בידוד מבוסס זיקה כימית של שלפוחיות חוץ-תאיות מנוזלים ביולוגיים לצורך פרוטאומיקה וניתוח פוספופרוטאומיקה
27 באוקטובר 2023
הפרוטוקול הנוכחי מספק תיאורים מפורטים לבידוד יעיל של שלפוחיות חוץ-תאיות בשתן באמצעות חרוזים מגנטיים פונקציונליים. יתר על כן, הוא מקיף ניתוחים מאוחרים יותר, כולל כתמים מערביים, פרוטאומיקה ופוספופרוטאומיקה.
אנו עובדים על גילוי סמנים ביולוגיים חוץ-תאיים מבוססי שלפוחית. צעד חשוב אחד הוא לבודד אותם בצורה יעילה וסלקטיבית. EVtrap, המבוססת על הפרדה מבוססת חרוזים מגנטיים, יכולה באמת לעזור לנו בכך שהיא מספקת תפוקה גבוהה, קלה לשימוש, ובמיוחד קלה ליישומים קליניים.
השתמשנו בפרוטוקול זה לגילוי חלבונים ובסמנים ביולוגיים של פוספופרוטאין עבור מחלות שונות כגון סרטן השד, סרטן הכליות ומחלת פרקינסון. סמן ביולוגי זה נגזר מנוזל ביולוגי. רכבים חשמליים יכולים לשמש באופן פוטנציאלי לביופסיות נוזליות, מה שיכול לשפר עוד יותר את האבחון הקליני ואת הטיפול.
כיום, הגישה הנפוצה ביותר לבידוד שלפוחית חוץ-תאית היא אולטרה-צנטריפוגה ומשקעים, אך שיטות אלה מוגבלות לבידוד משותף של מזהמים וגם יעילות נמוכה. לכן שיטת EVtrap שלנו תספק דרך יעילה יותר לבידוד כלי רכב חשמליים, שתאפשר שיטה רגישה יותר לשחזור וגם תועיל לניתוח במורד הזרם. אנחנו עובדים על שני דברים.
ראשית, אנו ממשיכים לפתח את השיטות והפרוטוקולים לבידוד רכב חשמלי וניתוח במורד הזרם, בפרט, ניתוח מבוסס גיבוי המוני. השני הוא שאנחנו בוחנים יישומים שונים בתחום הקליני בגלל היתרון של EVtrap.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מפרט את הבידוד היעיל של שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) משתן באמצעות חרוזי מגנט פונקציונליים. הוא מפרט בנוסף ניתוחים המשכיים כגון western blotting, פרוטאומיקה ופוספופרוטאומיקה, החיוניים לגילוי סמנים ביולוגיים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- גילוי סמנים ביולוגיים
- שלפוחיות חוץ-תאיות
רקע
- שלפוחיות חוץ-תאיות הן בעלות חשיבות רבה עבור ביופסיות נוזליות.
- הן יכולות לספק תובנות לגבי מחלות שונות.
- בידוד יעיל הוא קריטי עבור יישומים קליניים.
- חלבונים ופוספו-חלבונים מנוזלי גוף הם סמנים ביולוגיים פוטנציאליים.
מטרת המחקר
- להאיץ את גילוי הסמנים הביולוגיים.
- לבודד EVs ביעילות ובסלקטיביות.
- לשפר את האבחנה הקלינית והטיפול.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בידוד של שלפוחיות חוץ-תאיות משתן באמצעות חרוזי מגנט.
- Western blotting לאנליזה של חלבונים.
- פרוטאומיקה ופוספו-פרוטאומיקה לזיהוי סמנים ביולוגיים.
- שיטות בסביעון גבוה ליישומים קליניים.
תוצאות עיקריות
- בידוד מוצלח של EVs מנוזלים ביולוגיים.
- זיהוי חלבונים ופוספו-חלבונים הקשורים למחלות.
- הוכחת פוטנציאל ליישומים של ביופסיה נוזלית.
- סיוע בגילוי סמנים ביולוגיים לסוגי סרטן ולמחלת פרקינסון.
מסקנות
- הפרוטוקול משפר את יעילות בידוד ה-EV.
- הוא תומך בגילוי של סמנים ביולוגיים רלוונטיים מבחינה קלינית.
- פוטנציאל לשיפור אסטרטגיות אבחוניות וטיפוליות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
בידוד יעיל וסלקטיבי של שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) מנוזלים ביולוגיים מהווה נקודת מפנה קריטית לגילוי סממנים ביולוגיים מונחה-פרוטאומיקה במחקר ופיתוח בביופארמה. פרוטוקול חרוזי מגנט זה, המבוסס על זיקה כימית, מאפשר בידוד EVs בתפוקה גבוהה ובשחזוריות, ובכך תומך ישירות בניתוחים פרוטאומיים ופוספו-פרוטאומיים כמותיים, החיוניים לגילוי מוקדם של מחלות ולאישור מטרות טיפוליות. שיטה זו מגבירה את הביטחון החזוי בנתיבי פיתוח של סממנים ביולוגיים תרגומיים ותומכת בקידום תיקי פיתוח מותאמי סיכונים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר חקירה מעמיקה של חתימות חלבונים ופוספו-חלבונים הרלוונטיים למחלה מנוזלים ביולוגיים המופקים מחולים.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות באמצעות אספקת מטען EV באיכות גבוהה למחקרי מנגנון המשך.
- מסייע בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות פרופיל מולקולרי כמותי וניתן לשחזור.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספקת תכשירים סטנדרטיים של EV בדרגת טוהר גבוהה, המתאימים לזרימות עבודה של ספקטרומטריית מסות כמותית.
- משפרת את השחזוריות והרגישות של הבדיקה על ידי מזעור זיהומים ומקסום תפוקת ה-EV.
- מאפשרת הכנה ניתנת להרחבה (scalable) של דגימות EV עבור סריקה בספיקת תפוקה גבוהה ושימוש חוזר בפלטפורמה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתיישב עם אסטרטגיות של ביומרקרים תרגומיים על ידי לכידת תמונות מולקולריות בזמן אמת מנוזלים ביולוגיים קליניים.
- תומך ברצף מהשלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני באמצעות מתן אפשרות לניתוח עקבי של הפרוטאומה והפוספו-פרוטאומה של EV.
- מספק הפחתת סיכונים מכניסטית עבור ביומרקרים מועמדים לפני הפיתוח הקליני.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
פרוטוקול בידוד ה-EV זה משתלב בממשק שבין תגליות מוקדמות למחקר תרגומי, ומגשר בין הכנת הדגימה לבין ניתוח פרוטאומיקה ופוספו-פרוטאומיקה כמותי.
- ביולוגיה של הגילוי: מקלה על בדיקת היפותזות והבהרת מסלולים על ידי מתן גישה למטען מולקולרי המופק מ-EV.
- סריקה: מספקת דגימות EV כמותיות וניתנות לשחזור עבור פיתוח בדיקות המשך והערכת תרכובות.
- אנליטיקה: תומכת במדידה בעלת תפוקה גבוהה ובסיס סטטיסטי חסון של שכיחות חלבונים ופוספו-חלבונים בתנאים שונים.
- מחקר תרגומי: מאפשרת התאמה של סמני ביולוגים והמשכיות מדגימות חולים למודלים פרה-קליניים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת יכולת בידוד EV סטנדרטית וניתנת להרחבה עבור תוכניות מו"פ מגוונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בגילוי ביומרקרים.
- ערך תפעולי: מספק בידוד של EV סטנדרטי, הדיר וניתן להרחבה עבור תהליכי עבודה של פרוטאומיקה.
- ערך אסטרטגי: משפר את איכות קבלת ההחלטות (go/no-go) ואת יעילות ההון על ידי מתן אפשרות לאפיון מולקולרי חסון.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכון ובקידום של מועמדים לביומרקרים ולטיפולים תרופתיים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בפרוטאומיקה, פוספו-פרוטאומיקה וביולוגיה של EV לצורך ביצוע אופטימלי ופירוש הנתונים.
- דורש גישה למערכות הפרדה מבוססות חרוזי מגנט ולפלטפורמות של ספקטרומטריית מסות ברזולוציה גבוהה.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של טיפול בדגימות ושל פרוטוקולים אנליטיים לצורך שחזור.
- ניתן להתאמה לסוגים שונים של נוזלים ביולוגיים, אך עשוי לדרוש אופטימיזציה עבור מטריצות שונות.
- שחזור כמותי ורגישות תלויים בהקפדה יסודית על הפרוטוקול ובכיול אנליטי.
שאלות נפוצות בביו-פרמה
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:47
Extracellular Vesicle (EV) Isolation from Human Urine Samples Using the EVtrap Approach
3:39
Preparation of Dried Extracellular Vesicle (EV) Sample for Proteomics and Phosphoproteomics Analysis
6:31
Proteome/Phosphoproteome Analysis of the Extracellular Vesicle (EV) Samples Using LC‐MS/MS
