התגבשות ABCG5/G8 בסביבת ביצלה ליפידית לקריסטלוגרפיה של קרני רנטגן
25 באוגוסט 2023
פרוטוקול זה מתאר מערך להתגבשות של טרנספורטר הסטרול ABCG5/G8. ABCG5/G8 משוחזר לאופניים לצורך התגבשות טיפה תלויה. הפרוטוקול אינו דורש חומרים או מצעים מיוחדים, מה שהופך אותו לנגיש וקל להתאמה בכל מעבדה לקביעת מבנה החלבון באמצעות קריסטלוגרפיה בקרני רנטגן.
שלום, הצוות שלי חוקר סוג של אובדן חלבון לאורך קרום התא, ואנחנו מסתכלים על הקשר לרפואה ולביולוגיה. באופן ספציפי, אנו מסתכלים על חלבון מסוים אחד אשר ידרוש ATP כדי להניע את הפונקציה שלו, ואז זה, השם נקרא ATP binding cassette transporter. בפרט, אנו מסתכלים על המבנה הבסיסי שלהם פונקציה יחסים, ולאחר מכן להשתמש בזה כדי להבין הרבה מחלות כרוניות, במיוחד מחלות לב וכלי דם.
בשל מורכבות טיהור חלבוני הממברנה ויציבותם בטמפרטורות טבעיות, השגת גבישי חלבון תלת ממדיים היא האתגר המרכזי בתחום, והיא גם מגבילה את יישומי גילוי התרופות. הצוות שלנו ביסס שיטות בקריסטלוגרפיה cryo-EM וקרני רנטגן למחקרים מבניים של חלבונים טרנספורטרים ממברנה. ובעבר המעבדה שלנו גם פתרה את המבנה הגבישי של ההטרודימר המחייב ABCG5/G8 האנושי הראשון, הן במצב apo והן במצב הקשור לכולסטרול.
התוצאות שלנו יכולות לספק פריצת דרך בגילוי תרופות במולקולות קטנות או בייעוד מחדש של תרופות. השגת גבישי חלבון תלת-ממדיים יכולה גם לאפשר ניסויי השריה לקו-קריסטליזציה של קומפלקסים של חלבונים וליגנדים. המעבדה שלנו שואפת לקבוע את הבסיס המולקולרי של זיהוי שומנים וטרנסלוקציה על ידי חלבונים טרנספורטרים שומנים תלויי ATP.
כמו כן, אנו שואפים לבסס שיטות חדשות בפיתוח תרופות לחקר הדינמיקה המולקולרית וההיבטים המבניים של מובילי ABC.
סקירה כללית
פרוטוקול זה מפרט שיטה לגביש של נשאי הסטרול ABCG5/G8, תוך שימוש בביסלים (bicelles) לגביש בשיטת טיפה תלויה (hanging-drop). הגישה תוכננה להיות פשוטה וניתנת להתאמה לסביבות מעבדה שונות, במטרה להקל על קביעת מבנה החלבון באמצעות קריסטלוגרפיה של קרני X.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה מבנית
- חלבוני הובלה בממברנה
רקע
- ABCG5/G8 הוא נשא מסוג ATP-binding cassette המעורב בהסעת ליפידים.
- הבנת המבנה שלו חיונית להשגת תובנות לגבי מחלות כרוניות, ובמיוחד מצבים קרדיווסקולריים.
- אתגרים בטיהור חלבוני ממбраנה מעכבים מאמצים לגילוי תרופות.
- מחקרים קודמים הבהירו את מבנה הגביש של ABCG5/G8 במצבים שונים.
מטרת המחקר
- לחקור את הבסיס המבני של זיהוי ושיוּע (translocation) של ליפידים על ידי נשאי ABC.
- לפתח מתודולוגיות חדשות לגילוי תרופות הקשורות לחלבוני מעבר בממברנה.
- לאפשר ניסויי קוקריסטליזציה (cocrystallization) לצורך חקר אינטראקציות בין חלבון לליגנד.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- מודיפיקציה כימית של פראקציות חלבון באמצעות מתילציה רדוקטיבית.
- שימוש בעמודי ניקל NTA לניקוי חלבונים.
- הכנת תמיסת מלאי של B-cell לקריסטליזציה.
- שיטת הדיפוזיה של אדי טיפה תלויה להקמת קריסטליזציה.
תוצאות עיקריות
- הצטמצמות מוצלחת של ABCG5/G8 נצפתה בתוך שבוע עד שבועיים.
- גבישים המתאימים לאיסוף נתונים היו במידות של בדרך כלל 50 microns על 100 microns על 2 microns.
- המתודולוגיה מאפשרת מחקרים נוספים על אינטראקציות של ליפידים ופיתוח תרופות.
- התוצאות תורמות להבנת הקשר בין מבנה לתפקוד של נשאי ABC.
מסקנות
- הפרוטוקול מספק שיטה מהימנה לחקר המבנה של ABCG5/G8.
- הממצאים עשויים להקל על התקדמות בגילוי תרופות למחלות קשורות.
- עבודות עתידיות יתמקדו בבחינת הדינמיקה של מנגנוני הובלת ליפידים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית לדרג הניהולי
פענוח מבני ברזולוציה גבוהה של ABCG5/G8 בסביבה של ביסלה ליפידית (lipidic bicelle) נותן מענה לצוואר בקבוק קריטי בגילוי תרופות המכוונות לחלבונים ממברנליים. גישה זו מגבירה את הביטחון החוזי בתיקוף המטרה ותומכת בהפחתת סיכונים מכניסטיים עבור תיקי פיתוח המתמקדים בטרנספורטרים. גבישה אמינה של טרנספורטרים ממשפחת ABC מאפשרת עיצוב ליגנדים מונחה-מבנה ומאיצה קבלת החלטות בשלבים מוקדמים של סריקה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר חקירה של מנגנוני הובלה של ליפידים התלויים ב-ATP ברזולוציה אטומית.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות על ידי שימור הקונפורמציה הטבעית של החלבון בסביבות ביסל (bicelle).
- מסייע בהסרת סיכונים מכניסטיים עבור מטרות הובלה המעורבות במחלות כרוניות.
- מספק תבניות מבניות למיון תיקים מבוסס היפותזות.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- מספק גבישי חלבון שעברו תיקוף המתאימים לספיגת ליגנדים ומחקרי גביש משותף (co-crystallization).
- מסטנדרט את הכנת חלבוני ממברנה עבור תהליכי סריקה בהמשך השומרים על הדירות.
- מאפשר הערכה כמותית של אינטראקציות בין חלבון לליגנד באמצעות קריסטלוגרפיה של קרני X.
- תומך בפיתוח בדיקות הניתנות להרחבה עבור ספריות תרכובות המכוונות לנשאי חומרים (transporters).
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאים תובנות מבניות לתפקוד נשאים הרלוונטי למחלה במחקר קרדיווסקולרי.
- מספק רצף מגילוי מולקולרי ועד לתיקוף פרה-קליני של מודולטורים של נשאים.
- מפחית את הסיכון התרגומי על ידי מתן מידע למחקרי ביומרקרים ומנגנונים.
- מאפשר תכנון רציונלי של מודלים פרה-קליניים המבוססים על קשרי מבנה-תפקוד של נשאים.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד (Pipeline)
שיטת ההתגבשות מבוססת הביסלה (bicelle) זו משתלבת ברצף הגילוי, החל מאימות מטרה מוקדם, דרך זיהוי מובילים ועד למחקר פרה-קליני.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות ובבירור מסלולים עבור תפקוד של נשאי ABC.
- סריקה: מספק קריסטלים הניתנים לשחזור ובאיכות גבוהה עבור סריקה מבוססת מבנה והערכת ליגנדים.
- אנליטיקה: מאפשר קריאות מבניות כמותיות להשוואה בין מצבי apo ומצבים קשורים לליגנד.
- מחקר תרגומי: מקשר בין המבנה המולקולרי לבין פעילות נשא הרלוונטית למחלה והתאמה של סממנים ביולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה לשימוש חוזר עבור גביש של חלבוני ממברנה מגוונים בתוך תהליכי גילוי תרופות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף של מטרות נשאים.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של גבישוב חלבון ממברנה לצורך הדירות ויכולת הרחבה.
- ערך אסטרטגי: מספק מידע לקבלת החלטות של go/no-go ומשפר את יעילות ההון בתוכניות הממוקדות בנשאים.
- השפעה על פורטפוליו: מאפשר תיעודוף של מטרות נשאים מותאם סיכון וקידום של נכסים המונחים על ידי מבנה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטכניקות של ניקוי וגביש של חלבונים ממבנה
- מחייב גישה לתשתית אנליטית לעקיre של קרני X ואפיון חלבונים
- דורש סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי הכנת ביסלות (bicelles) וגביש
- ייתכן צורך בהתאמה עבור משפחות שנעים שונות או הרכבי ליפידים שונים
- יציבות החלבון ותנובתו עלולים להגביל את התפוקה והיכולת להרחבה (scalability) במערכות מסוימות
