- SHEDs הוכיחו רב-עוצמה ויכולת לחדש סוגי רקמות מגוונים8.
מקורות פוטנציאליים של תאי גזע דנטליים כוללים שיניים בריאות, נשירות וקבועות. תאי גזע מהווים רק כ-1% מכלל אוכלוסיית התאים במוך השן, מה שמדגיש את החשיבות של טכניקות בידוד והתפשטות יעילות9. כתוצאה מכך, מיצוי והרחבה של תאי גזע אלה הם שלבים מרכזיים בבידוד DPSC10. שיניים שנעקרו או עברו קילוף צריכות להיות מאוחסנות באמצעי הובלה עשיר בחומרים מזינים, כגון מלוחים חוצצי פוספט (PBS) או תמיסת מלח חוצצת הנקס (HBSS).
השגת מוך השן יכולה להיות מושגת בשיטות שונות, המותנות בסוג השן 7,11. עבור שיניים נשירות עם שורשים נספגים, ניתן לבצע עקירה דרך קודקוד השורש. באופן דומה, ניתן להשתמש במוך דוקרני סטרילי כדי להשיג מוך שיניים קבועות עם קודקוד פתוח לא בוגר. במקרים של שיניים קבועות עם שורשים מפותחים, הגישה לחדר מוך השן כרוכה בהפרדת כתר השיניים מהשורש. זה מושג על ידי חיתוך השן באמצעות דיסק יהלום בצומת צמנטואמייל. חתך זה חושף את תא מוך השן ומאפשר שליפה של רקמת מוך השן 12,13,14.
תאי גזע של מוך השן (DPSCs) יכולים להיות מבודדים באמצעות עיכול אנזימטי (ED) או צמיחה מצמחי רקמות (OG), הידוע גם בשם צמיחה ספונטנית. שיטת ED משתמשת באנזימים, בעיקר collagenase I ו- dispase, כדי לפרק את הרקמה לתרחיפים חד-תאיים15,16. שיטת OG, פשוטה ומהירה יותר, כרוכה בחיתוך שברי עיסת השן והנחתם ישירות לתוך צלחת תרבית, המאפשרת לתאים לצמוח מצמחי הרקמה17. חוקרים השתמשו והשוו את שתי הטכניקות כדי להעריך את קצב התפשטות התאים, שימור תכונות תאי גזע מבודדים, התמיינות וביטוי סמנים על פני השטח18. הקמה וסטנדרטיזציה של פרוטוקולים לרכישת DPSCs עם יעילות גבוהה וגזע יכולים לסלול את הדרך לטיפולים יעילים ובטוחים19. פרוטוקול זה כולל חילוץ DPSCs באמצעות עיכול אנזימטי, עיבוד מעבדה, שימור והתמיינות תאים עם צביעה קולורימטרית עבור אדיפוגנזה, אוסטאוגנזה וכונדרוגנזה.
הפרוטוקול המתואר במאמר זה מציג הליך שלב אחר שלב, החל מהבידוד הראשוני של מוך השן מהשן, לאחר מכן תרבית ותחזוקה של DPSCs במעבדה, וכלה באפיון שלהם באמצעות סמנים ספציפיים של תאי גזע (איור 1). כמו כן מתוארות הטכניקות לגרימת תאי גזע אלה לשושלות תאים שונות, תוך הדגשת הרב-עוצמה שלהם.

<table><tbody><tr><td>3-איזובוטי-ל-מתיל-קסנטין&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ' ושות' סנט לואיס, MO 63103.ארה"ב</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אצטית&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ' ושות' סנט לואיס, מיזורי 63103.ארה"ב</td><td>AS001</td><td></td></tr><tr><td>אלסיאן בלו&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ' ושות' סנט לואיס, MO 63103.ארה"ב</td><td>RM471</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מכתים אליזרין אדום S</td><td>סיגמא-אולדריץ' ושות' סנט לואיס, MO 63103.ארה"ב</td><td>GRM894</td><td></td></tr><tr><td>אלקליין פוספטאז -ערכת צביעה</td><td>תרמו פישר מדעי, MA 02451, ארה"ב</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אלפא מינימום מדיום חיוני (&אלפא;-MEM)&nbsp;</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק, MA 02451, ארה"ב</td><td></td><td>Gibco</td></tr><tr><td>אלפא מדיום חיוני מינימלי (&alpha;-MEM)&nbsp;</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק, MA 02451, ארה"ב</td><td></td><td>Gibco</td></tr><tr><td>Alpha-MEM, או אלפא מינימום חיוני בינוני</td><td>תרמו פישר מדעי, MA 02451, ארה"ב</td><td></td><td>Gibco</td></tr><tr><td>Alpha-MEM, או אלפא מינימום חיוני בינוני</td><td>תרמו פישר מדעי, MA 02451, ארה"ב</td><td></td><td>Gibco</td></tr><tr><td>אנטיביוטיקה/אנטי-מיקוטיקה</td><td>סיגמא-אולדריץ' ושות' סנט לואיס, MO 63103.USA</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>אסקורבט-2-פוספט</td><td>סיגמא-אולדריץ' ושות' סנט לואיס, MO 63103.ארה"ב</td><td>012-04802</td><td></td></tr><tr><td>בטא-גליצרופוספט&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ' ושות' סנט לואיס, MO 63103.USA</td><td>G9422-10G</td><td></td></tr><tr><td>ארון בטיחות ביולוגית-מכסה מנוע זרימה למינארי</td><td>Labconco Corporation, MO 64132-2696, ארה"ב</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD90, CD105, CD73, CD34, CD45 ו-HLA-DR</td><td>BioLegend, Inc.CA 92121, ארה"ב</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מסננת תאים (70 ומיקרו; מ)</td> <td>מעבדות היימדיה&nbsp; בע"מ מומבאי, הודו</td><td>TCP025</td><td>מסננת תאים</td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>REMI Elektrotechnik Limited (REMI)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>צנטריפוגה</td><td>מעבדות HiMedia&nbsp; בע"מ מומבאי, הודו</td><td>1101 | 1102</td><td></td></tr><tr><td>CO2 חממה</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק, MA 02451, ארה"ב</td><td></td><td></td></tr><tr><td>קולגנאז סוג I</td><td>וורת'ינגטון ביוכימיה. קורפ ניו ג'רזי 08701, ארה"ב</td><td></td><td></td></tr><tr><td>קולגנאז סוג I</td><td>וורת'ינגטון ביוכימיה קורפ. קורפ ניו ג'רזי 08701, ארה"ב</td><td></td><td></td></tr><tr><td>צמיחה מלאה בינונית</td><td>מעבדות HiMedia&nbsp; בע"מ מומבאי, הודו</td><td>AT006</td><td>DMEM</td></tr><tr><td>צינורות חרוטיים (15 או 50)</td> <td>תרמו פישר סיינטיפיק, MA, ארה"ב</td><td>546021P/546041P</td><td>15 מ"ל ו-50 מ"ל</td></tr><tr><td>מיכל הקפאה קריו תרמו</td><td>פישר סיינטיפיק, MA 02451, ארה"ב</td><td>15-350-50</td><td></td></tr><tr><td>תוויות קריו</td><td>תווית הודו:</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>קופסאות אחסון קריוביאליות&nbsp;</td>קופסאות <td></td><td></td><td>אחסון Cryostore</td></tr><tr><td>Cryovials</td><td>Thermo Fisher Scientific, MA 02451, ארה"ב</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cryovials (1.8 מ"ל)</td> <td>Thermo Fisher Scientific, MA 02451, ארה"ב</td><td>PW1282</td><td></td></tr><tr><td>בקבוק תרבית עצמאי (25 ס"מ&sup2;)</td><td>Corning Inc.NY 14831, ארה"ב</td><td></td><td></td></tr><tr><td>צלוחיות תרבות מעבדות</td><td>HiMedia&nbsp; בע"מ, מומבאי, הודו</td><td>TCG4 / TCG6</td><td>T25 / T75</td></tr><tr><td>צלחות תרבות מעבדות</td><td>HiMedia&nbsp; בע"מ, מומבאי, הודו</td><td>TCP129 / TCP008</td><td>60 מ"מ / 100 מ"מ</td></tr><tr><td>דיסקי יהלומים דנטליים</td><td>Komet SC 29730, ארה"ב</td><td></td><td>Komet&nbsp;</td></tr><tr><td>מחפר כפיות שיניים</td><td>Brasseler, GA 31419, ארה"ב</td><td>5023591U0</td><td></td></tr><tr><td>Dexamethasone</td><td>Sigma-Aldrich Co. סנט לואיס, MO 63103.USA</td><td>D4902-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Dexamethosone</td><td>Sigma-Aldrich Co. סנט לואיס, MO 63103.ארה"ב</td><td>D4902-25MG</td><td></td></tr><tr><td>דקסמתוזון</td><td>סיגמא-אולדריץ' ושות' סנט לואיס, MO 63103.ארה"ב</td><td>D4902-25MG</td><td></td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד (DMSO)</td><td>סיגמא-אולדריץ' ושות' סנט לואיס, MO 63103.USA</td><td>TC185</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Roche Diagnostics, מנהיים, גרמניה.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Roche Diagnostics GmbH, מנהיים, גרמניה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td> <td>Thermo Fisher Scientific, MA, ארה"ב</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td> <td>Thermo Fisher Scientific, MA 02451, ארה"ב</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td> <td>Thermo Fisher Scientific, MA 02451, ארה"ב</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Thermo Fisher Scientific, MA 02451, ארה"ב</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אתנול (70%)</td><td>מעבדות HiMedia&nbsp; בע"מ מומבאי, הודו</td><td>MB106</td><td></td></tr><tr><td>אתנול -70%</td> <td>תרמו פישר סיינטיפיק, MA 02451, ארה"ב</td><td></td><td>פישר מלקחיים</td></tr><tr><td>מיצוי מדעיים&nbsp;</td><td>Dentsply Sirona, ארה"ב</td><td></td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc., MA, ארה"ב</td><td>F2442-500ML</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc., MA, ארה"ב</td><td>F2442-500ML</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>מעבדות HiMedia&nbsp; בע"מ מומבאי, הודו</td><td>RM9954</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td> <td>Thermo Fisher Scientific Inc., MA, ארה"ב</td><td>F2442-500ML</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td> <td>Thermo Fisher Scientific Inc., MA, ארה"ב</td><td>F2442-500ML</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבית רקמות מצופה פיברונקטין</td><td>קורנינג בע"מ קורנינג, ניו יורק 14831, ארה"</td><td></td><td></td></tr>ב <tr><td>ציטומטר זרימה</td><td>BD Biosciences, CA 95131, ארה"ב</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מאגר ציטומטריה זרימה</td><td>BD Biosciences, CA 95131, ארה"ב</td><td></td><td></td></tr><tr><td>כיסוי זכוכית 22 x 22 מ"מ</td><td>מעבדות HiMedia&nbsp; בע"מ מומבאי, הודו</td><td>TCP017</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS)</td> <td>קבוצת לונזה בע"מ, 4002 באזל, שוויץ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ידית שיניים במהירות גבוהה&nbsp;</td><td>NSK בע"מ, טוקיו 8216, יפן</td><td></td><td>Ti-Max Z</td></tr><tr><td>סדרת סרום סוס</td><td>תרמו פישר מדעי, MA 02451, ארה"ב</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IBMX, או 3-isobutyl-1-methylxanthine</td><td>Sigma-Aldrich Co. סנט לואיס, MO 63103.USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Indomethacin</td><td>Pfizer Inc. NY 10017, ארה"ב</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אינסולין-טרנספרין-סלניום (ITS)</td> <td>תרמו פישר מדעי, MA 02451, ארה"ב</td><td>I5523</td><td></td></tr><tr><td>אינסולין-טרנספרין-סלניום (ITS)</td> <td>תרמו פישר מדעי, MA 02451, ארה"ב</td><td>I5523</td><td></td></tr><tr><td>אינסולין-טרנספרין-סלניום (ITS) premix</td><td>Corning Incorporated, MA 01876, ארה"ב</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ הפוך</td><td>Olympus Corp., טוקיו 163-0914, יפן</td><td></td><td></td></tr><tr><td>איזופרופנול (60%)</td> <td>Sigma-Aldrich Co. סנט לואיס, MO 63103.USA</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>איזופרופיל אלכוהול&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ' ושות' סנט לואיס, MO 63103.USA</td><td>MB063</td><td></td></tr><tr><td>קולט אדים זרימה למינארי</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק, MA 02451, ארה"ב</td><td></td><td></td></tr><tr><td>לידוקאין מעורבב עם אפינפרין</td><td>DENTSPLY, NC 28277, ארה"ב</td><td></td><td>Citanest</td></tr><tr><td>חנקן</td><td>נוזלי אוויר נוזלי, 75007 פריז, צרפת</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיכל אחסון חנקן נוזלי</td><td>Cryo Scientific Systems Pvt. בע"מ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropipettes</td><td>Eppendorf AG, 22339 המבורג, גרמניה</td><td>30020</td><td>Accupipet-2-20 ומיקרו; L</td></tr><tr><td>מיני מטחנת רקמות</td><td>Bio-Rad Lab, Inc. CA 94547, ארה"ב</td><td></td><td>מטחנות מיני ReadyPrep</td></tr><tr><td>מינוס 80 מקפיא</td><td>Blue Star Limited</td><td></td><td></td></tr><tr><td>תא ספירת נויבאואר</td><td>Marienfeld Superior, arktheidenfeld, גרמניה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>שמן אדום O כתם</td><td>Sigma-Aldrich Co. סנט לואיס, MO 63103.USA</td><td>1024190250</td><td></td></tr><tr><td>מדיום בידול אוסטאוגני (ODM)&nbsp;</td><td>STEMCELL Technologies Inc.ונקובר, קולומביה הבריטית, V5Z 1B3, קנדה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פרפורמלדהיד (PFA)&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ' ושות' סנט לואיס, MO 63103.USA</td><td>TCL119</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>Gibco-Thermo Fisher Scientific Inc., MA 02451, ארה"ב</td><td></td><td></td></tr><tr><td>תמיסת פוספט חוצץ (PBS) ללא Ca++ ו-Mg++</td><td>HiMedia Laboratories&nbsp; בע"מ מומבאי, הודו</td><td>TS1101</td><td></td></tr><tr><td>מי מלח חוצץ פוספט (PBS)</td> <td>תרמו פישר מדעי</td><td></td><td>Gibco</td></tr><tr><td>חוצץ פוספט (PBS)</td> <td>תרמו פישר סיינטיפיק, MA, ארה"ב</td><td></td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS)</td> <td>תרמו פישר סיינטיפיק, MA, ארה"ב</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מי מלח חוצץ פוספט (PBS)</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק, MA, ארה"ב</td><td>P3813-1PAK</td><td>1x PBS, pH 7.4</td></tr><tr><td>פרולין&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich Co. סנט לואיס, MO 63103.ארה"ב</td><td></td><td></td></tr><tr><td>להב אזמל גודל 15&nbsp;</td><td>סוואן-מורטון בע"מ, שפילד, S6 2BJ, בריטניה</td><td>BDF-6955C</td><td></td></tr><tr><td>נתרן היפוכלוריט</td><td>מעבדות HiMedia&nbsp; בע"מ מומבאי, הודו</td><td>AS102</td><td>4% w / v פתרון</td></tr><tr><td>צינורות צנטריפוגה סטריליים</td><td>Tarsons Products Pvt. בע"מ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיכל סטרילי -20 מ"ל</td><td>3M מרכז, MN 55144-1000, ארה"ב</td><td></td><td>3 M</td></tr><tr><td>מי מלח סטריליים עם חוצץ פוספט (PBS)</td> <td>סיגמא אולדריץ', ארה"ב</td><td>P3813-1PAK</td><td>1x PBS, pH 7.4</td></tr><tr><td>פיפטות סטריליות (2, 5 ו-10 מ"ל)</td> <td>Eppendorf AG, 22339 המבורג, גרמניה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פיפטות וטיפים סטריליים</td><td>Eppendorf India Limited</td><td></td><td></td></tr><tr><td>להב כירורגי ידית</td><td>בקטון, דיקינסון ושות', ניו ג'רזי, ארה"ב</td><td>371030</td><td>BP ידית 3</td></tr><tr><td>גורם גדילה טרנספורמטיבי-בטא 3 (TGF-&beta; 3)</td> <td>מו"פ D Systems, Inc.MN 55413, ארה"ב</td><td></td><td></td></tr><tr><td>גורם צמיחה טרנספורמטיבי-בטא 3 (TGF-&beta; 3)</td> <td>מו"פ D Systems, Inc.MN 55413, ארה"ב</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue 0.4%&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich Co. סנט לואיס, MO 63103.ארה"ב</td><td></td><td></td></tr><tr><td>טריפאן כחול 0.4%&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ' ושות' סנט לואיס, מיזורי 63103.ארה"ב</td><td>TCL046</td><td></td></tr><tr><td>טריפאן כחול 0.4%&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ' ושות' סנט לואיס, מיזורי 63103.ארה"ב</td><td>TCL046</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין-EDTA&nbsp;</td><td>Gibco-Thermo Fisher Scientific Inc., MA 02451, ארה"ב</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 0.25%</td> <td>Gibco-Thermo Fisher Scientific Inc., MA 02451, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Water</td><td>Bath Thermo Fisher Scientific, MA 02451, USA</td><td>BSW-01D</td><td></td></tr></tbody></table>

בידוד, תרבית ואפיון תאי גזע במוך השן משיני אדם נשירים וקבועים

Isolation, Culture, and Characterization of Dental Pulp Stem Cells from Human Deciduous and Permanent Teeth

בתחום הרפואה הרגנרטיבית והיישומים הטיפוליים, מחקר תאי גזע צובר תאוצה במהירות. תאי גזע ממוך השן (DPSCs), הנמצאים הן בשיניים נשירות והן בשיניים קבועות, התגלו כמקור תאי גזע חיוני בשל נגישותם, יכולת ההסתגלות שלהם ויכולות ההתמיינות המולדת שלהם. DPSCs מציעים מאגר זמין ושופע של תאי גזע מזנכימליים, המציגים רב-תכליתיות ופוטנציאל מרשימים, במיוחד למטרות רגנרטיביות. למרות הבטחתם, המשוכה העיקרית טמונה בבידוד ואפיון יעיל של DPSCs, בהתחשב בייצוגם כשבריר זעיר בתוך תאי מוך השן. חיוני לא פחות הוא שימור נאות של משאב סלולרי יקר ערך זה. שתי השיטות העיקריות לבידוד DPSC הן עיכול אנזימטי (ED) וצמיחה מצמחי רקמות (OG), המכונה לעתים קרובות צמיחה ספונטנית. פרוטוקול זה מתרכז בעיקר בגישת העיכול האנזימטי לבידוד DPSC, ומפרט באופן מורכב את השלבים הכוללים מיצוי, עיבוד במעבדה ושימור תאים. מעבר למיצוי ושימור, הפרוטוקול מתעמק ביכולת ההתמיינות של DPSCs. באופן ספציפי, הוא מתאר את ההליכים המשמשים כדי לגרום לתאי גזע אלה להתמיין לאדיפוציטים, אוסטאובלסטים וכונדרוציטים, ומציג את התכונות הרב-עוצמתיות שלהם. שימוש עוקב בטכניקות צביעה קולורימטרית מאפשר הדמיה מדויקת ואישור של בידול מוצלח, ובכך לאמת את האיכות והפונקציונליות של DPSCs מבודדים. פרוטוקול מקיף זה מתפקד כתוכנית המקיפה את כל הספקטרום של מיצוי תאי גזע במוך השן, טיפוח, שימור ואפיון. הוא מדגיש את הפוטנציאל המשמעותי הגלום ב- DPSCs, מניע קדימה חקר תאי גזע וטומן בחובו הבטחה לפריצות דרך רגנרטיביות וטיפוליות עתידיות.

הביצוע המוצלח של הפרוטוקול המתואר הניב תאי גזע של מוך השן (DPSCs) המסוגלים להתמיין בין שושלות, ולהדגים את רב-העוצמה שלהם.
מבחני כדאיות הכדאיות של DPSCs הוערכה באמצעות בדיקת אי הכללת Trypan Blue בנקודות זמן שונות. התוצאות מראות כדאיות גבוהה באופן עקבי (יותר מ-95%) לאורך כל תקופת התרבות, מה שממחיש את החוסן של פרוטוקול הבידוד והתרבות שלנו.
מבחני יחידה יוצרת-מושבה (CFU) בדיקות CFU נערכו כדי להעריך את יכולת ההתחדשות העצמית של DPSCs. תרחיף חד-תאי היה מצופה בצפיפות נמוכה ותורבית במשך 14 יום. המושבות שנוצרו אז הוכתמו ונספרו. התוצאות מראות מושבות רבות, המצביעות על שיעור גבוה של תאים המתחדשים מעצמם באוכלוסיית DPSC.
זמן הכפלת תאים זמן הכפלת התאים חושב בהתבסס על עקומת הגדילה של DPSCs. התאים נזרעו בצפיפות מסוימת ונספרו באופן קבוע כדי לבנות עקומת גדילה. זמן ההכפלה חושב לאחר מכן באמצעות שלב הצמיחה המעריכית של העקומה. התוצאות מראות זמן הכפלה עקבי עם זה שדווח עבור MSCs, מה שמרמז על אוכלוסיית תאים בריאה ומתרבה (איור 6).
ניתוח ציטומטריית זרימה ניתוח ציטומטריית הזרימה הראה שרוב גדול של DPSCs (למשל, &gt;95%) היו חיוביים עבור CD90, CD73 ו- CD105, מה שאישר את זהותם כ- MSCs (איור 7). יתר על כן, פחות מ -2% מהתאים היו חיוביים ל- CD45, CD34 ו- HLA-DR, מה שמאשר את היעדר זיהום משמעותי בתאי המטופויאט או אנדותל.
התמיינות אוסטאוגנית עם השלמת ההתמיינות האוסטאוגנית, התאים הציגו מטריצה מינרלית, אשר מודגמת על-ידי צביעת Alizarin Red S (איור 3). נוכחות הצבע האדום בתאים המוכתמים מצביעה על תצהיר מוצלח של מטריצה מינרליזציה, מאפיין חיוני של התמיינות אוסטאוגנית. חוסר היכולת להשיג בהצלחה צביעת בידול עשוי להיות קשור לאתגרים העומדים בפני הליך איסוף הדגימות.
בידול אדיפוגני במהלך ההתמיינות האדיפוגנית, ה- DPSCs צברו טיפות שומנים, המעידות על אדיפוגנזה. ניתן לראות את טיפות השומנים עם צביעת שמן אדום O (איור 4). התמיינות מוצלחת הביאה לטיפות שומנים מוכתמות כתומות-אדומות בתוך התאים.
התמיינות כונדרוגנית לבסוף, לאחר התמיינות כונדרוגנית, DPSCs ייצרו גליקוזאמינוגליקנים, מרכיב סחוס קריטי שאושר על ידי צביעת Alcian Blue, אשר נקשר לגליקוזאמינוגליקנים אלה. תאים שעברו בהצלחה כונדרוגנזה הציגו צבע כחול עם צביעתם (איור 5).
התאים שלא הצליחו להציג שינויי צבע מתאימים בהליכי הצביעה עשויים לנבוע מההתמיינות התת-אופטימלית, אולי בגלל בעיות באמצעי ההתמיינות או באיכות הראשונית של DPSCs. חשוב להבטיח את איכות המדיה והתוספים ואת הבריאות ומספר המעבר של DPSCs בשימוש. ההתמיינות המוצלחת של DPSCs לאוסטאובלסטים, אדיפוציטים וכונדרוציטים מאמתת את טבעם הרב-יכול של תאים אלה ומדגישה את הפוטנציאל שלהם ברפואה רגנרטיבית וביישומים טיפוליים.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65767/65767fig01.jpg"> איור 1: סקירה כללית של בידוד, אפיון והתמיינות של תאי גזע במוך השן. איור זה מספק ייצוג סכמטי של זרימת העבודה לבידוד, אפיון והבחנה של תאי גזע במוך השן (DPSCs). התהליך מתחיל עם עקירת השן (או השיניים), ואחריו בידוד של רקמת מוך השן, שממנו DPSCs נגזרים. לאחר הבידוד, ה-DPSCs עוברים בדיקות אפיון שונות כדי לאשר את זהות תאי הגזע שלהם ולהעריך את הכדאיות שלהם, קצב ההתרבות שלהם ותכונות מפתח אחרות. השלב הסופי המיוצג בתרשים זה כולל אינדוקציה של התמיינות, שבה DPSCs מטופלים עם גורמים ספציפיים כדי להנחות את הפיכתם לסוגי תאים מיוחדים, כגון אוסטאובלסטים, אדיפוציטים או כונדרוציטים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65767/65767fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65767/65767fig02.jpg"> איור 2: שליפת מוך השן משיניים שנעקרו. (A) שן שנעקרה מוכנה לעקירת רקמת מוך השן. (ב) חיתוך השן שנעקרה באמצעות בור יהלום. (ג) הוצאת רקמת מוך השן מתא מוך השן. (D) פיצול רקמת מוך השן באמצעות להב כירורגי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65767/65767fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65767/65767fig03.jpg"> איור 3: התמיינות אוסטאוגנית של תאי גזע במוך השן (DPSCs) שנצפתה על-ידי צביעת Alizarin Red S (פי 40). הצביעה האדומה הבוהקת חושפת את התצהיר של המטריצה המינרליזציה, תכונה אופיינית של אוסטאובלסטים, המאשרת התמיינות אוסטאוגנית מוצלחת. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65767/65767fig03large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65767/65767fig04.jpg"> איור 4: התמיינות אדיפוגנית של תאי גזע במוך השן (DPSCs) שהודגמה על-ידי צביעת שמן אדום O. נוכחותן של טיפות אדומות בוהקות מייצגת הצטברות שומנים, סימן היכר של אדיפוציטים, המאשר התמיינות אדיפוגנית מוצלחת. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65767/65767fig04large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65767/65767fig05.jpg"> איור 5: התמיינות כונדרוגנית של תאי גזע במוך השן (DPSCs) שהודגמה על-ידי צביעה כחולה אלסיאנית (40x). הצבע הכחול העז מציין את נוכחותה של מטריצה חוץ-תאית עשירה בפרוטאוגליקן, מאפיין של כונדרוציטים, המאשרת התמיינות כונדרוגנית מוצלחת. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65767/65767fig05large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65767/65767fig06.jpg"> איור 6: זמן הכפלת תאים עבור תאי גזע במוך השן (DPSCs). איור זה ממחיש את עקומת הצמיחה של DPSCs לאורך זמן. תאים נזרעו בתחילה בצפיפות מסוימת, וספירות תאים נלקחו במרווחי זמן קבועים (מיוצגים על ציר x) כדי לעקוב אחר קצב ההתפשטות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65767/65767fig06large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65767/65767fig07.jpg"> איור 7: ביטוי סמן פני השטח של תאי גזע בתרבית DPSC. איור זה מדגים את הביטוי של סמני שטח ספציפיים ב- DPSCs. סמני תאי הגזע המזנכימליים CD44, CD90 ו- CD105 מראים רמות גבוהות של ביטוי, מה שמצביע על נוכחות של תכונות מזנכימליות בתאים אלה. לעומת זאת, הביטוי של סמנים המטופויטיים (CD34 ו-CD45) ומולקולת קומפלקס ההיסטו-תאימות העיקרית מסוג II (HLA-DR) הוא כמעט זניח, מה שמאשר את היעדרם של תאי שושלת המטופויטיים בתרבית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65767/65767fig07large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

פרוטוקול זה שם דגש על מיצוי, תרבית ושימור של תאי גזע רב-פוטנטיים ממוך השן באמצעות עיכול אנזימטי. בנוסף, הוא מדגים את הפוטנציאל שלהם להתמיין לאוסטאובלסטים, אדיפוציטים וכונדרוציטים, ומדגיש את חשיבות הדיוק והעקביות בתהליך.

In the realm of regenerative medicine and therapeutic applications, stem cell research is rapidly gaining traction. Dental pulp stem cells (DPSCs), which ...

התחל על ידי אבטחת השן האנושית שנעקרה במקומה באמצעות מלקחיים דנטליים. לאחר מכן חתכו את השן באמצעות דיסק יהלום המחובר לידית שיניים ולנוזל קירור מים. באמצעות מחפר שיניים, להסיר את רקמת מוך השן מן השן.לאחר מכן, השתמש בלהב כירורגי סטרילי כדי לטחון בזהירות את רקמת מוך השן לשברים קטנים. לאחר מכן הניחו את השברים האלה במטחנת רקמות קטנה עם PBS כדי ליצור תערובת הומוגנית. מעבירים את שברי הרקמה הטחונים לצינור של 15 מיליליטר ומעכלים אותם באמצעות תערובת של קולגן מסוג אחד ומפזרים.דוגרים על הרקמה בתערובת האנזימים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. לאחר הדגירה יש לנטרל את האנזימים. לאחר מכן, להעביר את הרקמה מעוכל צינור 15 מיליליטר לסובב ב 300 גרם במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.לאחר מכן יש להשליך בזהירות את הסופרנאטנט ולהשהות מחדש את הגלולה ב-DMEM טרי, בתוספת 10% עד 20% FBS. עבור תרבית תאים, בזהירות להעביר את תרחיף התא לצלוחית תרבית 25 סנטימטרים רבועים. לדגור על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב-5% פחמן דו-חמצני.לאחר יומיים-שלושה, באמצעות פיפטה סרולוגית סטרילית, שואפים בזהירות את המדיום ומחליפים אותו בתווך טרי. לאחר מכן, לאפיון DPSCs, הפעל את ציטומטר הזרימה ואשר את אופי תאי הגזע המזנכימליים של התאים המבודדים. ההתמיינות המוצלחת של DPSCs לאוסטאובלסטים, אדיפוציטים וכונדרוציטים מאמתת את האופי הרב-עוצמתי של DPSCs.זמן ההכפלה של DPSCs היה עקבי עם זה שדווח עבור תאי גזע מזנכימליים, מה שמרמז על אוכלוסיית תאים בריאה ומתרבה. ניתוח ציטומטריית הזרימה הראה כי רוב ה- DPSCs היו חיוביים עבור CD-90, CD-73 ו- CD-105, ואישרו את זהותם כתאי גזע מזנכימליים. יתר על כן, פחות מ -2% מהתאים היו חיוביים ל- CD-34, CD-45 ו- HLADR, מה שמאשר את היעדר זיהום משמעותי בתאי המטופויאט או אנדותל.

isolation-culture-characterization-dental-pulp-stem-cells-from-human

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

השיטה מתוארת בידוד ואפיון של תאי גזע אנושיים שיניים זולות (hDPSCs) באמצעות...

בידוד, אפיון והשוואתי התמיינות של תאי גזע אנושיים שיניים זולות נגזרה שיניים קבועות על ידי שימוש בשתי שיטות שונות

פרוטוקול זה מתאר את הנדסה גנטית ארעית של תאי גזע שיניים שחולצו מן הזקיק שיניים אנושיות. האסטרטגיה יישומית השינוי נגיפי יכול להיות בסיס לקידום מוצרים טיפוליים תאי גזע.

בידוד, אפיון, ההנדסה הגנטית מבוסס-MicroRNA, בתאי גזע אנושיים זקיק שיניים

אנו מספקים פרוטוקולים להערכה של גזע mesenchymal מבודד מן עיסת שיניים ואינטראקציות התא סרטן הערמונית המבוסס על שיטות תרבות שיתוף ישיר ועקיף. מצב בינוני וממברנות הטרנס-ובכן מתאימים לניתוח פעילות paracrine עקיף. זריעה באופן שונה מוכתמת. בתאים ביחד הוא מודל המתאים לאינטראקציה תא ישירה-cell.

בידוד תאי גזע mesenchymal זולה רקמות, תרבות משותפת עם תאים סרטניים ללמוד אינטראקציות שלהם

כאן אנו מציגים עבור בידוד תאי גזע זולה שיניים האנושי והתפשטות פרוטוקול על מנת להעריך את הביטוי חלבון פריאון בתהליך בידול עצביים.

בידוד, הפצת וביטוי חלבונים פריון במהלך עצביים התמיינות של תאי גזע אנושי זולה שיניים

מאמר זה מספק מדריך הדרגתי לביסוס תרבית ראשונית של תאי גזע במוך השן באמצעות שיטת תרבית explant ואפיון תאים אלה בהתבסס על הנחיות ICSCRT. התאים שבודדו על ידי פרוטוקול זה יכולים להיחשב כתאי גזע מזנכימליים ליישומים נוספים.

תרבית ראשונית של תאי גזע במוך השן

אדם בתאי גזע perivascular (PSCs) הם גזע הרומן הסלולרי בכיתה לשחזור רקמות השלד דומה בתאי גזע mesenchymal (MSCs). PSCs יכול להיות מבודד על ידי FACS (תא הקרינה מיון פעיל) מרקמת השומן רכש במהלך הליכים סטנדרטיים שאיבת שומן, בשילוב מכן עם פיגום osteoinductive להשיג היווצרות...

שימוש בתאי גזע לשחזור עצם Perivascular

פרוטוקול זה מתאר את הפיתוח, הרחבה, ובתחום ההדמיה vivo של תאי NK הנגזרים מhESCs וiPSCs.

פיתוח, הרחבה, ו<em&gt; בvivo</emתאי גזע pluripotent&gt; ניטור של תאי NK אדם מתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) ומושרה (iPSCs)

זה הפרוטוקול מתאר בפירוט הדור של תאי גזע pluripotent המושרה ללא טביעת רגל (iPSCs) מתאי הלבלב האנושי בתנאים ללא מזין, ואחריו עריכה באמצעות ribonucleoproteins CRISPR/Cas9 ואפיון שונה תא בודד שיבוטים.

דור יעיל ועריכה של נטול מזין IPSCs מתאי הלבלב האנושי באמצעות מערכת CRISPR-Cas9

אנו מציגים פרוטוקול לחקור את סמנים ביולוגיים של mRNA ביטוי של קרום העצם, נגזר תאים (שיתפקדו) הנגרמת על ידי ויטמין C (ויטמין C), 1,25-dihydroxy ויטמין D [1,25-(OH)2D3]. בנוסף, נוכל להעריך את היכולת של בקר קבוצת מחשבים ראשי להבדיל לתוך osteocytes, chondrocytes ו- adipocytes.

בידוד של גזע Mesenchymal מן האדם קרום העצם מכתשיים ואפקטים של ויטמין D על פעילות Osteogenic של תאים נגזר קרום העצם

מתכנות התא מחייב הקדמה של גנים מרכזיים, אשר לווסת ולתחזק את מצב התאים pluriפוטנטי. הפרוטוקול המתואר מאפשר היווצרות של תאי גזע מושרה pluripotent iPSCs) מושבות של האדם המעטפת הגוף ללא ויראלי/שילוב שיטות אך באמצעות RNAs שאינו משתנה (ננומטר-RNAs) בשילוב עם גורמי התחמקות החיסון הפחתת מנגנוני ההגנה הסלולריים.

בידוד של האדם למבוגרים פיברוכדורים מעור הבטן הדור של המושרה בתאי גזע Pluriפוטנטי באמצעות שיטה שאינה משלבת

למד בידוד ותרבית תאי גזע רב-פוטנציאליים ממוך השן באמצעות עיכול אנזימטי. השיטה מאפשרת אפיון ההבדלה לאוסטאובלסטים, אדיפוציטים וכונדרוציטים ליישומים ברפואה רגנרטיבית.

בידוד, תרבית ואפיון תאי גזע במוך השן משיני אדם נשירים וקבועים

גלה סרטונים נוספים