Name: ייצור יעיל של תאי קולטן אנטיגן כימרי (CAR)-T (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 22 s
Description: למד פרוטוקול יעיל לייצור תאי CAR-T ממושקעים בדגמים סינגניים של עכברים. שיטה זו משפרת את יעילות השיבוץ ומאפשרת חקר מערכת החיסון השלמה בטיפול בגידולים מוצקים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לל. ברוקמן על הביקורת על כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי NIH 1R01EB030352 ו- UL1 TR001873.

כל ההליכים בבעלי חיים בוצעו באישור הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (אוניברסיטת קולומביה, פרוטוקולים AC-AABQ5551 ו-AC-AAAZ4470) באמצעות עכברות BALB/c או CF57BL/6 בנות 6-8 שבועות במשקל של בין 20-25 גרם. בעלי החיים התקבלו ממקור מסחרי (ראו טבלת חומרים). פרוטוקול זה בנוי סביב "הימים שלאחר ההפעלה" של תאי T מורין, וייצור נגיפים מתחיל ביום -2. רטרו-וירוס יכול להיות מאוחסן ב -80 ° C לאחר הייצור הראשוני, ולשימוש עתידי של פרוטוקול זה, ניתן להתחיל עם שלב 2, בידוד תאי T והפעלה ביום 0.
1. ייצור וקטור רטרו-ויראלי
הערה: המוצרים הנגיפיים נעשו פגומים בשכפול על ידי הפרדת גני האריזה לשני פלסמידים נפרדים (ראה טבלת חומרים), מה שמקטין מאוד את הסבירות לאירועי רקומבינציה וייצור לא מכוון של וירוס כשיר שכפול.
<ol><li>הכינו את תאי הפניקס אקו יום אחד לפני הטרנספקציה (הליך יום -2).<ol><li>צלחת בערך 1 x 107 תאים בצלחת 15 ס"מ מטופלת TC או צלוחיות תרבית T150, באמצעות 30 מ"ל של מדיום תרבית (מדיום תרבית הפניקס אקו, כמפורט בטבלה 1).</li>
		<li>לדגור לילה ב 37 °C (77 °F). לאחר 18-24 שעות, התאים צריכים להיות כ 70% confluent ומופץ באופן אחיד כדי להבטיח תשואה ויראלית גבוהה ללא צמיחת יתר. הערה: לקבלת תוצאות מיטביות, יש להשתמש בתאים עם מעבר נמוך ולעבור אותם יום לפני הציפוי לייצור נגיפי. אין לאפשר לתאי הפניקס אקו לגדול יתר על המידה במהלך תרבית שגרתית.</li>
	</ol></li>
	<li>הכינו את תערובת הטרנספקציה המכילה את ריאגנטים ליפופקציה ומשפרים, pCL-Eco (Gag/Pol) ופלסמיד ביטוי pMSCV (pMSCV_PGK_mGFP28z) במדיה מופחתת בסרום (ראו טבלת חומרים) (הליך יום -1). הערה: יש לבצע טרנספקציה משותפת ביחס של 1:1 של pMSCV ו-pCL-Eco.<ol><li>הכינו את צינור A: דללו 105 מיקרוליטר של מגיב הטרנספקציה ב-3.75 מ"ל של מדיום סרום מופחת לכל צלחת של 15 ס"מ וערבבו היטב על ידי ערבול או פיפטינג למעלה ולמטה.</li>
		<li>הכן צינור B: לדלל פלסמיד ביטוי pMSCV (21 מיקרוגרם) ו- pCL-Eco (21 מיקרוגרם) עם מגיב משפר 90 מיקרוליטר ל- 3.75 מ"ל של מדיום סרום מופחת לכל צלחת של 15 ס"מ. מערבבים היטב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה. הערה: אם אתם מייצרים מוצרים נגיפיים מרובים, הגדירו תערובת אב המכילה pCL-Eco ואת מגיב המשפר.</li>
		<li>מוסיפים את צינור A לצינור B ומערבבים היטב על ידי פיפטינג. יש לדגור במשך 10-20 דקות בטמפרטורת החדר, והתוצאה היא נפח כולל של כ-7.5 מ"ל.</li>
		<li>הסר בזהירות 10 מ"ל של מדיה של תרבית תאים מלוח Phoenix Eco והוסף את כל נפח תערובת הטרנספקציה למדיה הנותרת על ידי הטיית הצלחת והפיפטינג כלפי מטה. החזרת תאים לאינקובטור של 37 מעלות צלזיוס.</li>
	</ol></li>
	<li>שנה את המדיה על תאי Phoenix Eco נגועים 16-20 שעות לאחר הטרנספקציה (הליך יום 0).<ol><li>סרום טרום חם ו-β-מרקפטואתנול (2-ME, ראו טבלת חומרים) ללא תאי מורין T בינוניים (קציר נגיפי mTCM, כמפורט בטבלה 1) עד 37°C באמצעות אמבט מים או חרוזים.</li>
		<li>הסר בזהירות את מדיום התרבות Phoenix Eco על ידי הטיית הצלחת והנחת קצה פיפטה בפינה התחתונה, באמצעות ואקום במידת האפשר. הימנעו מייבוש יתר של התאים.</li>
		<li>הוסיפו בעדינות את מדיום הקציר הנגיפי mTCM המחומם לצד הצלחת המוטה על ידי פיפטציה של 30 מ"ל במצב האיטי ביותר. החזרת תאים לאינקובטור של 37 מעלות צלזיוס. הערה: שלב זה יכול לגרום לתאי Phoenix Eco להתנתק מהצלחת ולהפחית את הטיטרים הנגיפיים. מדיה מחוממת מראש ופיפטינג עדין ימזערו את ההפרעה.</li>
	</ol></li>
	<li>קצור את supernatant ויראלי 48 שעות לאחר transfection (הליך יום 1).<ol><li>קצרו את הסופרנאטנט הנגיפי וסננו אותו דרך מסנני PVDF של 0.45 מיקרומטר (ראו טבלת חומרים) כדי להסיר תאים ופסולת. Aliquot ולהקפיא את הנגיף ב -80 ° C או להמשיך ישירות ליום 1 של שלב 3 אם באמצעות וירוס טרי.</li>
		<li>לקבוע את titer ויראלי (יחידות מתמר/mL) על ידי ציטומטריית זרימה,כפי שתואר קודם 9. שלב זה הוא אופציונלי.<ol><li>קבע את הטיטר הנגיפי על ידי התמרה בקנה מידה קטן של 1 x 105 תאי T מורין פעילים בלוחות 96 בארות שאינם מטופלים בתרבית רקמה (TC), מצופים מראש ברטרונקטין (ראה טבלת חומרים) ועמוסים בדילול סדרתי משולש של סופרנאטנט רטרו-ויראלי בנפח סופי של 100 μL של מדיום קציר נגיפי mTCM. הערה: ראה שלבים 2 ו- 3 להלן לקבלת הוראות מפורטות על בידוד, הפעלה והעברה של תאי T.</li>
			<li>קביעת ביטוי פני השטח של CAR 4-5 ימים לאחר הטרנסדוקציה על ידי ציטומטריית זרימה.</li>
			<li>חשב את הטיטר הנגיפי על פי הנוסחה10: (N x F x D)/V, כאשר N הוא מספר התאים המותמרים, F הוא התדירות של תאים חיוביים ל- CAR, D הוא גורם הדילול, ו- V הוא נפח ההמרה ב- mL לקבלת יחידות מתמרים (TU)/mL. הערה: טיטר נגיפי עשוי לרדת בעת הקפאה/הפשרה; לכן, titer ויראלי נקבע באופן אידיאלי על וירוס קפוא ולאחר מכן מופשר.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>2. בידוד תאי T מורין
<ol><li>בודד והפעל תאי T מורין (הליך יום 0). הערה: שלבים אלה יכולים להתבצע בטמפרטורת החדר (RT) או 4 °C ויש לבצע אותם בסביבה סטרילית.<ol><li>קצרו את הטחול מזן העכבר המעניין (למשל, Balb/c, C57BL/6) כפי שתואר קודם לכן11 וקבלו תרחיף חד-תאי באמצעות דיסוציאציה מכנית.</li>
		<li>בעזרת גב מזרק סטרילי, מרסקים את הטחול דרך מסננת תאים של 70-100 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי של 50 מ"ל.</li>
		<li>לאחר הנחת המזרק בצד, שטפו את המסננת עם 5 מ"ל של מאגר בידוד תאי T (מלח חוצץ פוספט, PBS, בתוספת סרום בקר עוברי 2%, FBS).</li>
		<li>חזור על שלב המעיכה ושטוף את המסננת פעם נוספת עם 5 מ"ל של מאגר בידוד תאי T. הבא את הנפח הסופי ל- 50 מ"ל עם מאגר בידוד תאי T.</li>
		<li>ספור תאים חיים באמצעות המוציטומטר ידני או מונה תאים אוטומטי על-ידי דילול ביחס של 1:20 ולאחר מכן ערבוב ביחס של 1:1 עם כחול טריפאן.</li>
		<li>גלול את התאים על ידי צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 450 x גרם, ב 4 ° C (או RT), ו resuspend spleenocytes ב 1 x 108/mL אם באמצעות ערכת בידוד תאי T המומלצת (ראה טבלה של חומרים). הערה: ניתן למתוח מחדש טחול באמצעות מסננת של 40-70 מיקרומטר בשלב זה כדי להסיר גושים.</li>
	</ol></li>
	<li>בודד תאי CD3+ T על-ידי בחירה שלילית בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים). לאחר ההפרדה המגנטית, העבירו את המבודד לצינור חרוטי של 15 מ"ל ובצעו ספירת תאים חיים סופית.</li>
	<li>שחררו את תאי ה-T המבודדים באמצעות צנטריפוגה למשך 10 דקות ב-450 x גרם, ב-4°C (או RT), והשהו אותם מחדש ב-1 x 106/mL בתווך הפעלת mTCM (טבלה 1).</li>
	<li>הפעל תאי T על ידי הוספת חרוזים מגנטיים מצופים נוגדנים חד-שבטיים נגד CD3/anti-CD28 (ראה טבלת חומרים) ביחס של 25 μL/1 x 10,6 תאי T ו-100 U/mL IL-2.</li>
	<li>הניחו את התאים באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס והשאירו אותם למשך הלילה. הערה: בשל גודלם הקטן של תאי T, ניתן להשיג ספירה מדויקת יותר של תאי T חיים על ידי דילול ביחס של 1:10-1:20 וערבוב של 1:1 עם כחול טריפאן לספירה ידנית באמצעות המוציטומטר. טוהר עשוי להיקבע על ידי ציטומטריית זרימה על ידי צביעת תאים עם נוגדן αCD3 מצומד פלואורסצנטית. כל טחול יניב בין 7-10 x 10 6תאי T בהתאם לגיל ולזן של העכבר.</li>
</ol>3. התמרת תאי T מורין
<ol><li>הכינו צלחות להתמרה (הליך יום 0).<ol><li>ציפוי מראש צלחות סטריליות 24 בארות לא מטופלות עם 0.5 מ"ל של מגיב משפר התמרה פיברונקטין אנושי (ראה טבלת חומרים) בריכוז סופי של 20-40 מיקרוגרם / מ"ל על ידי דילול אותו PBS סטרילי ולאחסן ב 4 ° C למשך הלילה. הערה: שלב זה יכול להתבצע גם ביום הראשון על ידי ציפוי צלחות 24 בארות שאינן מטופלות עם מגיב הטרנסדוקציה ודגירתן בטמפרטורת החדר למשך שעתיים.</li>
	</ol></li>
	<li>בצע התמרה של תאי T (הליך יום 1).<ol><li>מכינים את הצלחת המצופה מראש להתמרה. הסר את מגיב ההעברה מכל באר של צלחת 24 בארות מצופה מראש ובלוק עם נפח שווה ערך של PBS מסונן סטרילי + אלבומין בסרום בקר 2% (BSA) (0.5 מ"ל) למשך 30 דקות ב- RT.</li>
		<li>לשטוף פעם אחת עם 0.5-1 מ"ל של PBS.</li>
	</ol></li>
	<li>הוסף 0.5-1 מ"ל של רטרו-וירוס מסודר משלב 1 או מדולל על בסיס טיטר נגיפי לכל באר מצופה מראש וצנטריפוגה למשך 90 דקות ב 2,000 x גרם ו 32 ° C.</li>
	<li>הוסף 1 מ"ל של תאי T פעילים לכל באר טעונה נגיפית וצנטריפוגה למשך 10 דקות ב 450 x גרם ו 32 ° C. להחזיר תאים לאינקובטור של 37 מעלות צלזיוס בן לילה.</li>
	<li>24 שעות לאחר הטרנסדוקציה, הסר 1-1.5 מ"ל של מדיה של תרבית תאים והחלף אותה ב- 1-1.5 מ"ל של mTCM-שלם ו- 10 ננוגרם/מ"ל של IL-7 ו- IL-15 אנושיים רקומביננטיים (ראה טבלת חומרים). החזרת תאים לאינקובטור של 37 מעלות צלזיוס (הליך יום 2). הערה: במהלך תרבית ex vivo , יש להוסיף 10 ng/mL של ציטוקינים לתרבית כל 48 שעות, ואין לדלל תאי T מעבר ל-1 x 106/mL.</li>
	<li>48 שעות לאחר הטרנסדוקציה, מעבירים תאים מצלחת הטרנסדוקציה לצלחת טרייה של 24 בארות או 6 בארות ומחזירים תאים לאינקובטור של 37 מעלות צלזיוס (הליך יום 3). הערה: יכולת הקיום של תאי T עשויה להשתפר על-ידי העברת תאים ב-24 שעות עד יומיים לאחר הטרנסדוקציה, בהתאם ליכולת הקיום של תאי T מתחילים ולטיטר נגיפי.</li>
	<li>בטל את חרוז תאי T ואשר ביטוי CAR (הליך יום 5-6).<ol><li>השהה מחדש ביסודיות תאים כדי לנתק תאי T פעילים מהחרוזים המצופים αCD3 / CD28 (ראה טבלת חומרים) והנח את תרחיף התא על מגנט למשך 30 שניות. מעבירים את תרחיף התא לכלי התרבית הרצוי ex vivo ומחזירים אותו לאינקובטור של 37 מעלות צלזיוס. הערה: תאי T עשויים להיות מתורבתים בצלוחיות תרבית או בצלחות תרבית עמוקות. מומלץ לצלוח לפחות 5 x 106 תאי T ב 30 מ"ל של מדיום mTCM-שלם לכל באר בבאר עמוקה של צלחת בפורמט 6 בארות (ראה טבלת חומרים).</li>
		<li>קביעת ביטוי CAR לפי ציטומטריית זרימה8. הערה: ביטוי GFP-CAR נקבע על ידי דגירה עם 100 ננוגרם/מ"ל של GFP מטוהר. שילוב של תג אפיטופ N-terminal יקל על איתור מבני CAR חלופיים.</li>
	</ol></li>
	<li>בצע תרבית ex vivo של תאי CAR-T (הליך יום 7-10).<ol><li>במהלך תרבית ex vivo , שמור על התאים על ידי הסרת 50% ממדיום התרבית והחלפתו ב- mTCM-Complete טרי + 2x 10 ng/mL של IL-7 ו- IL-15 כל 48 שעות. הערה: תאי CAR-T של Murine מוכנים לשימוש ביישומים במורד הזרם 7 ימים לאחר ההפעלה ואין לשמור אותם בהקפאה עקב כדאיות ירודה לאחר ההפשרה.</li>
	</ol></li>
</ol>

פרוטוקול יעיל ליצירת תאי CAR-T בעכבר במודלים סינגניים

<ol><li>June, C. H., Sadelain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor therapy.</a> N Engl J Med. 379 (1), 64-73 (2018).</li>
<li>Duncan, B. B., Dunbar, C. E., Ishii, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applying+a+clinical+lens+to+animal+models+of+car-t+cell+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Applying a clinical lens to animal models of car-t cell therapies.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 27, 17-31 (2022).</li>
<li>Hou, A. J., Chen, L. C., Chen, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Navigating+CAR-T+cells+through+the+solid-tumour+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Navigating CAR-T cells through the solid-tumour microenvironment.</a> Nat Rev Drug Discov. 20 (7), 531-550 (2021).</li>
<li>Campesato, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blockade+of+the+ahr+restricts+a+treg-macrophage+suppressive+axis+induced+by+l-kynurenine%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Blockade of the ahr restricts a treg-macrophage suppressive axis induced by l-kynurenine.</a> Nat Commun. 11 (1), 4011(2020).</li>
<li>Kaneda, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pi3kgamma+is+a+molecular+switch+that+controls+immune+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pi3kgamma is a molecular switch that controls immune suppression.</a> Nature. 539 (7629), 437-442 (2016).</li>
<li>Hyrenius-Wittsten, A., Roybal, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paving+new+roads+for+cars%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cancer%22%5BJournal%5D)">Paving new roads for cars.</a> Trends Cancer. 5 (10), 583-592 (2019).</li>
<li>Giavridis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR+T+cell-induced+cytokine+release+syndrome+is+mediated+by+macrophages+and+abated+by+il-1+blockade%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">CAR T cell-induced cytokine release syndrome is mediated by macrophages and abated by il-1 blockade.</a> Nat Med. 24 (6), 731-738 (2018).</li>
<li>Lanitis, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+gene+engineering+of+murine+CAR-T+cells+reveals+the+beneficial+effects+of+il-15+coexpression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Optimized gene engineering of murine CAR-T cells reveals the beneficial effects of il-15 coexpression.</a> J Exp Med. 218 (2), e20192203(2021).</li>
<li>Lambeth, C. R., White, L. J., Johnston, R. E., De Silva, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry-based+assay+for+titrating+dengue+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry-based assay for titrating dengue virus.</a> J Clin Microbiol. 43 (7), 3267-3272 (2005).</li>
<li>Agarwal, S., Wellhausen, N., Levine, B. L., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+human+crispr-engineered+CAR-T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Production of human crispr-engineered CAR-T cells.</a> J Vis Exp. 169, e62299(2021).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Sterile+Tissue+Harvest%22">Sterile Tissue Harvest</a>. , JoVE, Cambridge, MA. (2023).</li>
<li>Giordano-Attianese, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+computationally+designed+chimeric+antigen+receptor+provides+a+small-molecule+safety+switch+for+t-cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A computationally designed chimeric antigen receptor provides a small-molecule safety switch for t-cell therapy.</a> Nat Biotechnol. 38 (4), 426-432 (2020).</li>
<li>Kuhn, N. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cd40+ligand-modified+chimeric+antigen+receptor+T+cells+enhance+antitumor+function+by+eliciting+an+endogenous+antitumor+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Cd40 ligand-modified chimeric antigen receptor T cells enhance antitumor function by eliciting an endogenous antitumor response.</a> Cancer Cell. 35 (3), 473-488.e6 (2019).</li>
<li>Jin, C., Ma, J., Ramachandran, M., Yu, D., Essand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR+T+cells+expressing+a+bacterial+virulence+factor+trigger+potent+bystander+antitumour+responses+in+solid+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">CAR T cells expressing a bacterial virulence factor trigger potent bystander antitumour responses in solid cancers.</a> Nat Biomed Eng. 6 (7), 830-841 (2022).</li>
<li>Kurachi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+retroviral+transduction+of+mouse+T+cells+for+in+vivo+assessment+of+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Optimized retroviral transduction of mouse T cells for in vivo assessment of gene function.</a> Nat Protoc. 12 (9), 1980-1998 (2017).</li>
<li>Jafarzadeh, L., Masoumi, E., Fallah-Mehrjardi, K., Mirzaei, H. R., Hadjati, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+persistence+of+chimeric+antigen+receptor+%28CAR%29+T+cell+in+adoptive+cancer+immunotherapy%3A+Challenges+and+ways+forward%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Prolonged persistence of chimeric antigen receptor (CAR) T cell in adoptive cancer immunotherapy: Challenges and ways forward.</a> Front Immunol. 11, 702(2020).</li>
<li>Elkassar, N., Gress, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+IL-7+biology+and+its+use+in+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunotoxicol%22%5BJournal%5D)">An overview of IL-7 biology and its use in immunotherapy.</a> J Immunotoxicol. 7 (1), 1-7 (2010).</li>
<li>Osinalde, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+dissection+and+comparison+of+IL-2+and+IL-15+signaling+pathways+by+global+quantitative+phosphoproteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Simultaneous dissection and comparison of IL-2 and IL-15 signaling pathways by global quantitative phosphoproteomics.</a> Proteomics. 15 (2-3), 520-531 (2015).</li>
<li>Eremenko, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+protocol+for+the+retroviral+transduction+of+mouse+CD4+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">An optimized protocol for the retroviral transduction of mouse CD4 T cells.</a> STAR Protoc. 2 (3), 100719(2021).</li>
<li>Lewis, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reproducible+method+for+the+expansion+of+mouse+CD8%2B+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A reproducible method for the expansion of mouse CD8+ T lymphocytes.</a> J Immunol Methods. 417, 134-138 (2015).</li>
</ol>

לא הוכרז על ניגוד עניינים.

פרוטוקול זה מתאר את השלבים והריאגנטים הדרושים להתמרה רטרו-ויראלית של תאי T מורין כדי ליצור תאי CAR-T עבור מחקרי in vivo . אופטימיזציה של תנאי התמרה רטרו-ויראלית משיגה ביטוי CAR חזק ללא צורך בריכוז נגיפי באמצעות אולטרה-צנטריפוגה או ריאגנטים נוספים. עם זאת, ישנם שינויים מרובים שניתן ליישם על מתודולוגיה זו.
בעוד פרוטוקול זה מתאר את הדור לדוגמה של CAR ספציפי GFP, שיטות אלה יכולות להיות מותאמות כדי ליצור תאי CAR-T עכבר המכוונים לכל אנטיגן חוץ-תאי של עניין. הווקטור הרטרו-ויראלי pMSCV_PGK המשמש במחקר זה מאפשר שחרור יעיל של רצף ננו ספציפי ל-GFP על ידי עיכול אנזימטי עם NotI ו-BamHI וניתן להחליפו בתחום זיהוי אנטיגן המוגדר על-ידי המשתמש כגון scFv, ננו-גוף או תחום קושר ליגנדים (קובץ משלים 1). כדי להקל על הערכת ביטוי CAR חלופי, מומלץ לתכנן מכוניות עם תג אפיטופ N-terminal, כגון תגי Myc (EQKLISEEDL) או Flag (DYKDDDDK), אשר ניתן לזהות באמצעות נוגדנים מצומדים פלואורסצנטית12. יתר על כן, המחקר הנוכחי מדגים ייצור של טרנסגן יחיד; עם זאת, שילוב של פפטידים המתנתקים מעצמם (רצפי 2A) או אתרי כניסה פנימיים של ריבוזום (IRES) יאפשר ייצור משותף של טרנסגנים מרובים, כולל טכנולוגיות נוספות לשיפור תפקוד תאי T in vivo 8,13,14.
למרות שפרוטוקול זה פותח כדי לבטל את הצורך בציוד מיוחד על ידי השמטת אולטרה-צנטריפוגה (24,000 x גרם, 2 שעות, 4 מעלות צלזיוס), ראוי לציין כי ריכוז הסופרנאטנט הנגיפי יכול להשיג טיטרים נגיפיים גבוהים יותר ולהפחית את נפח הנגיף הדרוש להשגת ביטוי CAR גבוה8. פרוטוקול זה גם מייעל את הייצור הווקטורי הרטרו-ויראלי על ידי השגת טיטרים נגיפיים גבוהים (~ 2 x 10,7 TU/mL) וביטוי CAR יציב ללא צורך בקביעת טיטר נגיפי לפני השימוש. עם זאת, בנוסף להקלה על התקינה, קביעת טיטר נגיפי לפני התמרה של תאי T עשויה גם להגדיל את הכדאיות של תאי T על ידי הפחתת רעילות פוטנציאלית הנגרמת על ידי ריכוזים נגיפיים גבוהים שלא לצורך10,15.
תוספת של IL-7 ו- IL-15 מומלצת לקידום התרחבות תאי T ולשימור אוכלוסיות זיכרון תאי T; עם זאת, IL-2 אנושי רקומביננטי עשוי לשמש כחלופה כדי להפחית את מספר הריאגנטים הדרושים לתרבות ex vivo 16,17,18,19. אף על פי כן, השיטות ליצירת תאי CAR-T המתוארות כאן נותרו מוגבלות על ידי ההתפשטות הדלה יחסית של תאי T מורינים. עם זאת, ניתן לשפר עוד יותר את האמצעים לשיפור הכדאיות של תאי T שנדונו לעיל על ידי הכללת תוספים נוספים ו-2-ME במדיום תרבית mTCM לאורך תהליך הטרנסדוקציה20. בעוד ששינויים אלה עשויים לשפר את התרחבות תאי T מפי 15 עד פי20 פי 20, הם עשויים לגרום ליעילות התמרה נמוכה יותר ולביטוי CAR מופחת.
בסופו של דבר, הייצור של תאי CAR-T מורין מאפשר פיתוח מודלים סינגניים להערכת תפקוד תאי CAR-T בתוך מערכת חיסון שלמה - מה שמקל על הערכה ספציפית להקשר של עוצמתם, עמידותם ובטיחותם. ואילו מודלים בעכברים מדוכאי חיסון מאפשרים מחקרים פרה-קליניים חשובים של מוצר תאי T אנושיים המכוון לאנטיגן של גידול אנושי. השילוב של מערכות מודל משלימות אלה יהיה הכרחי להבנת המורכבות של הביולוגיה של תאי CAR-T, אופטימיזציה של עיצובי CAR חדשים, ובסופו של דבר תרגום ממצאים פרה-קליניים לטיפולים קליניים יעילים.

טיפולים מאומצים בתאי T המבטאים קולטני אנטיגן כימריים (CARs) חוללו מהפכה בתחום האימונותרפיה לסרטן על ידי רתימת כוחה של מערכת החיסון הנרכשת כדי להתמקד ספציפית בתאי סרטן חיוביים לאנטיגןולחסל אותם 1. בעוד ההצלחה של טיפולים בתאי CAR-T המכוונים לממאירויות של תאי B אוששה קלינית, מחקרים פרה-קליניים שבוצעו במודלים של בעלי חיים נותרו חיוניים לפיתוח CARs חדשים המכוונים לגידולים מוצקים. עם זאת, יעילות קלינית מוגבלת הוכחה באינדיקציות גידול מוצקות עד כה, ומתברר יותר ויותר כי מודלים פרה-קליניים בודדים אינם מנבאים במדויק את הפרמקודינמיקה והיעילות הקלינית של תרופה חיה 2,3. לכן, החוקרים החלו להרחיב את המחקר הפרה-קליני של תוצרי תאי CAR-T כך שיכלול הערכות מקבילות בקסנוגרפט ובמודלים סינגניים של סרטן אנושי וסרטן מורין, בהתאמה.
בניגוד למודלים של קסנוגרפט, שבהם גידולים אנושיים ותאי T מושתלים בעכברים מדוכאי חיסון, מודלים סינגניים מאפשרים לבחון תגובות של תאי CAR-T בהקשר של מערכת חיסון מתפקדת. באופן ספציפי, עכברים בעלי כשירות חיסונית הנושאים גידולים סינגניים מספקים מערכת לחקר האינטראקציה בין תאי T שהועברו באופן מאומץ לבין מילייה ספציפי להקשר - כולל מקרופאגים הקשורים לגידול (TAMs) ותאי T רגולטוריים (Tregs) הידועים כמדכאים את תפקוד תאי T במיקרו-סביבה של הגידול (TME)4,5,6. יתר על כן, מודלים סינגניים מציעים פלטפורמה נוספת להערכת רעילות ממוקדת, מחוץ לגידול, ואינטראקציה של תאי CAR-T עם גורמים מארחים שעלולים להוביל לרעילות נוספת, כולל תסמונת שחרור ציטוקינים7.
למרות יתרונות אלה, מספר המחקרים הסינגניים בתאי CAR-T נותר מוגבל. יש לציין כי מודלים סינגניים דורשים הנדסה אוטולוגית של תאי CAR-T מאותו זן עכבר ולכן מהווים אתגר נוסף בשל היעדר מתודולוגיה להתמרה יעילה של תאי T מורין והרחבת ex vivo 2,8. פרוטוקול זה מתאר את השיטות להשגת ביטוי CAR יציב באמצעות ייצור וקטורים רטרו-ויראליים והתמרה אופטימלית של תאי T. סכמה של התהליך כולו מוצגת באיור 1. השימוש בגישה זו מדגים התמרה רטרו-ויראלית יעילה של תאי CAR-T מורין והשגת ביטוי CAR גבוה ללא צורך בריכוז נגיפי באמצעות אולטרה-צנטריפוגה. אסטרטגיות לשינוי ספציפיות האנטיגן של מבנה CAR נדונות בנוסף לביטוי משותף של טרנסגנים נוספים.

<table><tbody><tr><td>0.45 &mu; מסנני</td><td>m MilliporeSigma SLHVR33RS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מזרק 1 מ"ל&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק&nbsp;</td><td>14-955-450</td><td></td></tr><tr><td>צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק&nbsp;</td><td>05-408-135</td><td></td></tr><tr><td>מזרק 10 מ"ל&nbsp;</td><td>BD</td><td>14-823-16E</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu; m מסננת</td><td>קורנינג</td><td>07-201-432</td><td></td></tr><tr><td>15 ס"מ TC כלי תרבית תאים מטופלים</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>130183</tr><tr><td>צינורות חרוטיים 15 מ"ל&nbsp;</td><td>פלקון</td><td>14-959-70C</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; מסננת M&nbsp;</td><td>קורנינג</td><td>07-201-430</td><td></td></tr><tr><td>צינורות חרוטיים 50 מ"ל&nbsp;</td><td>פלקון</td><td>14-959-49A</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; מסננת m</td><td>קורנינג</td><td>07-201-431</td><td></td></tr><tr><td>Attune NxT זרימה ציטומטר&nbsp;</td><td>תרמו-פישר סיינטיפיק&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BALB/C, בן 6-8 שבועות&nbsp;</td><td>מעבדת ג'קסון</td><td>651</td><td></td></tr><tr><td>B-מרקפטואתנול&nbsp;</td><td>ג'יבקו</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין&nbsp;</td><td>GOLDBIO</td><td>A-420-500</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ג'יבקו</td> בינוני <td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מלח פוספט (PBS) של Dulbecco, ללא סידן ומגנזיום&nbsp;</td><td>גיבקו</td><td>14-190-250</td><td></td></tr><tr><td>מגנט DynaMag-2&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>12-321-D</td><td></td></tr><tr><td>מגנט EasySep&nbsp;</td><td>Stemcell Technologies</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>ערכת בידוד תאי T של עכבר EasySep</td><td>Stemcell Technologies</td><td>19851</td><td></td></tr><tr><td>מאגר FACS&nbsp;</td><td>BD</td><td>BDB554657</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)&nbsp;</td><td>קורנינג</td><td>MT35011CV</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35-050-061</td><td></td></tr><tr><td>G-REX6</td><td>Wilson Wolf</td><td>80240M&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת חיץ HEPES&nbsp;</td><td>ג'יבקו</td><td>15-630-080</td><td></td></tr><tr><td>IL-15 רקומביננטי אנושי&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-765</td><td></td></tr><tr><td>רקומביננטי אנושי IL-2</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-748</td><td></td></tr> Human <tr><td>recombinant IL-7</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-363</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000</td><td>Invitrogen</td><td>L3000008</td><td></td></tr><tr><td>MEM תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>עכבר Anti-CD3 BV421</td><td>Biolegend</td><td>100228</td><td></td></tr><tr><td>עכבר Anti-CD3 / CD28 Dynabeads</td><td>Gibco</td><td>11-453-D</td><td></td></tr><tr><td>עכבר נגד CD4 BV605</td><td>BD</td><td>563151</td><td></td></tr><tr><td>עכבר נגד CD44 APC&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>103011</td><td></td></tr><tr><td>עכבר אנטי-CD62L PE-Cy7</td><td>Tonbo</td> מק"ט <td>60-0621-U025</td><td></td></tr><tr><td>עכבר נגד CD8 APC-CY7</td><td>Tonbo</td> מק"ט <td>25-0081-U025</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Ti2 עם מצלמת Prime 95B&nbsp;</td><td>ניקון</td><td></td><td></td></tr><tr><td>לא מטופל 24 צלחות באר&nbsp;</td><td>CytoOne</td><td>CC7672-7524</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>31-985-062</td><td></td></tr><tr><td>pCL-Eco</td><td>Addgene</td><td>#12371</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>Gibco</td><td>15-070-063</td><td></td></tr><tr><td>תאי פניקס אקו</td><td>ATCC</td><td>CRL-3214</td><td></td></tr><tr><td>pMDG.2</td><td>Addgene</td><td>#12259</td><td></td></tr><tr><td>pMSCV_PGK_GFP28z</td><td>לא ישים</td><td>הופק על ידי R.LV.</td><td></td></tr><tr><td>sfGFP מטוהר</td><td>N/A</td><td>מיוצר על ידי R.LV.</td><td></td></tr><tr><td>RetroNectin ('מגיב התמרה')</td><td>Takara Bio</td><td>T100B</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>21875</td><td></td></tr><tr><td>פיפטה סרולוגית 10 מ"ל</td><td>פישר סיינטיפיק&nbsp;</td><td>13-678-11E</td><td></td></tr><tr><td>פיפטה סרולוגית 25 מ"ל</td><td>פישר סיינטיפיק&nbsp;</td><td>13-678-11</td><td></td></tr><tr><td>פיפטה סרולוגית 5 מ"ל</td><td>פישר סיינטיפיק&nbsp;</td><td>13-678-11D</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פירובט</td><td>Gibco</td><td>11-360-070</td><td></td></tr><tr><td>TC מטופל 24 צלחות באר&nbsp;</td><td>קורנינג</td><td>08-772-1</td><td></td></tr><tr><td>טריפאן כחול&nbsp;</td><td>ג'יבקו</td><td>15-250-061</td><td></td></tr></tbody></table>

ייצור יעיל של תאי קולטן אנטיגן כימרי (car)-t

Efficient Generation of Murine Chimeric Antigen Receptor (CAR)-T Cells

טיפולים תאיים מהונדסים המשתמשים בתאי קולטן אנטיגן כימרי (CAR)-T השיגו יעילות יוצאת דופן באנשים עם ממאירויות המטולוגיות ונמצאים כעת בפיתוח לטיפול בגידולים מוצקים מגוונים. עד כה, ההערכה הראשונית של תוצרי תאי CAR-T חדשים התרחשה בעיקר במודלים של גידולי קסנוגרפט באמצעות עכברים מדוכאי חיסון. גישה זו נבחרה כדי להקל על קליטה מוצלחת של תאי CAR-T אנושיים בסביבה הניסויית. עם זאת, מודלים סינגניים של עכברים, שבהם גידולים ותאי CAR-T נגזרים מאותו זן עכבר, מאפשרים הערכה של טכנולוגיות CAR חדשות בהקשר של מערכת חיסון מתפקדת ומיקרו-סביבה מקיפה של הגידול (TME). הפרוטוקול המתואר כאן נועד לייעל את תהליך ייצור תאי CAR-T בעכבר על ידי הצגת שיטות סטנדרטיות להתמרה רטרו-ויראלית ולתרבית תאי T ex vivo . השיטות המתוארות בפרוטוקול זה יכולות להיות מיושמות על מבני CAR אחרים מעבר לאלה המשמשים במחקר זה כדי לאפשר הערכה שגרתית של טכנולוגיות CAR חדשות במערכות הכשירות למערכת החיסון.

הפרוטוקול המתואר כאן נועד לתקנן את תהליך התמרה של תאי T מורין ליצירת תאי CAR-T עכבריים. איור 1 מספק תיאור מפורט של השלבים המעורבים. התהליך מתחיל בייצור וקטורים רטרו-ויראליים באמצעות טרנספקציה משותפת של רכיבים נגיפיים לתאי Phoenix Eco. איור 2 מספק תמונה של הצפיפות האופטימלית של תאי Phoenix Eco ביום הטרנספקציה. תאי T מבודדים מופעלים 24 שעות לאחר הטרנספקציה, או "יום 0" של פרוטוקול זה, כהכנה להתמרה ביום 1. לאחר הטרנסדוקציה, תאי CAR-T מתורבתים בנוכחות IL-7 ו- IL-15 אנושיים רקומביננטיים כדי להשיג הרחבת קיפול מספקת תוך שימור אוכלוסיות זיכרון תאי גזע.
השימוש בערכת בידוד תאי T המומלצת (ראו טבלת חומרים) עם פרוטוקול זה מניב טוהר תאי T של &lt;98% לפני הטרנסדוקציה, כפי שנקבע על-ידי ציטומטריית זרימה (איור 3A). יתר על כן, ניתן להשיג שיעורי ביטוי CAR ניתנים לשחזור של 65%-75% באמצעות פרוטוקול זה והווקטור הרטרו-ויראלי pMSCV שונה כדי לבטא את מבנה ה-CAR ממקדם PGK (איור 3B,C). קביעה של טיטר רטרו-ויראלי מגלה טיטרים של עד ~2 x 107 TU/mL וביטוי CAR של 74% עם 1/3rd של supernatant נגיפי שנקצר לאחר טרנספקציה משותפת של pMSCV עם pCL-Eco (איור משלים 1).
לבסוף, תרבית ex vivo עם 10 ננוגרם/מ"ל של IL-7 ו-IL-15 מובילה להתרחבות של בערך פי 15, וכתוצאה מכך ~150 x 106 תאי T עד יום 10 לאחר ההפעלה מטחול יחיד (איור 3D). תרבית עם IL-7 ו-IL-15 מובילה לתדרי תאי T דומים מסוג CD8+ ו-CD4+ (איור 3E) ולאוכלוסיות זיכרון תאי גזע שמורות שנקבעו על-ידי ביטוי CD62L+CD44 לאחר 10 ימים של תרבית ex vivo (איור 3F).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65887/65887fig01.jpg"> איור 1: סקירת פרוטוקולים. לוח עליון: סקירה סכמטית של ציר הזמן של הפרוטוקול. לוח תחתון: הוראות שלב אחר שלב לייצור וקטור רטרו-ויראלי והתמרה של תאי T בעכבר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65887/65887fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65887/65887fig02.jpg"> איור 2: צפיפות תאים אופטימלית עבור טרנספקציה. תמונה במיקרוסקופ ברייטפילד של תאי Phoenix Eco בצפיפות האופטימלית לפני ההדבקה עם pMSCV ו-pCL-Eco. צולם באמצעות עדשת 10x אובייקטיבית. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65887/65887fig02large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65887/65887fig03.jpg"> איור 3: ייצור תאי Murine CAR-T ותרבית ex vivo. (A) תרשים ציטומטריית זרימה המראה את התדירות של תאי +CD3 BALB/c לאחר בידוד תאי T מורין. (B) ייצוג סכמטי של הווקטור הרטרו-ויראלי pMSCV המשמש לביטוי GFP-CAR בתאי T מורינים. (C) היסטוגרמות ציטומטריית זרימה המדגימות ביטוי פני שטח CAR על תאי T של עכבר לאחר הדגירה עם sfGFP מטוהר. UT, ללא טרנספורמציה. (D) קפל את התפשטות תאי CAR-T עד היום ה-10 לאחר ההפעלה ותרבית עם IL-17 ו-IL-15 אנושיים רקומביננטיים. בערך 8 x 106 תאי T מורין הופעלו לפני ההתמרה והגיעו בערך 1.28 x 108 ביום 10 לאחר ההפעלה. (E) תרשים ציטומטריית זרימה המראה את התדירות של תאי CAR-T CD8+ ו- CD4+ ביום ה- 10 לאחר ההפעלה. (F) תרשים ציטומטריית זרימה המדגים את התדירות של אוכלוסיות זיכרון תאי CD8+ T שנקבעה על ידי ביטוי פני השטח CD62L ו- CD44. זיכרון תאי גזע (TSCM) מאופיין על ידי CD62L + CD44-, זיכרון מרכזי (TCM) על ידי CD62L + CD44+ וזיכרון אפקט (TEM) על ידי CD62L-CD44+ . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65887/65887fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
טבלה 1: ניסוח מדיה של תרבית תאים. פרטי הניסוח של מדיית תרבית התא המשמשת בפרוטוקול. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65887/65887_Table%201.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>
איור משלים 1: ביטוי פני השטח של CAR וטיטרים רטרו-ויראליים. (A) היסטוגרמות ציטומטריית זרימה המראות ביטוי פני שטח של CAR על תאי T מסוג BALB/c לאחר הדגירה עם sfGFP מטוהר. רטרו-וירוס נוצר על ידי הדבקת תאי Phoenix Eco עם pMSCV_PGK_mGFP28z בשילוב עם pCL-Eco ו-pMD2.G (I), pCL-Eco (II) או לבד (III). תאי T הומרו ברטרו-וירוס מדולל כפי שצוין. (B) טיטרים רטרו-ויראליים הנקבעים על ידי ביטוי פני השטח של תאי T מותמרים. יחידות התמרות (TU)/mL חושבו באמצעות הנוסחה: (N∙F∙D)/V, כאשר N הוא מספר התאים המומרים (1 x 105), F הוא התדירות של תאי CAR+ , D הוא גורם הדילול, ו- V הוא נפח ההולכה במ"ל (0.2 מ"ל). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65887/Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
קובץ משלים 1: רצף וקטורי ביטוי pMSCV. הרצף של GFP28z CAR ורצפי איגוף (נטוי) בווקטור הביטוי pMSCV, כאשר אתרי האנזימים NotI ו-BamHI מסומנים בכחול. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65887/Supplementary%20File%201.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>

פרוטוקול זה מייעל את הייצור הווקטורי הרטרו-ויראלי ואת התמרת תאי T מורין, ומאפשר ייצור יעיל של תאי CAR-T בעכבר.

ייצור יעיל של תאי קולטן אנטיגן כימרי (CAR)-T

Engineered cell therapies utilizing chimeric antigen receptor (CAR)-T cells have achieved remarkable effectiveness in individuals with hematological ...

המחקר שלנו בוחן שילובים יעילים של חיידקים מהונדסים ותאי CAR T לטיפול בגידולים מוצקים. חשוב לנו לחקור כיצד שני טיפולים תאיים אלה פועלים בהקשר של מערכת חיסון שלמה באמצעות מודלים סינגניים של סרטן השחלות. חקר תפקודם של תאי CAR T במודלים סינגניים של גידולים הוגבל על ידי היעדר פרוטוקולים סטנדרטיים ליצירת תאי T מסוג CAR מורין.תאי T מורינים קשים במיוחד להמרה בתרבית ex vivo בשיטות מסורתיות. פיתחנו פרוטוקול זה כדי לייעל את הייצור של תאי T מסוג MURINE CAR כדי לאפשר מחקר במודלים סינגניים המספקים הקשר חשוב להערכת הפעילות של טכנולוגיות CAR חדשות.

efficient-generation-of-murine-chimeric-antigen-receptor-car-t-cells

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

סרטון זה מדגים טכניקה לייצור קולטן אנטיגן כימרי (CAR) תאי T ex vivo. תאי T אנושיים מודגרים בחרוזים מגנטיים המצופים בנוגדנים נגד CD3 ונגד CD28, יחד עם מדיום בתוספת אינטרלוקין-2 (IL-2), המוביל להפעלה ושגשוג של תאי T. מוצגים וקטורים לנטי-ויראליים טרנסגניים, המאפשרים לרנ"א המהונדס להשתלב בגנום המארח ולבטא את הטרנסגן. התוצאה היא שתאי T המומרים מבטאים קולטני אנטיגן כימריים (CARs) על פני השטח שלהם. תאי T נקצרים בנקודות זמן מוגדרות כדי להעריך ביטוי CAR ושימור בהקפאה.

טכניקת Ex Vivo לייצור תאי T קולטני אנטיגן כימריים

סרטון זה מדגים טכניקה ליצירת תאי T מסוג קולטן אנטיגן כימרי ספציפי לגידול (CAR). וקטורים רטרו-ויראליים הנושאים RNA מהונדס מעורבבים עם תאי טחול בתווך בתוספת אינטרלוקין-2 כדי לקדם הישרדות ושגשוג של תאי T. לאחר מכן התערובת מועברת לצלחת המצופה במקטעי פיברונקטין אנושיים רקומביננטיים וצנטריפוגה כדי להקל על איחוי הנגיף עם התא, מה שמאפשר לרנ"א להשתלב בגנום המארח ולייצר מכוניות הקשורות לפני השטח המכוונות לאנטיגן הגידול.

טכניקת Ex Vivo ליצירת תאי T קולטני אנטיגן כימריים ספציפיים לגידול

סרטון זה מדגים טכניקה ליצירת תאי T של קולטן אנטיגן כימרי ספציפי לאנטיגן (CAR) באמצעות התמרה רטרו-ויראלית. תאי מורין CD8+ T פעילים מתווספים לצלחת מיקרווול המצופה בשברי פיברונקטין רקומביננטיים. לאחר מכן מוצגים וקטורים רטרו-ויראליים המכילים RNA מהונדס המקודד קולטן אנטיגן כימרי ספציפי לאנטיגן (CAR), והלוחית עוברת צנטריפוגה כדי להקל על הטרנסדוקציה. לאחר הדגירה, התאים המומרים מבטאים CARs ספציפיים לאנטיגן על פני השטח שלהם.

טכניקה ליצירת תאי CAR T ספציפיים לאנטיגן

ניתן למנף את ההשפעות הלימפודו-דפלטיביות והאימונומודולטוריות של טיפול סטנדרטי בכימותרפיה והקרנות כדי לשפר את היעילות האנטי-גידולית של אימונותרפיה של תאי T. אנו מתארים שיטה ליצירת תאי T קולטני אנטיגן כימריים ספציפיים ל-EGFRvIII (CAR) ומתן אותם בהקשר של סטנדרט הטיפול בגליובלסטומה.

דור של תאי T CAR למאמצת תרפיה בהקשר של גליובלסטומה טיפול סטנדרטי

אנו מתארים כמותית בזמן אמת במערכת החשיבה של הפריה חוץ גופית כדי להעריך את העוצמה של מערכת הקולטן אנטיגן כימאריק תאי T מיקוד תאי הגידול נוזלי ומוצק. פרוטוקול זה ניתן להרחיב כדי להעריך תאים אחרים החיסון החיסונית, כמו גם טיפולים משולבים.

שיטת העוצמה בזמן אמת עבור שצ אנטיגן קולטן התאים T המיקוד תאים מוצק המטולוגי סרטן

אנו מתארים גישה מהימנה ליצור הקולטן אנטיגן הצ (רכב) T תאים ולבדוק בידול שלהם ותפקוד מבחנה בvivo.

ייצור בצ הקולטן אנטיגן (רכב) T תאים לטיפול חיסוני המאמצת

מאמר זה מתאר פרוטוקול עבור הדור של תאים CD8 T ספציפיים אנטיגן, ואת התרחבות שלהם בתוך מבחנה, עם מטרה של מספר גבוה מניב של תאי T פונקציונלי לשימוש מבחנה ובvivo.

יעילות גבוהה הדור של העכבר העיקרי של אנטיגן בתאי T ציטוטוקסיים לבדיקות פונקציונליות במודל סוכרת אוטואימוניות

פרוטוקול זה מספק זרימת עבודה יעילה ליצירה ובדיקה של תאי T רגולטוריים של קולטני אנטיגן כימריים אנושיים (CAR Tregs).

יצירת תאי T רגולטוריים של קולטן אנטיגן כימרי אנושי

פרוטוקול זה מתאר הליך מפורט ליצירת תאי T קולטני אנטיגן כימריים חולפים (CAR) באמצעות mRNA לא משולב לאימונותרפיה לסרטן ומספק שיטות אמינות להערכת תאי CAR-T ותפקודם ציטוטוקסי.

גישה לא ויראלית ליצירת תאי T קולטני אנטיגן כימריים חולפים באמצעות mRNA לאימונותרפיה לסרטן

כאן, אנו מתארים שיטה ליצירת טיפות תחליב כפולות המכילות תא T אחד ותא מטרה סרטני כדי לבחון הרג תאים ברמת התא הבודד. שיטה זו מאפשרת כימות כפול הן של מולקולות ציטוטוקסיות והן של אפופטוזיס של תאי מטרה בתוך אוכלוסייה גדולה של תאי T.

בדיקת ציטוטוקסיות מבוססת טיפות להערכת תאי T קולטני אנטיגן כימריים ברמת התא הבודד

למד פרוטוקול יעיל לייצור תאי CAR-T ממושקעים בדגמים סינגניים של עכברים. שיטה זו משפרת את יעילות השיבוץ ומאפשרת חקר מערכת החיסון השלמה בטיפול בגידולים מוצקים.

ייצור יעיל של תאי קולטן אנטיגן כימרי (CAR)-T

גלה סרטונים נוספים