Name: קציר ותרבית ראשונית של תאי אנדותל לימפטיים Leptomeningeal (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-08T14:55:00.000+00:00
Duration: 6 min 44 s
Description: למדו פרוטוקול לקציר ותרבית תאי אנדותל לימפטיים ממוח עכברים עם טוהר של מעל 95%. שיטה זו מאפשרת חקר תפקודים תאיים ומשמעות קלינית במערכת העצבים המרכזית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחקר נתמך על ידי מענקים מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (81960226, 81760223), הקרן למדעי הטבע של מחוז יונאן (202001AS070045, 202301AY070001-011), וקרן המחקר המדעי של מחלקת החינוך של מחוז יונאן (2023Y0784).

מחקר זה קיבל אישור מוועדת האתיקה של ניסויים בבעלי חיים באוניברסיטה הרפואית של קונמינג (kmmu20220945). כל הניסויים עמדו בהנחיות שנקבעו לטיפול בבעלי חיים. תאי אנדותל לימפטיים Leptomeningeal (LLECs) נלקחו מעכברים זכרים C57Bl/6J בגילאי 6-8 שבועות ובמשקל בין 20-25 גרם. עכברים אלה נרכשו מהאוניברסיטה הרפואית של קונמינג בקונמינג, סין. ההליך הניסיוני כולו נערך בתנאים סטריליים קפדניים. כל שלבי הצנטריפוגה מבוצעים בטמפרטורת החדר, אלא אם צוין אחרת.
1. הכנת ריאגנטים ומכשירים
הערה: כל השלבים הכוללים פתרונות חייבים להתבצע בתוך ארון סיכונים ביולוגיים סוג II.
<ol><li>הכינו את מאגר הכביסה על ידי ערבוב מלח חוצץ פוספט (PBS) עם סידן ומגנזיום, 10% סרום בקר עוברי (FBS) ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין (P/S) (ראו טבלת חומרים). שמור על חיץ זה קר ב 4 °C. חשוב להכין אותו טרי ביום השימוש ולנטרל את החיץ.</li>
	<li>הכינו את אנזימי העיכול על ידי שילוב של 10 מ"ל PBS (ללא סידן ומגנזיום) עם 2 מ"ל של 0.25% טריפסין, 1 מ"ל של 20 מ"ג/מ"ל פפאין, ו-200 מיקרוליטר של 1 מ"ג/מ"ל קולגנאז I (ראו טבלת חומרים). הערה: הקפד להשתמש ב- aliquots של אמצעי אחסון מתאימים כדי למנוע מחזורי הקפאה-הפשרה חוזרים ונשנים. אחסן aliquots אלה ב -20 °C.</li>
	<li>הכינו את מדיום התרבית על ידי שימוש בערכת מדיום גידול תאי אנדותל הזמינה מסחרית, הכוללת VEGF-C (100 ננוגרם/מ"ל) ו-1% P/S (ראו טבלת חומרים).</li>
	<li>הכינו את מאגר העצירה על ידי השלמת מדיום הנשר המותאם של דולבקו (DMEM) עם 10% FBS כדי לעצור את תהליך העיכול.</li>
	<li>הכינו כלי ניתוח סטריליים: מכשירים אלה צריכים לכלול מספריים, פינצטה משוננת ופינצטה עדינה.</li>
</ol>2. ציפוי בקבוקון
<ol><li>מצפים את בקבוק T25 בתמיסת פיברונקטין 100 מיקרוגרם/מ"ל (ראו טבלת חומרים) ודגרים למשך הלילה ב-37°C. לפני השימוש יש להסיר את תמיסת הציפוי באמצעות פיפטה.</li>
	<li>שטפו את הבקבוק שלוש פעמים עם PBS, לאחר מכן שאפו את PBS, ואפשרו לבקבוק T25 להתייבש באוויר.</li>
</ol>3. דיסוציאציה Leptomeninges
הערה: השתמש תמיד במאגרים ותמיסות מקוררים מראש בטמפרטורה של 4°C.
<ol><li>מרדימים את העכברים בשאיפה עודפת של 4% איזופלורן ולאחר מכן מקריבים אותם על ידי עריפת ראש מהירה באמצעות מספריים שנוקו בעבר עם 70% אתנול.</li>
	<li>יש לחתוך בזהירות את העור לאורך קו האמצע, החל מהפתח בחלק האחורי של הגולגולת ועד לאזור הקדמי.</li>
	<li>הסר בעדינות את הגולגולת, הרים אותה בעדינות עם המספריים כדי למנוע נזק leptomeninges, להבטיח את המוח כולו, כולל leptomeninges, מתקבל.</li>
	<li>השקיעו את כל המוח במאגר כביסה ושטפו אותו בעדינות כדי להסיר דם משטח.</li>
	<li>מעבירים את המוח לצלחת פטרי סטרילית ללא קיצוץ, ומחלצים את הלפטומנינגים מפני השטח של המוח באמצעות פינצטה עדינה תחת מיקרוסקופ.</li>
	<li>חותכים את רקמת הלפטומנינגס לשברים באמצעות מיקרו-מספריים סטריליים.</li>
</ol>4. Leptomeninges עיכול אנזימטי
<ol><li>מוסיפים 10 מ"ל של תערובת האנזימים (שלב 1.2) למקטעים ודגרים בטמפרטורה של 37°C למשך 15 דקות. יש להתסיס בעדינות כדי להבטיח שהשברים יתנתקו מתחתית הצינור. לאחר מכן, להוסיף 10 מ"ל של חיץ עצירה (שלב 1.4) כדי לעצור את העיכול.</li>
	<li>צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C בזהירות להסיר את supernatant באמצעות פיפטה.</li>
	<li>מוסיפים 10 מ"ל PBS קר, ומעבירים את התערובת דרך מסננת של 70 מיקרומטר לתוך צינור סטרילי של 50 מ"ל כדי לסנן את כל הגושים.</li>
</ol>5. הרחבת תאים
<ol><li>צלחת 1 x 10 5 תאים לס"מ 2 לתוך בקבוק T25 מצופה פיברונקטין (שלב2) עם5 מ"ל של מדיום תרבית.</li>
	<li>לדגור על התאים ב 37 ° C עם 5% CO2 במשך 24 שעות. לאחר מכן, הסר את המדיום כדי לחסל תאים שאינם מחוברים.</li>
	<li>לשמור על התרבות על ידי החלפת 50% של המדיום כל יומיים. חזור על תהליך זה פעמיים או שלוש.</li>
</ol>6. בחירת תאים מגנטיים
הערה: עבוד במהירות, שמור על קור התאים והשתמש בתמיסות מקוררות מראש כדי למנוע תיוג תאים לא ספציפי.
<ol><li>הכנת מכשירים וריאגנטים: מחברים מפריד מגנטי למעמד מפריד מגנטי (ראה טבלת חומרים). חבר עמודת בחירה למפריד המגנטי ומקם מסננת תאים בגודל 70 מיקרומטר על גבי עמודת הבחירה. מקם צינור של 50 מ"ל מתחת לעמודת הבחירה כדי לאסוף את הזרימה.</li>
	<li>עיכול אנזימטי: ברגע שהתאים מגיעים למפגש של 80%, שואפים את התווך ושוטפים את התאים עם PBS. הוסיפו 0.25% טריפסין כדי לנתק תאים דבקים ודגרו בטמפרטורה של 37°C למשך 5 דקות. עצור את העיכול על ידי הוספת מאגר העצירה. צנטריפוגה את התאים ב 300 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר ולהסיר את supernatant.</li>
	<li>דגירה של נוגדנים: להשהות מחדש 1 x 107 תאים סה"כ ב 100 μL של PBS ולהוסיף 10 μL של נוגדן LYVE-1 (ראה טבלה של חומרים). מערבבים היטב ודגרים במשך 30 דקות בחושך ב-18 מעלות.<ol><li>סובבו את התאים ב 300 x גרם במשך 5 דקות והשליכו את הסופרנטנט. שטוף את התאים על ידי החדרת 1 מ"ל של PBS וצנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות. הסר לחלוטין את הסופרנטנט.</li>
	</ol></li>
	<li>תיוג מיקרו-כדוריות: יש להשהות מחדש את התאים ב-100 מיקרוליטר של PBS ולהוסיף 20 מיקרו-כדוריות (ראו טבלת חומרים). מערבבים היטב ודגרים במשך 30 דקות בחושך ב 4 מעלות צלזיוס.<ol><li>סובבו את התאים ב 300 x גרם במשך 5 דקות ו decant את supernatant. לאחר מכן, לנקות את התאים עם 1 מ"ל של PBS באמצעות צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות. לבסוף, להסיר לחלוטין את supernatant.</li>
	</ol></li>
	<li>הרחקה שלילית מגנטית: להשעות מחדש את התאים ב 4 מ"ל של PBS. העבירו את התאים דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר כדי לסלק גושים. הכינו את עמודת הבחירה (ראו טבלת חומרים) על-ידי שטיפתה ב-3 מ"ל PBS, ולאחר מכן החילו את תרחיף התא בעמודת הבחירה.<ol><li>בצעו שלבי שטיפה עם 3 מ"ל PBS ואספו תאים שליליים מסוג LYVE-1 לתוך צינור של 50 מ"ל הממוקם מתחת לעמודת הבחירה כדי לאפשר להם לעבור.</li>
	</ol></li>
	<li>בחירה חיובית מגנטית: פיפטה 6 מ"ל של PBS לתוך עמודת הבחירה. שטוף באופן מיידי את התאים המסומנים מגנטית על-ידי דחיפת הבוכנה בחוזקה לתוך עמודת הבחירה כדי לקבל LLECs חיוביים ל-LYVE-1. הערה: המתן תמיד עד שמאגר עמודת הבחירה יתרוקן לפני שתמשיך לשלב הבא.</li>
</ol>7. תרבות LLECs
<ol><li>צנטריפוגו את ה-LLECs החיוביים ל-LYVE-1 ב-300 x גרם למשך 5 דקות, ולאחר מכן הסירו בזהירות את הסופר-נטנט.</li>
	<li>צלחת 1 x 10 5 תאים לס"מ2 לתוך בקבוק T25 מצופה פיברונקטין עם5 מ"ל של מדיום תרבית.</li>
	<li>לשמור על התרבות על ידי החלפת 50% של המדיום כל יומיים. כאשר התאים מגיעים למפגש של 80%, מנתקים את התאים עם 0.25% טריפסין ומבצעים מעבר תאים. נצלו את התאים לניסויים הבאים לאחר 2-3 מעברים.</li>
</ol>8. ניתוח ציטומטרי זרימה
הערה: הניתוח הציטומטרי של Flow נערך בעקבות הליך15 שתואר קודם לכן.
<ol><li>הוסיפו 0.25% טריפסין כדי לנתק תאים דבקים ודגרו בטמפרטורה של 37°C למשך 5 דקות. לאחר מכן, הוסף את מאגר העצירה כדי לעצור את העיכול.</li>
	<li>צנטריפוגו את התאים ב 300 x גרם במשך 5 דקות לחלוטין לשאוף את supernatant. השהה מחדש 1 x 106 תאים ב 100 μL של PBS.</li>
	<li>הוסף 1 μL של נוגדן LYVE-1. מערבבים היטב ודגרים במשך 10 דקות בחושך בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>השהה מחדש את התאים בכמות מתאימה של מאגר PBS לצורך ניתוח באמצעות ציטומטריית זרימה ותוכנת FlowJo (ראה טבלת חומרים).</li>
</ol>9. צביעה אימונופלואורסצנטית
הערה: הצביעה האימונופלואורסצנטית בוצעה בעקבות ההליך שתואר קודם לכן16.
<ol><li>לשטוף את התאים עם PBS שלוש פעמים. תקן את התאים עם 4% paraformaldehyde (PFA) במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. השליכו את ה-PFA ושטפו את התאים עם PBS שלוש פעמים.</li>
	<li>החל את מאגר הבלוקים למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. הסר את מאגר הבלוקים מהכיסויים.</li>
	<li>מוסיפים את נוגדן LYVE-1 במאגר הצביעה לתאים ודגרים בחושך. שטפו את התאים שלוש פעמים עם PBS.</li>
	<li>מוסיפים נוגדן משני מתאים (ראו טבלת חומרים) בחיץ הצביעה לתאים ודגרים בחושך. שטפו את התאים שלוש פעמים עם PBS.</li>
	<li>כתם נגדי עם 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). התאים מוכנים כעת למיקרוסקופ אימונופלואורסצנטי.</li>
</ol>

הקמת תרביות LLEC חוץ גופיות באמצעות בחירת תאים מגנטיים

<ol><li>Shibata-Germanos, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+conservation+of+non-lumenized+lymphatic+endothelial+cells+in+the+mammalian+leptomeninges%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Structural and functional conservation of non-lumenized lymphatic endothelial cells in the mammalian leptomeninges.</a> Acta Neuropathologica. 139 (2), 383-401 (2020).</li>
<li>Suárez, I., Schulte-Merker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+with+many+talents%3A+lymphatic+endothelial+cells+in+the+brain+meninges%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Cells with many talents: lymphatic endothelial cells in the brain meninges.</a> Cells. 10 (4), 799(2021).</li>
<li>Jordan-Williams, K. L., Ruddell, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+purifies+murine+lymph+node+lymphatic+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Lymphatic+Research+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Culturing purifies murine lymph node lymphatic endothelium.</a> Lymphatic Research and Biology. 12 (3), 144-149 (2014).</li>
<li>Jones, B. E., Yong, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+and+characterization+of+bovine+mesenteric+lymphatic+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22In+vitro+Cellular+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Culture and characterization of bovine mesenteric lymphatic endothelium.</a> In vitro Cellular & Developmental Biology. 23 (10), 698-706 (1987).</li>
<li>Podgrabinska, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+lymphatic+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of lymphatic endothelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (25), 16069-16074 (2002).</li>
<li>Jablon, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+short-term+culturing+of+primary+lymphatic+endothelial+cells+from+collecting+lymphatics%3A+A+techniques+study%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Isolation and short-term culturing of primary lymphatic endothelial cells from collecting lymphatics: A techniques study.</a> Microcirculation. 30 (2-3), e12778(2023).</li>
<li>Lapinski, P. E., King, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+mouse+lymphatic+endothelial+cells+from+lung+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of mouse lymphatic endothelial cells from lung tissue.</a> Methods in Molecular Biology. 2319, 69-75 (2021).</li>
<li>Lokmic, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+Identification%2C+and+culture+of+human+lymphatic+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation, Identification, and culture of human lymphatic endothelial cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1430, 77-90 (2016).</li>
<li>Thiele, W., Rothley, M., Schmaus, A., Plaumann, D., Sleeman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry-based+isolation+of+dermal+lymphatic+endothelial+cells+from+newborn+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Lymphology%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry-based isolation of dermal lymphatic endothelial cells from newborn rats.</a> Lymphology. 47 (4), 177-186 (2014).</li>
<li>Lokmic, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+lymphatic+endothelial+cells+by+multi-parameter+fluorescence-activated+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of human lymphatic endothelial cells by multi-parameter fluorescence-activated cell sorting.</a> Journal of Visualized Experiments. 99, e52691(2015).</li>
<li>Janson, C., Romanova, L., Hansen, E., Hubel, A., Lam, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalization+and+functional+characterization+of+rat+arachnoid+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Immortalization and functional characterization of rat arachnoid cell lines.</a> Neuroscience. 177, 23-34 (2011).</li>
<li>Romanova, L. G., Hansen, E. A., Lam, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+preliminary+characterization+of+immortalized+cell+line+derived+from+rat+lymphatic+capillaries%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Generation and preliminary characterization of immortalized cell line derived from rat lymphatic capillaries.</a> Microcirculation. 21 (6), 551-561 (2014).</li>
<li>Park, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Routine+culture+and+study+of+adult+human+brain+cells+from+neurosurgical+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Routine culture and study of adult human brain cells from neurosurgical specimens.</a> Nature Protocols. 17 (2), 190-221 (2022).</li>
<li>Okuda, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((lyve1+expression+reveals+novel+lymphatic+vessels+and+new+mechanisms+for+lymphatic+vessel+development+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">lyve1 expression reveals novel lymphatic vessels and new mechanisms for lymphatic vessel development in zebrafish.</a> Development. 139 (13), 2381-2391 (2012).</li>
<li>Bokobza, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+Isolation+of+microglial+cells+from+neonate+mouse+for+primary+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Magnetic Isolation of microglial cells from neonate mouse for primary cell cultures.</a> Journal of Visualized Experiments. 185, e62964(2022).</li>
<li>Wang, J. M., Chen, A. F., Zhang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+primary+culture+of+mouse+aortic+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and primary culture of mouse aortic endothelial cells.</a> Journal of Visualized Experiments. 118, e52965(2016).</li>
<li>Breiteneder-Geleff, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiosarcomas+express+mixed+endothelial+phenotypes+of+blood+and+lymphatic+capillaries%3A+podoplanin+as+a+specific+marker+for+lymphatic+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Angiosarcomas express mixed endothelial phenotypes of blood and lymphatic capillaries: podoplanin as a specific marker for lymphatic endothelium.</a> The American Journal of Pathology. 154 (2), 385-394 (1999).</li>
<li>Petrova, T. V., Koh, G. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ-specific+lymphatic+vasculature%3A+From+development+to+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Organ-specific lymphatic vasculature: From development to pathophysiology.</a> The Journal of Experimental Medicine. 215 (1), 35-49 (2018).</li>
<li>Wilting, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+Prox1+is+a+marker+for+lymphatic+endothelial+cells+in+normal+and+diseased+human+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">The transcription factor Prox1 is a marker for lymphatic endothelial cells in normal and diseased human tissues.</a> The FASEB Journal. 16 (10), 1271-1273 (2002).</li>
<li>Yin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphatic+endothelial+heparan+sulfate+deficiency+results+in+altered+growth+responses+to+vascular+endothelial+growth+factor-C+%28VEGF-C%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Lymphatic endothelial heparan sulfate deficiency results in altered growth responses to vascular endothelial growth factor-C (VEGF-C).</a> The Journal of Biological Chemistry. 286 (17), 14952-14962 (2011).</li>
<li>DeSisto, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomic+analyses+of+the+developing+meninges+reveal+meningeal+fibroblast+diversity+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomic analyses of the developing meninges reveal meningeal fibroblast diversity and function.</a> Developmental Cell. 54 (1), 43-59 (2020).</li>
<li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+eliminating+fibroblast+contamination+in+mouse+and+human+primary+corneal+epithelial+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">A method for eliminating fibroblast contamination in mouse and human primary corneal epithelial cell cultures.</a> Current Eye Research. , 1-11 (2023).</li>
<li>Starzonek, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+human+dermal+stem+cells+from+primary+cell+cultures+through+the+elimination+of+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Enrichment of human dermal stem cells from primary cell cultures through the elimination of fibroblasts.</a> Cells. 12 (6), 949(2023).</li>
<li>Lam, C. H., Romanova, L., Hubel, A., Janson, C., Hansen, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+fibroblast+on+the+arachnoid+leptomeningeal+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">The influence of fibroblast on the arachnoid leptomeningeal cells in vitro.</a> Brain Research. 1657, 109-119 (2017).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין להם ניגוד עניינים לחשוף.

הפרוטוקול הקיים לקציר וגידול LLECs במבחנה לא דווח בעבר. מחקר זה מציג פרוטוקול רב-פרוצדורלי הניתן לשחזור לקציר וגידול LLECs מלפטומינינגים של עכברים.
בעוד פרוטוקול רב-פרוצדורלי זה ניתן לשחזור, ישנם מספר שיקולים מרכזיים. לדוגמה, צלוחיות T25 מצופות פיברונקטין מקדמות הידבקות של LLECs ומתפקדות על ידי חיסול תאים שאינם דבקים, ובכך מבטיחות אוכלוסיית תאים הומוגנית יותר. בנוסף, משך הזמן והטמפרטורה במהלך הליכים כירורגיים לניתוק לפטומינינגים הם גורמים קריטיים המשפיעים על כדאיות התא. לכן, חשוב לשמו...

תאי אנדותל לימפה לפטומנינגיאליים שהתגלו לאחרונה (LLECs) יוצרים רשת של תאים בודדים בתוך הלפטומנינגים, ומציגים דפוס התפלגות מובהק בהשוואה לתאי אנדותל לימפטיים היקפיים 1,2. התפקודים התאיים וההשלכות הקליניות הקשורות ל-LLECs נותרו במידה רבה טריטוריה לא ממופת. על מנת לסלול את הדרך למחקר פונקציונלי על LLECs, הכרחי להקים מודל in vitro עבור המחקר שלהם. לכן, מחקר זה פיתח פרוטוקול מקיף לבידוד ותרבות ראשונית של LLECs.
עכברים הם המודל המועדף על בעלי חיים בשל התאמתם למניפולציה גנטית בחקר מחלות. מחקרים קודמים בודדו בהצלחה תאי אנדותל לימפטיים מרקמות עכבר שונות, כולל בלוטות לימפה3, רקמה מזנטרית4, רקמת עור5, איסוף לימפה6 ורקמת ריאה7. הליכי בידוד אלה הסתמכו בעיקר על טכניקות כגון מיון תאים המופעלים מגנטית (MACS) ומיון ציטומטריית זרימה 8,9,10. בנוסף, מאמצי המחקר הובילו להקמת קווי תאים ארכנואידים של חולדות וקווי תאי נימים לימפטיים של חולדות11,12. למרות קיומן של טכניקות תרבית צמחים עבור לפטומנינגה13, קיים צורך דחוף בפרוטוקול סטנדרטי לבידוד ותרבית של LLECs. כתוצאה מכך, מחקר זה הצליח לקצור ולתרבת LLECs על ידי ניתוק קפדני של לפטומנינגים בהנחיית מיקרוסקופ וקידום הרחבת LLECs באמצעות שימוש בגורם גדילה אנדותל כלי דם-C (VEGF-C). הסמן הייחודי לתאי אנדותל לימפטיים הוא קולטן היאלורוני של כלי הלימפה-1 (LYVE-1)14. פרוטוקול רב-שלבי זה מבודד באופן סלקטיבי LLECs חיוביים ל-LYVE-1 באמצעות MACS ולאחר מכן מוודא את טוהרם באמצעות ניתוח ציטומטרי זרימה וצביעה אימונופלואורסצנטית.
ניתן לסכם את השלבים העיקריים של פרוטוקול רב-שלבי זה באופן הבא: ציפוי בקבוקים, דיסוציאציה של לפטומנינגים, עיכול אנזימטי של לפטומנינגים, התפשטות תאים, בחירת תאים מגנטיים ותרבית עוקבת של LLECs. לבסוף, טוהר ה- LLECs המבודדים מאושר באמצעות ניתוח ציטומטרי זרימה וצביעה אימונופלואורסצנטית. מטרת העל של מחקר זה היא להציג פרוטוקול רב-שלבי הניתן לשחזור לבידוד LLECs מלפטומינינגים של עכברים ומתרבית המבחנה שבאה בעקבותיהם. פרוטוקול זה צפוי להקל מאוד על חקירת התפקודים התאיים וההשלכות הקליניות של LLECs.

<table><tbody><tr><td>מאגר חסום</td><td>Beyotime</td><td>P0102</td><td>אחסן את הפריטים ב &ndash; 4 &deg; C</td></tr><tr><td>קולגנאז I</td><td>Solarbio</td><td>C8140</td><td>חנות ב &ndash; 20 מעלות; C</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Beyotime</td><td>P0131</td><td>חנות aliquots ב &ndash; 20 מעלות; C</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Solarbio</td><td>11995</td><td>חנות aliquots ב &ndash; 4 &deg; C</td></tr><tr><td>D-PBS</td><td>Solarbio</td><td>D1041</td><td>אחסן כמויות ב &ndash; 4 &deg; </td></tr><tr><td>C EGM-2 MV Bullet Kit</td><td>Lonza</td><td>C-3202</td><td>חנות ב &ndash; 4 &deg; C</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Solarbio</td><td>S9010</td><td>חנות ב &ndash; 20 מעלות; C</td></tr><tr><td>פיברונקטין</td><td>Solarbio</td><td>F8180&nbsp;</td><td>אחסן את הפריטים בכתובת &ndash; 20 מעלות; C</td></tr><tr><td>FlowJo Software</td><td>BD Biosciences</td><td>V10.8.1</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן LYVE-1</td><td>eBioscience</td><td>12-0443-82</td><td>אחסן את הכמויות ב &ndash; 4 &deg; C</td></tr><tr><td>מפריד מגנטי</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-302</td><td>סטרילי לפני השימוש</td></tr><tr><td>מעמד מפריד מגנטי</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-303</td><td>סטרילי לפני השימוש</td></tr><tr><td>Microbeads</td><td>Miltenyi</td><td>130-048-801</td><td>אחסן aliquots ב &ndash; 4 &deg; C</td></tr><tr><td>P/S</td><td>Solarbio</td><td>P1400</td><td>חנות ב &NDASH; 20 מעלות; C</td></tr><tr><td>פפאין</td><td>Solarbio</td><td>G8430-25g</td><td>חנות ב &ndash; 20 מעלות; C</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Solarbio</td><td>D1040</td><td>חנות ב &ndash; 4 &deg; C</td></tr><tr><td>נוגדן PDPN</td><td>Santa</td><td>sc-53533</td><td>אחסן את הפריטים ב &ndash; 4 &deg; C</td></tr><tr><td>PFA</td><td>Solarbio</td><td>P1110</td><td>חנות ב &ndash; 4 &deg; </td></tr><tr><td>נוגדן C PROX1</td><td>Santa</td><td>sc-81983</td><td>אחסן כמויות ב &ndash; 4 &deg; עמודת בחירה C</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-401</td><td>סטרילי לפני השימוש</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Gibco</td><td>25200072</td><td>לאחסן את המוצרים ב &ndash; 20 מעלות; C</td></tr><tr><td>VEGF-C&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab51947</td><td>אחסן aliquots ב &ndash; 20 מעלות; C</td></tr><tr><td>נוגדן VEGFR-3</td><td>Santa</td><td>sc-514825</td><td>אחסן את הכמויות ב &ndash; 4 &deg; ג</td></tr></tbody></table>

קציר ותרבית ראשונית של תאי אנדותל לימפטיים leptomeningeal

Harvest and Primary Culture of Leptomeningeal Lymphatic Endothelial Cells

תאי אנדותל לימפטיים לפטומנינגיאליים (LLECs) הם אוכלוסיית תאים תוך-גולגולתיים שהתגלתה לאחרונה עם תפוצה ייחודית הנבדלת בבירור מתאי אנדותל לימפטיים היקפיים. תפקודם התאי והשלכותיהם הקליניות עדיין אינם ידועים במידה רבה. כתוצאה מכך, הזמינות של אספקת LLECs חיונית לביצוע מחקר פונקציונלי במבחנה. עם זאת, אין כיום פרוטוקול קיים לקציר וגידול LLECs במבחנה.
מחקר זה אסף בהצלחה LLECs באמצעות פרוטוקול רב-שלבי, שכלל ציפוי הבקבוק בפיברונקטין (FIBRONECTIN), ניתוח הלפטומנינגים בעזרת מיקרוסקופ, עיכול אנזימטי של הלפטומנינגים כדי להכין תרחיף חד-תאי, גרימת התרחבות של LLECs עם גורם גדילה אנדותל כלי דם-C (VEGF-C), ובחירת תאים חיוביים קולטן היאלורוני של כלי הלימפה -1 (LYVE-1) באמצעות מיון תאים המופעלים מגנטית (MACS). תהליך זה הוביל בסופו של דבר לכינונה של תרבות ראשונית. טוהר ה- LLECs אושר באמצעות צביעה אימונופלואורסצנטית וניתוח ציטומטרי זרימה, עם רמת טוהר העולה על 95%. פרוטוקול רב-שלבי זה הוכיח יכולת שחזור והיתכנות, אשר יקלו מאוד על חקר התפקוד התאי וההשלכות הקליניות של LLECs.

מחקר זה מציג פרוטוקול רב-שלבי הניתן לשחזור לקצירת תאי אנדותל לימפטיים (LLECs) מעכברים ולאחר מכן לביסוס התרבית הראשונית שלהם במבחנה. שלבי המפתח כוללים הכנת בקבוקים וציפוי פיברונקטין (fibronectin), דיסוציאציה של לפטומנינגים, השגת תרחיף חד-תאי באמצעות עיכול אנזימטי, וגרימת הרחבת LLECs עם VEGF-C. לאחר מכן, LLECs חיוביים מסוג LYVE-1 מבודדים באופן סלקטיבי באמצעות מיון תאים המופעל באמצעות מגנטית (MACS). לבסוף, צביעה אימונופלואורסצנטית וניתוח ציטומטרי של זרימה מבוצעים כדי להעריך את טוהר LLECs, כאשר תוצאות בדיקת MTT מדגי...

תאי אנדותל לימפטיים Leptomeningeal (LLECs), סוג תא תוך גולגולתי שזוהה לאחרונה, הם בעלי תפקידים לא מובנים. מחקר זה מציג פרוטוקול הניתן לשחזור לקצירת LLECs מעכברים וביסוס תרביות ראשוניות במבחנה . פרוטוקול זה נועד לאפשר לחוקרים להתעמק בתפקודים התאיים ובהשלכות הקליניות האפשריות של LLECs.

קציר ותרבית ראשונית של תאי אנדותל לימפטיים Leptomeningeal

Leptomeningeal lymphatic endothelial cells (LLECs) are a recently discovered intracranial cellular population with a unique distribution clearly distinct ...

פרוטוקול זה מיועד לאזורים של חוקרים אחרים המעוניינים רק היכן שנקבע ההליך הרב-פרוצדורתי לאזורים ראשוניים תרבותיים הפרוטוקול שלנו הוביל בסופו של דבר לביסוס התרבות העיקרית שלנו של אזור CS עם רמת טוהר העולה על 95%אין כיום פרוטוקול קיים לקציר וגידול התוצאות שלנו סללו את הדרך לחקירה נוספת של הפונקציה הדומה של LLECS בווירטואלי. ב- RUC, התגלית האחרונה שלנו על אוכלוסיית תאים תוך גולגולתית, המשמעות הביולוגית של RUC נערוך מחקר נוסף על תפקוד התא ונסקור את השלכותיו הקליניות.

harvest-primary-culture-leptomeningeal-lymphatic-endothelial

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

כאן אנו מתארים פרוטוקול לבידוד והתרבות של Murine לתאי אנדותל ריאתי. שיטה זו כוללת מכונאי דיסוציאציה האנזימטית רקמת הריאות, כמו גם תהליך צעד 2-טיהור באמצעות אנטי PECAM-1 ואנטי ICAM-2 נוגדנים מצומדות כדי חרוזים מגנטיים, אשר מייצר אוכלוסיה טהור תא האנדותל של כלי הדם בעיקר מקור.

בידוד תרבות לתאי אנדותל ריאתי מעכברים ילודים

המטרה של פרוטוקול זה היא לבודד תאי האנדותל הלימפה בדופן כלי אנושיים מום הלימפה כמו ציסטה-ועורלות באמצעות תא הקרינה המופעל מיון (FACS). culturing התא הבא והתרחבות של תאים אלה מאפשרים רמה חדשה של תחכום ניסיוני למחקרים גנטיים, proteomic, פונקציונליים והתמיינות תאים.

בידוד של תאי האנדותל אדם הלימפה על ידי מיון תא הקרינה המופעל Multi-פרמטר

פרוטוקול תרבות leptomeninges explant מהמוח שלאחר מוות האנושי הוא דרך חזקה ופשוט טכניים לגזור פיברובלסטים קרום מוח חיובי פיברונקטין בתוך 6-8 שבועות cryopreserve כ 20-30 מיליון תאים.

תורם גזירת תרבויות Leptomeninges explant מן לאחר מות המוח האנושי

אנו מתארים הזרקה תאיים כי מעסיקה מחט כפוף בקצה כי ניתן לייצב את הגולגולת, ובכך לחסל את הסיכון של נזק על הבסיס הבסיסי. הגישה יכולה לשמש למיפוי הגורל הגנטי ומניפולציות של תאים לטומאנעיים ולמעקב אחר תנועת נוזל מוחי שדרתי.

אינדוקציה של שינוי תאי לטומנאנואל באמצעות הזרקה בתוך החלק האחר

מאמר זה מציג שני פרוטוקולים אופטימליים לבחינת תאי חיסון חיים ופריפריאליים במערכת העצבים המרכזית, כולל המוח, חוט השדרה וקרומי המוח. כל אחד מהפרוטוקולים הללו מסייע לוודא את תפקודם והרכבם של התאים המאכלסים תאים אלה בתנאים יציבים ודלקתיים.

בידוד רקמות מערכת העצבים המרכזית וקרומי המוח הקשורים לניתוח במורד הזרם של תאי מערכת החיסון

הפרוטוקול המתואר כאן מדגיש את השלבים העיקריים בהתמיינות תאי אנדותל דמויי מוח המושרים פלוריפוטנטים, הכנת Neisseria meningitidis לזיהום, ואיסוף דגימות לניתוחים מולקולריים אחרים.

Neisseria meningitidis זיהום של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים שמקורם בתאי אנדותל במוח

מאמר זה מתאר שיטה לבידוד מבוסס חרוזים מגנטיים של תאי אנדותל מורין מנימי לימפה עוריים. תאי האנדותל הלימפטיים המבודדים יכולים לשמש לניסויים במבחנה במורד הזרם ולניתוח ביטוי חלבונים.

Murine Dermal Lymphatic Endothelial Cell Isolation

מאמר זה מתאר פרוטוקול להתפשטות תאי גידול במחזור נוזל המוח בעמוד השדרה (CSF-CTCs) שנאסף מחולים עם מחלת לפטומנינגיאלית הקשורה למלנומה (M-LMD) כדי לפתח מודלים פרה-קליניים לחקר M-LMD.

אקס ויוו תרבית של תאי גידול במחזור הדם בנוזל השדרה המוחי מחולי מלנומה לחקר מחלת לפטומנינגה הקשורה למלנומה

כאן מוצג פרוטוקול להערכת כלי הלימפה של קרום המוח בעכברים (MLVs), הממלאים תפקיד חשוב במחלות נוירולוגיות מרובות. מטרת הפרוטוקול היא לספק שיטה משולבת המאפשרת הן הערכה פונקציונלית של ניקוז העוקבים והן אפיון מורפולוגי מפורט של רשת ה-MLV הגב.

פרוטוקול משולב להערכת לימפות מנינגיאל: הזרקת סיסטרנה מגנה, הדמיית בלוטות לימפה, כריתת מנינגיאל וצביעה שלמה

פרוטוקול זה מתאר את הצעדים הנדרשים כדי לנתח, transfect דרך electroporation ועכבר תרבות נוירונים בהיפוקמפוס ואת קליפת המוח. לטווח קצר תרבויות ניתן להשתמש ללימודי תולדה של האקסון והדרכה, ואילו לטווח ארוך תרבויות יכול לשמש מחקרים synaptogenesis ניתוח בעמוד השדרה הדנדריטים.

Nucleofection ותרבות ראשונית של נוירונים בהיפוקמפוס עכבר עובריים קליפתיים

למדו פרוטוקול לקציר ותרבית תאי אנדותל לימפטיים ממוח עכברים עם טוהר של מעל 95%. שיטה זו מאפשרת חקר תפקודים תאיים ומשמעות קלינית במערכת העצבים המרכזית.

קציר ותרבית ראשונית של תאי אנדותל לימפטיים Leptomeningeal

גלה סרטונים נוספים