Name: העברה תת-רשתית של אבות פוטורצפטור שמקורם בתאי גזע עובריים אנושיים בעכברי RD10 (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-06T14:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: למדו את פרוטוקול ההעברה התת-רשתית של אבות פוטורצפטור שמקורם בתאי גזע עובריים אנושיים בעכברי RD10. שיטה זו מאפשרת יצירת תאים תוך 32 יום ומציעה פוטנציאל לשיקום ראייה במחלות רשתית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים ל-Wei Sheng Tan, Luanne Chiang Xue Yen, Xinyi Lee ו-Yingying Chung על מתן סיוע טכני להכנת 32 אבות קולטני אור שמקורם ב-HESC לאחר שימור בהקפאה. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענקים מהמועצה הלאומית למחקר רפואי לחוקר צעיר (NMRC/OFYIRG/0042/2017) ומענק תוכנית המחקר התחרותיתה-24 של הקרן הלאומית למחקר (CRP24-2020-0083) ל-H.G.T.

הניסויים in vivo נעשו בהתאם להנחיות ולפרוטוקול שאושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של SingHealth (IACUC) והצהרת האגודה לחקר הראייה והעיניים (ARVO) לשימוש בבעלי חיים בחקר העיניים והראייה. הגורים עברו דיכוי חיסוני מ-P17 (לפני ההשתלה) ל-P30 (לאחר ההשתלה) על ידי האכלתם במי שתייה המכילים ציקלוספורין (260 גרם לליטר).
1. הכנת יום 32 hESC אב photoreceptor נגזר לאחר cryopreservation
<ol><li>מדיום התמיינות פוטורצפטור טרום חם (PRDM) באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>אחזור קריוביאל המכיל תאי אב פוטורצפטור שמקורם ביום 32 hESC מחנקן נוזלי. יש לשמור על קרח יבש.</li>
	<li>הפשיר את cryovial ב 37 ° C באמבט מים במשך 3-5 דקות. השהה מחדש את היום 32 תאים ב 1 מ"ל של PRDM וצנטריפוגה ב 130 x גרם במשך 4 דקות.</li>
	<li>הסר את supernatant ו resuspend תאים ב 1 מ"ל של PRDM.</li>
	<li>מוציאים 10 μL מהתערובת לספירת תאים. יש לערבב תאים באמצעות 0.2% טריפאן כחול בהתאם להוראות היצרן. תערובת תאי פיפטה לתוך תא ספירת התאים מחליק. קבע את מספר התא ואת הכדאיות על-ידי מונה תאים אוטומטי.</li>
	<li>המשך לשלב הבא כאשר כדאיות התא היא מעל 70%. צנטריפוגה את מתלה התא הנותר ב 130 x גרם במשך 4 דקות. הסר את supernatant ו resuspend את גלולת התא ב PRDM בריכוז של 3 x 105 תאים / μL להשתלה.</li>
	<li>שימו לב לגושי תאים גלויים. יש להשהות מחדש גושי תאים שוב ושוב באמצעות קצה פיפטה של 10 μL בצינור המיקרופוגה עד שלא נצפה גוש תאים נראה לעין. טען לתוך מזרק הזרקת 33G כדי לצפות עבור אקסטרוזיה של תמיסת התא דרך המחט.</li>
</ol>2. העברה תת-רשתית של תאי גזע עובריים עובריים בעכברי RD10
<ol><li>הכנת בעלי החיים<ol><li>מרדימים את העכבר (P20, זכר/נקבה, 3-6 גרם) באמצעות שילוב של קטמין (20 מ"ג/ק"ג משקל גוף) וקסילזין (2 מ"ג/ק"ג משקל גוף) במזרק שחפת 1 מ"ל המחובר למחט 27G בגישה תוך צפקית. מתן זריקה תת עורית של buprenorphine (0.05 מ"ג / ק"ג) לעכבר כמו משכך כאבים מונע.</li>
		<li>לאחר מתן ההרדמה, להחדיר טיפה כל אחד של 1% tropicamide ו 2.5% phenylephrine להרחבת האישון. החל ג'ל עיניים על הקרנית כדי למנוע מהעין יובש וקטרקט הקשור להרדמה.</li>
		<li>הניחו את העכבר בכלוב ריק עד להרדמה מלאה. להעריך את רמת ההרדמה הנכונה על ידי צביטת כרית הכף ולאשר אם החיה אינה מגיבה לצביטה הקשה.</li>
		<li>כאשר העכבר מורדם לחלוטין, הניחו את בעל החיים על כרית חמה שנקבעה ב 38 מעלות צלזיוס.</li>
	</ol></li>
	<li>העברה תת-רשתית של התאים<ol><li>כדי להשתמש בגישה trans-vitreal pars plana עם יציאה אחת, כפי שנעשה כאן, בצע הזרקה תת-רשתית בסביבה סטרילית. השתמש במיקרוסקופ הפעלה זקוף עם נתיב אור ישיר כדי לבצע את ההזרקה.</li>
		<li>הכינו את מזרק הזכוכית 10 μL על ידי הסרת רכזת המחט. הרכיבו את המחט הקהה 33G על מזרק הזכוכית. קח את מכסה רכזת המתכת וחבר בזהירות את המחט על המזרק.</li>
		<li>יש לשטוף במים מזוקקים כדי לבדוק אם יש סימני דליפה ופטנט של המחט. רוקנו את המזרק והניחו אותו בצד בזהירות.</li>
		<li>הניחו את העכבר המרדים על כרית, כאשר העין המטפלת מביטה היישר אל מטרת המיקרוסקופ. החל את 0.5% proparacaine hydrochloride ולחכות 30 שניות. החל 150 μL של ג'ל עיניים על העין ומניחים כיסוי עגול להחליק על זה.</li>
		<li>בצע בדיקה גסה של העין על ידי התבוננות בקרנית, הקשתית, האישון, העדשה והלחמית. דרך האישון, דמיינו את הפונדוס של עין העכבר על ידי התאמת מישור המוקד. כוונן את הראש עד שראש הראייה ממוקם במרכז האישון וצמצם את תנועת הראש על ידי מיקום נכון על הכרית.</li>
		<li>הקש בעדינות על בסיס הצינור עם תאי גזע עובריים מספר פעמים כדי לקבל מתלה תאים אחיד. על ידי שימוש מזרק מיקרוליטר זכוכית 10 μL עם מחט קהה 33G, למשוך 2 μL של תאים/מדיה. משכו את התאים ממש לפני ההזרקה כדי למנוע התיישבות תאים/גושים במזרק.</li>
		<li>באמצעות מחט חד פעמית 30G, לעשות פצע סקלרקטומיה 2 מ"מ מאחורי הלימבוס. שמור על זווית המחט על ~ 45° כדי למנוע נגיעה בעדשה. לאחר קצה המחט הוא דמיינו בעין, בעדינות למשוך את המחט. יש להשליך את המחט לפח החד לאחר השימוש כדי למנוע פגיעה בדקירת המחט.</li>
		<li>קח את מזרק הזכוכית והכנס את המחט הקהה לתוך פצע סקלרקטומיה. מבלי לגעת בעדשה, מקדמים את המחט הקהה עד שהיא מגיעה לרשתית הנגדית של פצע הכניסה. ודא שאזור ההזרקה נקי מכלי דם מרכזיים ברשתית כדי למנוע דימום.</li>
		<li>חודרים בעדינות לרשתית עד שנראה ענף לחץ על לובן העין. שמור את הקצה הקהה של המחט במקביל לובן העין כדי למנוע דליפה של התאים לתוך חלל הזגוגית.</li>
		<li>הזריקו באיטיות 2 מיקרוליטר של תרחיף תאים או מדיה PRDM (בקרה) לחלל התת-רשתית תוך שמירה על לחץ עדין על המזרק. עם זריקה מוצלחת, bleb גלוי (כלומר, רשתית מוגבהת עם מתלה התא / מדיה בתוכה) צריך להיווצר במקום ההזרקה. הערה: יש להשתמש רק בלחץ עדין במהלך ההזרקה כדי למנוע קריעה ברשתית וחסימה של התאים בקצה המחט.</li>
		<li>לאחר אישור bleb, לחכות 10 שניות כדי לתת לתאים להתיישב. משכו בעדינות את המחט מהעין.</li>
	</ol></li>
	<li>טומוגרפיה קוהרנטית אופטית תוך ניתוחית (OCT) סריקה של bleb (אופציונלי)<ol><li>מקם את עין העכבר כדי לדמיין את הפצע מתחת למיקרוסקופ על ידי הזזת הראש באיטיות. אבטח את התנוחה על ידי החזקת הראש בעדינות. אין צורך בהרחבת אישונים נוספת. אין להסיר את החלקת הכיסוי ואת הג'ל על העין. זה נותן מדיה אופטית ברורה כדי לדמיין את bleb.</li>
		<li>בצע OCT תוך ניתוחי באמצעות פונקציית iOCT המובנית של מיקרוסקופ ההפעלה.</li>
		<li>לחץ על האפשרות קוביה במסך OCT ומקם את אזור הסריקה על ה- bleb על ידי לחיצה על לחצני החץ . התאם את ה-OCT על-ידי הזזה מרכוז ומיקוד לקבלת איכות OCT מיטבית. לחץ על לכידה/סריקה כדי לקבל את סריקת OCT של אזור ה-bleb. סקור את התמונות כדי לבדוק את איכות הסריקות.</li>
	</ol></li>
	<li>שחזור<ol><li>הסר את הכיסוי להחליק ולנקות את הג'ל מן העין עם גזה. יש למרוח משחה אנטיביוטית פעם אחת לאחר ההזרקה כדי למנוע זיהום.</li>
		<li>לאפשר לבעל החיים להתאושש מהרדמה תחת אור חם עד שהוא חוזר להכרה מספקת כדי לשמור על עצם החזה ולחזור לכלוב הביתי. יש לעקוב אחר בעל החיים במשך 3 ימים לפחות לאחר ההזרקה לאיתור סימני דלקת, זיהום ומצוקה. הערה: האור החם של 150 ואט צריך להיות במרחק של לפחות 30 ס"מ מכלוב בעלי החיים, ויש לנקוט משנה זהירות כדי למנוע פגיעה בכוויה.</li>
		<li>יש לבצע זריקה תת עורית של בופרנורפין (0.05 מ"ג/ק"ג) 8 שעות למשך יום אחד או לפי המלצת הווטרינר. אם נצפתה דלקת או זיהום בעין, יש להתייעץ עם וטרינרי מקצועי לקבלת טיפול מתאים.</li>
	</ol></li>
	<li>ניקוי ועיקור המכשירים<ol><li>שטפו את מזרק המיקרוליטר מזכוכית 10 μL ואת המחט הקהה 33G באתנול 100% 10x. שטפו את האתנול על ידי הבהוב המזרק במים מזוקקים.</li>
		<li>מפרקים את מזרק הזכוכית ואת המחט. יבש את המזרק לאחסון.</li>
	</ol></li>
</ol>

מראה מחייה: טיפול בתאי גזע לניוון הרשתית

Hwee Goon Tay הוא מייסד שותף של Alder Therapeutics AB. מחברים אחרים מצהירים שאין אינטרסים מתחרים.

ההזרקה התת-רשתית שימשה להשתלת תרחיף תאים לטיפול ב-RPE ובמחלות רשתית 23,25,26,27,28,31,40. גישה זו חיונית ביותר במחקרי מכרסמים לא רק עבור השתלות תאים וגישות ריפוי גנטי, אלא גם כדי להעריך תרכובות טיפוליות חדשניות למחלות רשתית. כיום, שלושה מסלולים עיקריים משמשים להעברת תאים או AAVs לחלל התת-רשת...

מחלות רשתית תורשתיות וניוון מקולרי הקשור לגיל מובילות לאובדן תאים קולטי אור ובסופו של דבר לעיוורון. הפוטורצפטור ברשתית הוא שכבת המקטע החיצוני של הרשתית המורכבת מתאים מיוחדים האחראים על פוטוטרנסדוקציה (כלומר, המרת אור לאותות עצביים). תאי הפוטורצפטור של המוט והחרוט סמוכים לשכבת הפיגמנטציה ברשתית (RPE)1. טיפול בתחליפי תאים קולטי אור כדי לפצות על אובדן התא היה גישה טיפולית מתפתחת ומתפתחת. תאי גזע עובריים (ESCs)2,3,4, תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) שמקורם בתאי RPE, ותאי אב ברשתית (RPCs)4,5,6,7,8 שימשו לשחזור תאי קולטני האור הפגועים. החלל התת-רשתית, חלל מוגבל בין הרשתית ל-RPE, הוא מיקום אטרקטיבי להפקדת תאים אלה כדי להחליף תאים קולטי אור פגומים, RPE ותאי מולר בשל קרבתו 9,10,11.
טיפולים גנטיים ותאיים מנצלים את החלל התת-רשתית לרפואה רגנרטיבית למחלות רשתית שונות במחקרים פרה-קליניים. זה כולל משלוח עותקים פונקציונליים של הגן או כלי עריכת הגנים בצורה של טיפול אוליגונוקלאוטיד אנטי-סנס 12,13 או CRISPR/Cas9 או עריכה בסיסית באמצעות אסטרטגיה מבוססת וירוס הקשור לאדנו (AAV) 14,15,16, השתלת חומרים (למשל, גיליון RPE, תותבות רשתית 17,18,19) ואורגנואידים רשתית ממוינים שמקורם בתאי גזע 20,21,22 לטיפול במחלות רשתית ו- RPE. ניסויים קליניים באמצעות hESC-RPE31 בחלל התת-רשתית לטיפול באמאורוזיס מולד Leber הקשור ל-RPE65 (LCA)23,24, אכרומטופסיה25-מקושרת CNGA3, רטיניטיס פיגמנטוזה26 הקשורה ל-MERTK, כורואידרמיה 27,28,29,30 הוכחו כגישה יעילה. הזרקה ישירה של תאים לקרבת האזור הפגוע משפרת מאוד את הסיכוי להתיישבות תאים באזור המתאים, אינטגרציה סינפטית, ובסופו של דבר שיפור חזותי.
למרות שהזרקה תת-רשתית במודלים אנושיים ובעלי עיניים גדולות (כלומר, חזיר 32,33,34,35, ארנב 36,37,38,39,40 ופרימט לא אנושי 41,42,43) הוקמה, הזרקה כזו במודל מורין עדיין מאתגרת בשל האילוץ של גודל גלגל העין ועצום עדשה הכובשת את עין העכבר 44,45,46. עם זאת, מודלים מהונדסים גנטית זמינים רק בבעלי חיים קטנים ולא בבעלי חיים גדולים (כלומר, ארנבים ופרימטים לא אנושיים), ולכן הזרקה תת-רשתית בעכברים מפנה את תשומת הלב לחקר גישות טיפוליות חדשניות בהפרעות גנטיות ברשתית. שלוש גישות עיקריות משמשות להעברת תאים או AAV לחלל התת-רשתית, כלומר המסלול הטרנס-קרני, המסלול הטרנס-סקלרלי ומסלול הפארס פלנה (ראו איור 2). מסלולים טרנס-קרניים וטרנס-סקלרליים קשורים להיווצרות קטרקט, סינכיה, דימום כורואידי וריפלוקס מאתר ההזרקה 11,44,45,47,48,49. אימצנו את גישת pars plana כהדמיה ישירה של תהליך ההזרקה, וניתן להשיג את אתר ההזרקה בזמן אמת תחת המיקרוסקופ.
לאחרונה תיארנו שיטה שיכולה להתמיין תאי גזע עובריים אנושיים (hESC) לאבות קולטי אור בתנאים נטולי קסנו, המוגדרים כימית באמצעות איזופורם למינין LN523 ספציפי לרשתית אנושית רקומביננטית. מאחר שנמצא כי LN523 נמצא ברשתית, שיערנו כי ניתן לשחזר את נישת המטריקס החוץ-תאי של הרשתית האנושית במבחנה ובכך לתמוך בהתמיינות קולטני האור מתאי גזע עובריים עובריים36. ניתוח תעתיק חד-תאי הראה כי אבות קולטי אור המבטאים במשותף הומיאובוקס מוט חרוט ומחלימים נוצרו לאחר 32 יום. מודל עכבר מוטנטי של ניוון רשתית 10 (rd10) המחקה רטיניטיס פיגמנטוזה אנושית אוטוזומלית שימש להערכת היעילות של 32 hESC שמקורם באבות פוטורצפטור in-vivo. תאי האב של קולטני האור שמקורם ב-hESC הוזרקו לחלל התת-רשתית של עכברי RD10 ב-P20, שם תפקוד לקוי של קולטני האור והתנוונותו נמשכים36. כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט להכנת אבות קולטי אור שמקורם ב- hESC לאחר הקפאה והעברה לחלל התת-רשתית של עכברי rd10 . שיטה זו יכולה לשמש גם למתן AAVs, תרחיפים תאים, פפטידים או כימיקלים לתוך החלל התת-רשתית בעכברים.

<table><tbody><tr><td>0.3% טוברמיצין</td><td>נוברטיס</td><td>NDC &nbsp; 0078-0813-01</td><td>טוברקס (3.5 גרם)</td></tr><tr><td>0.3% טוברמיצין ו-0.1% דקסמתזון</td><td>נוברטיס</td><td>NDC 0078-0876-01</td><td>טוברדקס (3.5 גרם)</td></tr><tr><td>0.5% פרופרקאין הידרוכלוריד</td><td>אלקון</td><td>NDC 0998-0016-15</td><td>0.5% אלקאין (15 מ"ל)</td></tr><tr><td>1 מ"ל מזרק טוברקולין</td><td>טורמו</td><td>SS01T2713</td><td></td></tr><tr><td>1% טרופיקמיד</td><td>אלקון</td><td>NDC 0998-0355-15</td><td>1% מידריאציל (15 מ"ל)</td></tr><tr><td>2.5% פנילפרין הידרוכלוריד</td><td>אלקון</td><td>NDC 0998-0342-05</td><td>2.5% מידפרין (5 מ"ל)</td></tr> <tr><td>צלחת תרבית רקמות 24 בארות</td><td>Costar</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>30 גרם מחט חד פעמית</td><td>בקטון דיקינסון (BD)</td><td>305128</td><td></td></tr><tr><td>33 גרם, מחטים קהות באורך 20 מ"מ</td><td>המילטון</td><td>7803-05</td><td></td></tr><tr><td>מונה תאים אוטומטי</td><td>NanoEnTek</td><td>דגם: איב</td><td></td></tr><tr><td>B27 ללא ויטמין A</td><td>Life Technologies</td><td>12587001</td><td>2%36</td></tr><tr><td>Buprenorphine</td><td>Ceva</td><td></td><td>וטרינר וטרינרי (0.3 מ"ג/מ"ל)</td></tr><tr><td>CKI-7</td><td>Sigma</td><td>C0742</td><td>5 ומיקרו; M36</td></tr><tr><td>ציקלוספורין</td><td>נוברטיס</td><td></td><td>260 גרם/ליטר במי שתייה</td></tr><tr><td>יום 32 תאי אב קולטני אור שמקורם ב-hESC</td><td>בית הספר לרפואה DUKE-NUS תאי</td><td></td><td>גזע עובריים אנושיים מתמיינים במשך 32 יום. ראה פרוטוקול באסמכתא 36.</td></tr><tr><td>גזה</td><td>ווינר תעשיות בע"מ</td><td>1SNW475-4</td><td></td></tr><tr><td>גלזגו מינימום חיוני בינוני</td><td>Gibco</td><td>11710&ndash&ndash; 035</td><td></td></tr><tr><td>hESC קו תאים H1</td><td>מכון המחקר WiCell</td><td>WA01</td><td></td></tr><tr><td>גורם נוירוטרופי שמקורו במוח אנושי (BDNF)</td><td>Peprotech</td><td>450-02-50</td><td>10 ng/mL36</td></tr> <tr><td>גורם נוירוטרופי ריסני אנושי (CNTF)</td><td>Prospec-Tany Technogene</td><td>CYT-272</td><td>10 ng/mL36</td></tr><tr><td>קטמין הידרוכלוריד (100 מ"ג/מ"ל)</td><td>Ceva Sant&eacute; Animale</td><td>KETALAB03</td><td></td></tr><tr><td>LN-521</td><td>Biolamina</td><td>LN521-02</td><td>1 ומיקרו; g36</td></tr><tr><td>mFreSR</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5854</td><td></td></tr><tr><td>מזרק זכוכית מיקרוליטר (10 מ"ל)</td><td>המילטון</td><td>7653-01</td><td></td></tr><tr><td>N-[N-(3,5-difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-פנילגליצין t-בוטיל אסטר (DAPT)</td><td>Selleckchem</td><td>S2215</td><td>10 ומיקרו; תוסף M36</td></tr><tr><td>N-2</td><td>Life Technologies</td><td>A13707-01</td><td>1%36</td></tr><tr><td>חומצות אמינו לא חיוניות (NEAA)</td><td>Gibco</td><td>11140&ndash; 050</td><td>1x36</td></tr><tr><td>NutriStem XF Media</td><td>Satorius</td><td>05-100-1A</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ הפעלה</td><td>Zeiss</td><td>OPMI LUMERA 700</td><td>עם פונקציית iOCT מובנית</td></tr><tr><td>PRDM (מדיום התמיינות קולטני אור, 50 מ"ל)</td> <td>בית הספר לרפואה DUKE-NUS</td> ראה הרכב מדיה36.<td></td><td> בינוני בסיסי, 10 ומיקרו; M DAPT, 10 ננוגרם/מ"ל BDNF, 10 ננוגרם/מ"ל CNTF, 0.5 ומיקרו; M חומצה רטינואית, 2% B27 ו-1% N2. מדיום בסיסי: 1x GMEM, 1 מ"מ נתרן פירובט, 0.1 מ"מ B-מרקפטואתנול, 1x חומצות אמינו לא חיוניות (NEAA).</td></tr><tr><td>פירובט</td><td>גיבקו</td><td>11360&ndash; 070</td><td>1 mM36</td></tr><tr><td>Rd10 עכברי</td><td>מעבדת ג'קסון</td><td>B6. עכברי CXB1-Pde6brd10/J</td><td>מין: זכר/נקבה, גיל: P20 (זריקה), משקל: 3-6 גרם&nbsp;</td></tr><tr><td>חומצה רטינואית</td><td>Tocris Bioscience</td><td>0695/50</td><td>0.5 ומיקרו; M36</td></tr><tr><td>תלוש כיסוי עגול (12 מ"מ)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-80</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Sigma</td><td>S4317</td><td>0.5 & ג'ל M36</td></tr><tr><td>Vidisic (10 גרם)</td><td>ד"ר גרהרד מאן</td><td></td><td></td></tr><tr><td>קסילזין הידרוכלוריד (20 מ"ג/מ"ל)</td><td>Troy Laboratories</td><td>LI0605</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoethanol</td><td>Life Technologies</td><td>21985&ndash; 023</td><td>0.1 מ"מ36</td></tr></tbody></table>

העברה תת-רשתית של אבות פוטורצפטור שמקורם בתאי גזע עובריים אנושיים בעכברי rd10

Sub-Retinal Delivery of Human Embryonic Stem Cell Derived Photoreceptor Progenitors in rd10 Mice

רגנרציה של תאים קולטי אור באמצעות תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים היא טיפול מבטיח לטיפול במחלות רשתית תורשתיות והזדקנות בשלבים מתקדמים. הראינו שמטריצת איזופורם למינין ספציפית לרשתית רקומביננטית אנושית מסוגלת לתמוך בהתמיינות של תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) לאבות קולטי אור. בנוסף, הזרקה תת-רשתית של תאים אלה הראתה גם שיקום חלקי במודלים של מכרסמים וארנבים rd10 . הזרקה תת-רשתית ידועה כשיטה מבוססת המשמשת להעברת תרכובות פרמצבטיות לתאי קולטני האור ולשכבת אפיתל פיגמנט ברשתית (RPE) של העין בשל קרבתה לחלל המטרה. הוא שימש גם להעברת וקטורים נגיפיים הקשורים באדנו לחלל התת-רשתית לטיפול במחלות רשתית. ההעברה התת-רשתית של תרכובות ותאים פרמצבטיים במודל מורין מאתגרת בשל האילוץ בגודל גלגל העין של מורין. פרוטוקול זה מתאר את ההליך המפורט להכנת תאי אב קולטני אור שמקורם בתאי גזע עובריים עובריים (hESC) להזרקה ואת טכניקת ההעברה התת-רשתית של תאים אלה בעכברי רטיניטיס פיגמנטוזה גנטיים, עכברי RD10 . גישה זו מאפשרת טיפול תאי לאזור הממוקד, במיוחד לשכבה הגרעינית החיצונית של הרשתית, שם מתרחשות מחלות המובילות לניוון קולטני אור.

מזרק הזכוכית בגודל 10 μL הורכב בהתאם להוראות היצרן (איור 1), והמחט הקהה ששימשה להעברת התרחיף/מדיה של התא מוצגת באיור 1B. גישות שונות להזרקה תת-רשתית מודגמות באיור 2. אנו מתארים את גישת pars plana בפרוטוקול הזה (איור 2C). המחט הקהה שהורכבה על מזרק זכוכית הוחדרה דרך פצע סקלרוטומי וניגשה לחלל התת-רשתית ברחבי העולם. כפי שניתן לראות באיור 3A, מסלול המחט, החדירה דרך הרשתית והעברת...

אנו מתארים פרוטוקול מפורט להכנת תאי אב קולטי אור שמקורם בתאי גזע עובריים עובריים (photoreceptor) שמקורם בהקפאה, ואת ההעברה התת-רשתית של תאים אלה בעכברי RD10 .

העברה תת-רשתית של אבות פוטורצפטור שמקורם בתאי גזע עובריים אנושיים בעכברי RD10

Regeneration of photoreceptor cells using human pluripotent stem cells is a promising therapy for the treatment of both hereditary and aging retinal ...

המחקר שלי מתמקד בפיתוח טיפול מבוסס תאי גזע בשלבים מתקדמים של מחלות רשתית הגורמות לניוון קולטני אור. מטרת המחקר שלנו היא להחליף את אובדן קולטני האור בחולים עם אבות פוטורצפטור בטוחים מבחינה קלינית ומתפקדים במטרה לשפר את חדות הראייה שלהם או אפילו לשחזר את ראייתם. המודל הפרה-קליני העיקרי הוא עכברים, אך גלגל העין הקטן שלהם מקשה על הזרקת חומרים, במיוחד מתחת לרשתית.פיתוח המיומנות לביצוע הזרקות תת רשתית מוצלחות דורש סבלנות והתמדה. פיתחנו בהצלחה בסיס למינין לשיטת התמיינות הקולטן המסוגל לייצר אבות פוטורצפטור תוך 32 יום. ההשתלות התת-רשתיות של תאי אב פוטורצפטורים אלה במכרסמים הביאו לקישוריות סינפטית בין החורים והשתל בעיניים.זה הוביל לשחזור חזותי חלקי. הגישה שלנו פשוטה, ההדמיה הנכונה מסייעת למנתח לטפל במחט לאזור העניין.

sub-retinal-delivery-human-embryonic-stem-cell-derived-photoreceptor

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

טכניקה ניתוחית זו ממחישה את הזריקה של וקטורים בריפוי גנטי ותאי גזע לתוך חלל subretinal של עין העכבר.

הזרקת subretinal של וקטורי ריפוי גנטי ותאי גזע לעיניים המאוסות

השתלת תאים מייצגת אסטרטגיה לטיפול ניוון רשתית המאופיינת על ידי אובדן פוטורצפטור. כאן אנו מתארים שיטה להעשרת פוטורצפטורים הניתנים להשתלה והשתלתם התת-קרקעית בעכברים בוגרים.

השתלת Subretinal של MACS מטוהרים פוטורצפטור קודמן תאים לתוך הרשתית עכבר בוגר

כאן אנו מציגים פרוטוקול מקובל על הקהילה בפורמט מולטימדיה להזרקה תת-רשתית של תאי RPE בחולדות ועכברים. גישה זו יכולה לשמש לקביעת פוטנציאל הצלה, פרופילי בטיחות ויכולות הישרדות של תאי RPE מושתלים עם השתלה במודלים של ניוון רשתית בבעלי חיים.

ביצוע subretinal זריקות במכרסמים כדי לספק תאי הרשתית פיגמנט האפיתל בהשעיה

הזרקת subretinal הוחל נרחב במחקרים פרה של טיפול בתאי גזע חלופי עבור ניוון מקולרי הקשור לגיל. במאמר זה דמיינו, נתאר טכניקה הזרקת subretinal פחות מסוכן, הדירים בדיוק ששונתה באמצעות הגישה הטרנס-scleral להעביר תאים לתוך עיניו חולדה.

פיתוחו של פרוטוקול מעודן עבור השתלת Subretinal טרנס-scleral של תאי אפיתל הפיגמנט ברשתית האנושי בעיניים עכברוש

תאים אפיתל הפיגמנט ברשתית יכול לשמש כטיפול חלופי תא עבור הטופס מתקדם של ניוון מקולרי הקשור לגיל יבש. פרוטוקול זה מתאר את הדור של מודל גדול-עיניים של אטרופיה גיאוגרפית והשתלות את subretinal של תאי אפיתל כנגד האדם מתחלקים נגזר תאי הפיגמנט ברשתית לתוך מודל זה של המחלה.

השתלת subretinal של תאי גזע עובריים אנושיים לתאי האפיתל של פיגמנט הרשתית נגזר למודל גדול-עיניים של אטרופיה גיאוגרפית

אנו מתארים שיטה להנדס רקמת רשתית מורכב של תאים אפיתל הפיגמנט ברשתית שמקורם בתאי גזע pluripotent אנושית ותרבותית על גבי קרום מי השפיר האנושי והכנה שלו הרכבה במודלים של בעלי חיים.

הנדסת רקמות אפיתל הפיגמנט ברשתית השתלת-מתאים נגזר תאי גזע עובריים

מוצגת כאן טכניקה כירורגית להשתלת רקמת רשתית שמקורה בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSC) בחלל התת-רשתית של מודל בעל חיים גדול.

השתלה תת-רשתית של רקמת רשתית שמקורה בתאי גזע עובריים אנושיים במודל של בעלי חיים גדולים אצל חתולים

פרוטוקול זה מציג גישה טרנס-סקלרלית מונחית ראייה טרנס-אישונים להעברה בטוחה ומדויקת של שתלים תאיים תת-רשתית, עם שיעור נמוך של סיבוכים כירורגיים, במושתלי עכבר עם או בלי ניוון רשתית.

השתלה טרנס-סקלרלית מונחית אישונים של שתלים תת-רשתית במודל עכבר ניוון רשתית

השיטה מתוארת להפיץ גידולים אנושיים בעכברים רטינובלסטומה. תאים סרטניים הם מוזרק ישירות לתוך עיניו של עכברים חסר החיסונית. גידולים משניים הוקמו בהצלחה הן באמצעות תאים שנקטפו ישירות גידולים אנושיים tumorspheres תרבותי.

הקמה התפשטות של גידולים רטינובלסטומה האדם עכברים החיסון לקויה

גזע השתלת תאים ב במבחנה דגם סימולציה איסכמיה / reperfusion

למדו את פרוטוקול ההעברה התת-רשתית של אבות פוטורצפטור שמקורם בתאי גזע עובריים אנושיים בעכברי RD10. שיטה זו מאפשרת יצירת תאים תוך 32 יום ומציעה פוטנציאל לשיקום ראייה במחלות רשתית.

העברה תת-רשתית של אבות פוטורצפטור שמקורם בתאי גזע עובריים אנושיים בעכברי RD10

גלה סרטונים נוספים