Name: בידוד אסטרוציטים טהורים ותאי מיקרוגליה מחוט השדרה של העכבר הבוגר עבור בדיקות חוץ גופיות ומחקרי שעתוק (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-20T12:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: למדו לבודד אסטרוציטים ותאי מיקרוגליה מחוט השדרה של עכבר בוגר לצורך מחקרים חוץ גופיים. פרוטוקול זה מאפשר ניתוח תאי תגובות מורפולוגיות וחיים של 92-93% לחקר מחלות מערכת העצבים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לקאסל ראלי ב-George Washington University Genomics Core עבור ניתוחי RNA ול-Q2 Lab Solutions עבור ניתוחי ריצוף RNA. עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי להפרעות נוירולוגיות ושבץ מוחי [מענק מספר F31NS117085] וקרן המחקר ע"ש ויויאן גיל לד"ר רוברט ה. מילר. איור 1 נוצר באמצעות BioRender.com.

כל הליכי הטיפול בבעלי חיים והניסויים נערכו לאחר אישור הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים בבית הספר לרפואה ומדעי הבריאות של אוניברסיטת ג'ורג' וושינגטון (וושינגטון הבירה, ארה"ב; IACUC #2021-004). המחקר כלל עכברים זכרים ונקבות מסוג C57BL/6J (WT) בגילאי 10 שבועות עד 5 חודשים, שמקורם בספק מסחרי (ראו טבלת חומרים) ושוכנו באוניברסיטת ג'ורג' וושינגטון. סקירה כללית של זרימת העבודה של הפרוטוקול מוצגת באיור 1.
1. הכנת חוט השדרה
<ol><li>מרדימים את בעלי החיים באמצעות אברטין (12.5 מ"ג/מ"ל של 2,2,2-טריברומואתנול ו-2.5% 2-מתיל-2-בוטנול במים סטריליים) (ראו טבלת חומרים). אשר את היעדר התגובה לצביטות בבוהן ובזנב בעכברים.</li>
	<li>בצע זילוח לב עם מי מלח חוצצים פוספט (DPBS) קר 1x Dulbecco כדי להסיר תאים חד-גרעיניים היקפיים בדם.<ol><li>מניחים את החיה על מגש רדוד ולבצע חתך לרוחב כדי לחשוף את חלל pleural. הכנס מחט זילוח 23 G המחוברת למשאבה פריסטלטית (ראה טבלת חומרים) לחדר השמאלי והפעל את המשאבה. ברגע DPBS קר זורם דרך הלב, ליצור חתך קטן באטריום הימני. הערה: קצב זילוח מהיר יותר עדיף בשלב זה כדי לשפר את כדאיות התא. יש לשטוף את הדם תוך פחות מדקה. ניקוי הכבד מצביע על זילוח מוצלח.</li>
	</ol></li>
	<li>ערפו את ראשו של בעל החיים באמצעות מספריים גדולים והסירו את עמוד השדרה14. טבלו אותו ב-DPBS קר 1x עם Ca2+/Mg2+/0.2% גלוקוז בצלחת פטרי על קרח לשטיפת רקמות.</li>
	<li>החל מעכשיו, ודא שכל השלבים מתבצעים בסביבה סטרילית. השתמש בשחול הידראולי14 כדי לבודד את חוט השדרה כולו. השתמש במחט 18 גרם ומזרק 10 מ"ל מלא DPBS קר 1x עם Ca2+/Mg2+/0.2% גלוקוז. העבירו את חוט השדרה לצלוחית פטרי המונחת על שקיות קרח המכילות מספיק DPBS קר 1x עם Ca2+/Mg2+/0.2% גלוקוז כדי לטבול את הרקמה כולה.</li>
	<li>בזהירות להסיר את קרומי המוח תחת מיקרוסקופ בתוך מכסה מנוע זרימה למינרית. מעבירים את חוט השדרה לצלחת פטרי ריקה על חבילות קרח, ובאמצעות אזמל כירורגי מס '10 להב, חותכים את חוט השדרה כולו למקטעים של 2-3 מ"מ.</li>
</ol>2. דיסוציאציה אנזימטית של תאים
<ol><li>הוסף תערובת אנזימים 1 ותערובת אנזימים 2 מערכת הדיסוציאציה המוחית למבוגרים הזמינה באופן מסחרי בהתאם לפרוטוקול היצרן (ראה טבלת חומרים). מערבלים את האנזימים בצלחת מספר פעמים כדי להבטיח ציפוי אחיד של חוט השדרה, ואז דוגרים בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות. כל 5 דקות, מערבלים בעדינות את המנה כדי למנוע גושי רקמות ולהקל על הפצה אחידה של ריאגנטים.</li>
	<li>מוציאים את הצלוחית מהאינקובטור ומוסיפים 350 μL של 0.46 מ"ג/מ"ל DNAse I ב-Minimal Essential Medium (MEM) (ראה טבלת חומרים). מערבבים בעדינות.</li>
	<li>יש להוסיף 1 מ"ל של DMEM קר/סרום בקר עוברי 0.5% (FBS) ולערבב בעדינות. מיד להעביר את התוכן כולו לצינור 5 מ"ל.</li>
</ol>3. דיסוציאציה מכנית של תאים
<ol><li>באמצעות פיפטה P1000, Triturate בעדינות את הרקמה שלוש פעמים, להבטיח כי חתיכות רקמה נמשכים בכל פעם כדי לנתק עוד יותר את הרקמה. לאחר מכן, באמצעות פיפטה פסטר מזכוכית 9 אינץ' מחוברת, טרטור בעדינות חמש פעמים נוספות, כדי להבטיח שלא ייווצרו בועות במהלך התהליך.</li>
	<li>מניחים את הצינור 5 מ"ל זקוף ומאפשרים לרקמה להתיישב בתחתית במשך 30 שניות. לאחר שהרקמה התיישבה, ציירו את הסופרנאטנט באמצעות פיפטה P1000 והעבירו אותו דרך מסנן של 30 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי של 15 מ"ל.</li>
	<li>לאותו צינור 5 מ"ל עם הרקמה הנותרת, הוסף 1 מ"ל של DMEM קר / 0.5% FBS. בעזרת פיפטה של פסטר, טריטורט בעדינות שלוש פעמים.</li>
	<li>תנו לרקמה לשקוע בתחתית למשך 30 שניות, ואז העבירו את הסופרנאטנט דרך מסנן של 30 מיקרומטר ואספו אותו לאותו צינור של 15 מ"ל כמו קודם. חזור על שלב 3.3 ושלב 3.4 פעם נוספת.</li>
	<li>צנטריפוגה את מתלה התא המסונן ב 300 x גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT). בזהירות להסיר ולהשליך את supernatant שנוצר באמצעות שואב ואקום.</li>
</ol>4. הסרת מיאלין
<ol><li>הסר את המיאלין באמצעות הפתרון להסרת פסולת (DRS) המסופק בערכת דיסוציאציה מוחית למבוגרים בהתאם לפרוטוקול היצרן. לאחר הסרת הפסולת, הוסף 5 מ"ל של DMEM קר / 0.5% FBS לגלולת התא והפוך בעדינות את הצינור שלוש פעמים. צנטריפוגה את מתלה התא ב 300 x גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT). הערה: אם התאים ישמשו למחקרי מבחנה ויישארו בתרבית, יש להשתמש במקום זאת ב- DMEM / 0.5% FBS שחומם מראש.</li>
	<li>יש להשליך את הסופרנאטנט ולהשהות מחדש את כדורית התא ב-1 מ"ל של DPBS/0.5% FBS (קר למחקרי RNA וחם לבדיקות במבחנה ). ספרו את התאים והעריכו את הכדאיות באמצעות Trypan Blue. הערה: ניתן לשלב תרחיפים של תאים מבעלי חיים מרובים כדי להגדיל את ריכוז התאים.</li>
	<li>שטף את התאים על-ידי הוספת DPBS/0.5% FBS עד לנפח כולל של 5 מ"ל. צנטריפוגו את המתלים ב 300 x גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר והשליכו את הסופרנאטנט באמצעות פיפטה.</li>
</ol>5. בידוד מיקרוגליה ואסטרוציטים
<ol><li>תייג את התאים עם מיקרו-כדוריות אנטי-CD11b או אנטי-ACSA-2 בהתאם לפרוטוקול היצרן (ראה טבלת חומרים).</li>
	<li>מיין את התאים לפי בחירה חיובית באמצעות עמודות MS בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים). לאחר המיון, צנטריפוגו את התאים הממוינים ב 300 x גרם במשך 10 דקות ולזרוק את supernatant.</li>
</ol>6. ציפוי תאים לבדיקות חוץ גופיות
הערה: אם התאים לא יהיו מצופים וישמשו באופן מיידי לניתוח RNA, המשך לשלב 8.
<ol><li>להשעות מחדש את התאים ב 1 מ"ל של DMEM חם / 0.5% FBS. ספרו את התאים והעריכו את יכולת הקיום שלהם באמצעות המציטומטר (ראו טבלת חומרים).</li>
	<li>כוונן את ריכוז התא ל- 75,000 תאים לכל 50 מיקרוליטר. הוסף 50 μL של תרחיף התא לכל כיסוי מצופה פולי-L-ליזין11 בצלחת של 24 בארות.</li>
	<li>יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך שעתיים כדי לאפשר לתאים להיצמד לכיסוי.</li>
	<li>יש להוסיף בזהירות 450 μL של DMEM חם/5% FBS/פניצילין-סטרפטומיצין (Pen-Strep, ראו טבלת חומרים) לכל באר.</li>
	<li>לאחר 3 ימים, החלף מחצית מהמדיה ב- 250 μL של DMEM חם / 5% FBS / Pen-Strep. לתחזוקה, החלף לחלוטין את המדיה עם 500 μL של DMEM חם / 5% FBS / Pen-Strep כל 4-5 ימים.</li>
</ol>7. אימונוהיסטוכימיה
הערה: עדיף לבצע ניתוחים אימונוהיסטוכימיים לאחר 3 ימים לפחות כאשר המדיה הוחלפה לפחות פעם אחת. זה מבטיח שהפסולת הוסרה והתאים נדבקו לחלוטין לכיסוי.
<ol><li>הסר את המדיה ותייג את התאים עם mAb O4 נגד עכבר (1:100) (ראה טבלת חומרים) בסרום DMEM חם/5% FBS/10% רגיל של עזים (NGS) למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר (RT) או ב-37°C. הערה: דלג על שלב זה והמשך לשלב 7.3 אם התאים לא יסומנו ב- O4.</li>
	<li>שטפו בעדינות את הכיסויים על ידי טבילתם ב-DMEM/5% FBS חם שלוש פעמים. הוסף עז נגד עכבר 594 IgM (1: 300) (ראה רשימת חומרים) ב- DMEM חם / 5% FBS / 10% NGS ודגור ב- RT במשך 15 דקות בחושך. יש לשטוף בעדינות שלוש פעמים ב-DMEM חם/FBS 5%.</li>
	<li>תקן את התאים עם 5% חומצה אצטית / מתנול קר במשך 15 דקות ב 4 ° C. יש לשטוף שלוש פעמים עם 1x PBS, ולאחר מכן לתייג עם הנוגדן המתאים: GFAP נגד ארנבים (1: 500), GFAP נגד עכבר (1: 500), או נגד ארנב Iba1 (1: 500) ב 1% Triton-X100/10% NGS ב 1x DPBS (ראה טבלת חומרים). דגירה במשך שעה אחת ב- RT. הערה: יש לשמור את הכיסויים בחושך אם הם כבר הוכתמו ב-O4.</li>
	<li>יש לשטוף בעדינות שלוש פעמים עם PBS. תווית עם הנוגדן המשני המתאים: נגד עכבר 594 IgG (1: 500), נגד ארנב 488 IgG (1: 500) (ראה טבלת חומרים). דגירה במשך 30 דקות ב- RT בחושך.</li>
	<li>יש לשטוף בעדינות שלוש פעמים עם PBS. כתם נגדי עם DAPI (1:1000) למשך דקה אחת ב-RT. יש לשטוף שלוש פעמים עם PBS, להוסיף אמצעי הרכבה (ראו טבלת חומרים) ולהרכיב כיסויים על שקופיות.</li>
</ol>8. מיצוי RNA
הערה: באופן אידיאלי, צריכים להיות לפחות 100,000 תאים כדי לחלץ מספיק RNA לניתוח. במידת הצורך, ניתן לשלב תאים מ 2-3 חוטי שדרה.
<ol><li>חלץ RNA באמצעות ערכת בידוד RNA מסחרית בהתאם לפרוטוקול היצרן (ראה טבלת חומרים). עבור כל שלב שטיפה עם חיץ הכביסה RW1 המסופק בערכה, השאירו את התאים במאגר הכביסה למשך 2 דקות נוספות.</li>
	<li>הסר את כל הדנ"א הגנומי שנותר באמצעות DNase I בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים). יש לדגור עם DNase ב-RT למשך 15 דקות, ולאחר מכן לשטוף עם חיץ RW1.</li>
	<li>כדי להגדיל את תפוקת הרנ"א, לפני ההדבקה, יש לדגור על הדגימות במים נטולי RNAse ב-RT למשך 10 דקות. להעריך את שלמות הרנ"א ואת כמותו, באמצעות ביואנלייזר15 (ראה טבלת חומרים).</li>
</ol>

חילוץ יעיל של אסטרוציטים ותאי מיקרוגליה מחוט השדרה של העכבר הבוגר

<ol><li>Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte-endothelial+interactions+at+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier.</a> Nat Rev Neurosci. 7, 41-53 (2006).</li>
<li>Heithoff, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+are+necessary+for+blood-brain+barrier+maintenance+in+the+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Astrocytes are necessary for blood-brain barrier maintenance in the adult mouse brain.</a> Glia. 69 (2), 436-472 (2021).</li>
<li>Badimon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+feedback+control+of+neuronal+activity+by+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Negative feedback control of neuronal activity by microglia.</a> Nature. 586, 417-423 (2020).</li>
<li>Yanuck, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+phagocytosis+of+neurons%3A+diminishing+neuronal+loss+in+traumatic%2C+infectious%2C+inflammatory%2C+and+autoimmune+CNS+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Microglial phagocytosis of neurons: diminishing neuronal loss in traumatic, infectious, inflammatory, and autoimmune CNS disorders.</a> Front Psychiatry. 10, 712(2019).</li>
<li>Xu, Y. J., Au, N. P. B., Ma, C. H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+phenotypic+diversity+of+microglia%3A+implication+for+microglia-based+therapies+for+alzheimer%E2%80%99s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Aging+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Functional and phenotypic diversity of microglia: implication for microglia-based therapies for alzheimer’s disease.</a> Front Aging Neurosci. 14, 896852(2022).</li>
<li>Song, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial-oligodendrocyte+interactions+in+myelination+and+neurological+function+recovery+after+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Microglial-oligodendrocyte interactions in myelination and neurological function recovery after traumatic brain injury.</a> J Neuroinflammation. 19 (1), 246(2022).</li>
<li>Butler, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+phagocytosis+of+neurons+in+neurodegeneration%2C+and+its+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Microglial phagocytosis of neurons in neurodegeneration, and its regulation.</a> J Neurochem. 158 (3), 621-639 (2021).</li>
<li>Voskuhl, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+astrocytes+form+scar-like+perivascular+barriers+to+leukocytes+during+adaptive+immune+inflammation+of+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Reactive astrocytes form scar-like perivascular barriers to leukocytes during adaptive immune inflammation of the CNS.</a> J Neurosci. 29 (37), 11511-11522 (2009).</li>
<li>Bordon, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAFG+activity+in+astrocytes+drives+CNS+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">MAFG activity in astrocytes drives CNS inflammation.</a> Nature Reviews Immunology. 20, 205(2020).</li>
<li>Agalave, N. M., Lane, B. T., Mody, P. H., Szabo-Pardi, T. A., Burton, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture%2C+and+downstream+characterization+of+primary+microglia+and+astrocytes+from+adult+rodent+brain+and+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture, and downstream characterization of primary microglia and astrocytes from adult rodent brain and spinal cord.</a> J Neurosci Methods. 340, 108742(2020).</li>
<li>Kerstetter, A. E., Miller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+spinal+cord+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of spinal cord astrocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 814, 93-104 (2012).</li>
<li>Hersbach, B. A., Simon, T., Masserdotti, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+direct+neuronal+reprogramming+of+mouse+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and direct neuronal reprogramming of mouse astrocytes.</a> J Vis Exp. (185), 64175(2022).</li>
<li>Nikodemova, M., Watters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+isolation+of+live+microglia+with+preserved+phenotypes+from+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain.</a> J Neuroinflammation. 9, 147(2012).</li>
<li>Richner, M., Jager, S. B., Siupka, P., Vaegter, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydraulic+extrusion+of+the+spinal+cord+and+isolation+of+dorsal+root+ganglia+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Hydraulic extrusion of the spinal cord and isolation of dorsal root ganglia in rodents.</a> J Vis Exp. (119), e55226(2017).</li>
<li>Davies, J., Denyer, T., Hadfield, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioanalyzer+chips+can+be+used+interchangeably+for+many+analyses+of+DNA+or+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Bioanalyzer chips can be used interchangeably for many analyses of DNA or RNA.</a> Biotechniques. 60 (4), 197-199 (2016).</li>
<li>Ahn, J. J., Islam, Y., Miller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type+specific+isolation+of+primary+astrocytes+and+microglia+from+adult+mouse+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Cell type specific isolation of primary astrocytes and microglia from adult mouse spinal cord.</a> J Neurosci Methods. 375, 109599(2022).</li>
<li>Pan, J., Wan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodological+comparison+of+FACS+and+MACS+isolation+of+enriched+microglia+and+astrocytes+from+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Methodological comparison of FACS and MACS isolation of enriched microglia and astrocytes from mouse brain.</a> J Immunol Methods. 486, 112834(2020).</li>
<li>Neuschulz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-cell+RNA+labeling+strategy+for+measuring+stress+response+upon+tissue+dissociation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">A single-cell RNA labeling strategy for measuring stress response upon tissue dissociation.</a> Mol Syst Biol. 19, 11147(2023).</li>
<li>CB, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+brain-all+cells%3A+a+comprehensive+protocol+to+isolate+all+principal+cns-resident+cell+types+from+brain+and+spinal+cord+of+adult+healthy+and+EAE+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">One brain-all cells: a comprehensive protocol to isolate all principal cns-resident cell types from brain and spinal cord of adult healthy and EAE mice.</a> Cells. 10 (3), 1-25 (2021).</li>
</ol>

ללא

הבידוד של תאים ראשוניים טהורים וברי קיימא הוא בעל חשיבות עליונה לחקר המבנה והתפקוד של סוגי תאים ספציפיים. בעכבר בוגר, במיוחד בחוט השדרה, משימה זו מציבה אתגרים משמעותיים, מכיוון שהפרוטוקולים הקיימים לרוב אינם מותאמים לחוט השדרה הבוגר10,17. פרוטוקול זה מציג שיטה יעילה וחסכונית הישימה ליישומים שונים במורד הזרם, כולל תרבית תאים, ציטומטריית זרימה, היסטולוגיה ומחקרי שעתוק.
מהירות הכנת חוט השדרה ממלאת תפקיד מכריע בהבטחת כדאיות תאים אופטימלית ...

אסטרוציטים ותאי מיקרוגליה הם תאי גלייה רב-תכליתיים הממלאים תפקידים חיוניים במערכת העצבים המרכזית (CNS), וכוללים תחומי אחריות כגון ויסות התפקוד העצבי, תרומה להתפתחות מערכת העצבים המרכזית, שמירה על מחסום הדם-מוח והשתתפות בתהליכים קריטיים אחרים 1,2,3,4 . מלבד תפקידם בשמירה על הומאוסטזיס, תאי גלייה אלה ממלאים גם תפקיד מרכזי במנגנוני פציעה ותיקון. תאי מיקרוגליה ידועים ביכולות הפאגוציטיות, הדלקתיות והנדידה שלהם בעקבות עלבונות או פציעות 5,6,7. תגובות אסטרוציטים במחלות מגוונות באותה מידה, וכוללות תרומות לדלקת, להיווצרות צלקות גלייה ולפשרה של מחסום הדם-מוח 8,9. למרות שהבנתנו את התפקידים המזיקים והמשניים של מיקרוגליה ואסטרוציטים במערכת העצבים המרכזית גדלה, ההטרוגניות המובנית הן במבנה והן בתפקוד שלהם מחייבת כלים חזקים לחקור אותם בהקשרים שונים.
השגת תובנה נוספת לגבי תפקידם של מיקרוגליה ואסטרוציטים בבריאות ובמחלות דורשת גישה משולבת של חקירות in vivo ו - in vitro . טכניקות In vivo ממנפות את האינטראקציה המורכבת בין תאי גלייה ונוירונים בתוך מערכת העצבים המרכזית, בעוד שמתודולוגיות in vitro מוכיחות ערך בעת הערכת תפקודים או תגובות של תא בודד תחת גירויים ספציפיים. כל שיטה מציעה יתרונות ייחודיים; מחקרי מבחנה חיוניים להבנת התפקידים הספציפיים של סוגי תאים אלה ללא קלט ישיר או עקיף מתאים שכנים. בנוסף, בדיקות במבחנה המשתמשות בקווי תאים בני אלמוות מציגות יתרונות מסוימים, כולל היכולת להתרבות ללא הגבלת זמן, יעילות כלכלית וקלות תחזוקה. עם זאת, חשוב לציין כי תאים ראשוניים מחקים באופן הדוק יותר תגובות פיזיולוגיות נורמליות בהשוואה לקווי תאים. רלוונטיות פיזיולוגית זו חיונית בבדיקות תפקודיות ובניתוחים תעתיקים.
אחד האתגרים בהשגת תאים ראשוניים, במיוחד מחוט השדרה של עכבר בוגר, טמון בכמות ובכדאיות הדגימות. חוט השדרה הבוגר, בהיותו קטן יותר מהמוח ומכיל כמות משמעותית של מיאלין, מציב קשיים ייחודיים. בעוד שישנם מספר פרוטוקולים שפורסמו המפרטים את הבידוד של תאי גלייה טהורים וברי קיימא מבעלי חיים בילודים או ממוח העכבר הבוגר 10,11,12,13, מתודולוגיות אלה עשויות שלא להתאים לחקר מחלות ופציעות ספציפיות לחוט השדרה. בפרוטוקול זה, אנו מציעים הליך מקיף לבידוד יעיל של מיקרוגליה ואסטרוציטים טהורים וברי קיימא מחוט השדרה של העכבר הבוגר, מה שמקל על יישומים במורד הזרם בתרביות תאים ובניתוחי שעתוק. פרוטוקול זה שימש בהצלחה לבידוד תאים אלה מעכברים בוגרים בגילאי 10 שבועות עד 5 חודשים, והדגים את יעילותו בהקשרים שונים, כולל מחקרים שכללו עכברי נוקאאוט מותנה, תגובות לתרופות, מחקר התפתחותי ומודלים הקשורים לגיל.

<table><tbody><tr><td>2,2,2-Tribromoethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T48402</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבית רקמות 24 באר</td><td>Avantor</td><td>10861-558</td><td></td></tr><tr><td>2-Methyl-2-butanol, 98%</td> <td>Thermo Fisher</td><td>A18304-0F</td><td></td></tr><tr><td>4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>45% תמיסת גלוקוז</td><td>קורנינג</td><td>25-037-CI</td><td></td></tr><tr><td>5 מ"ל צינורות מכוסים</td><td>Eppendorf</td><td>30122305</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אצטית</td><td>Sigma-Adlrich</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>ערכת דיסוציאציה מוחית</td><td>למבוגרים Miltenyi</td><td>103-107-677</td><td></td></tr><tr><td>Anti-ACSA2 Microbead Kit</td><td>Miltenyi</td><td>130-097-679</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Iba1</td><td>Wako</td><td>019-1974</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyzer</td><td>Agilent טכנולוגיות</td><td>G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>עכברי טבע (WT) C57BL/6J&nbsp;</td>מעבדות <td></td><td></td><td>ג'קסון</td></tr><tr><td>CD11b (מיקרוגליה) מיקרו-חרוזים</td><td>Miltenyi</td><td>130-093-634</td><td></td></tr><tr><td>Celltrics 30 ומיקרו; m filter</td><td>Sysmex Partec</td><td>04-004-2326</td><td></td></tr><tr><td>תא ספירה (המציטומטר)</td><td>Hausser Scientific Co</td><td>3200</td><td></td></tr><tr><td>Deoxyribonuclease I מלבלב בקר</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4527-40KU</td><td></td></tr><tr><td>מים מזוקקים</td><td>TMO</td><td>15230001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermo Fisher</td><td>11320074</td><td></td></tr><tr><td>DNase לטיהור RNA</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's</td><td>Thermo Fisher</td><td>14040117</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Thermo Fisher</td><td>A5209401</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן GFAP (עכבר)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-33673</td><td>1:500</td></tr><tr><td>נוגדן GFAP (ארנב)</td><td>Dako</td><td>Z0334</td><td>1:500</td></tr><tr><td>עז נגד עכבר 594 IgG</td><td>Invitrogen</td><td>a11032</td><td>1:500</td></tr><tr><td>עיזים נגד עכבר 594 IgM</td><td>Invitrogen</td><td>a21044</td><td>1:300</td></tr><tr><td>עיזים נגד ארנב 488 IgG</td><td>Invitrogen</td><td>a11008</td><td>1:500</td></tr><tr><td>נוגדן Iba1 (ארנב)</td><td>Wako</td><td>019-1974</td><td>1:500</td></tr><tr><td>מפריד MACS</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex C/L מערכת משאבות</td><td>תרמו פישר</td><td>77122-22</td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>Corning</td><td>15-015-CV</td><td></td></tr><tr><td>מתנול</td><td>סיגמא-אדלריך</td><td>439193</td><td></td></tr><tr><td>הרכבה</td><td>מעבדות וקטור</td> בינוני <td>H-1000-10</td><td></td></tr><tr><td>MS עמודות</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>O4 נוגדן</td><td>מו"פ & D</td><td>MAB1326</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>Gibco</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Plugged 9 אינץ' זכוכית פסטור פיפטה</td><td>VWR</td><td>14672-412</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Plus Micro Kit</td><td>Qiagen</td><td>74034</td><td></td></tr><tr><td>Royal-tek להב אזמל כירורגי מס' 10</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-079-683</td><td></td></tr><tr><td>סט עירוי ורידים קטנים, 23 גרם x 19 מ"מ</td><td>Kawasumi</td><td>D3K2-23G</td><td></td></tr></tbody></table>

בידוד אסטרוציטים טהורים ותאי מיקרוגליה מחוט השדרה של העכבר הבוגר עבור בדיקות חוץ גופיות ומחקרי שעתוק

Isolation of Pure Astrocytes and Microglia from the Adult Mouse Spinal Cord For In Vitro Assays and Transcriptomic Studies

אסטרוציטים ותאי מיקרוגליה ממלאים תפקידים מרכזיים בהתפתחות מערכת העצבים המרכזית, תגובות פציעה ומחלות נוירודגנרטיביות. תאים דינמיים מאוד אלה מפגינים תגובות מהירות לשינויים סביבתיים ומפגינים הטרוגניות משמעותית במונחים של מורפולוגיה, פרופילי שעתוק ופונקציות. בעוד שהבנתנו את תפקודם של תאי גלייה בבריאות ובמחלות התקדמה באופן משמעותי, עדיין יש צורך בניתוחים חוץ-גופיים, ספציפיים לתאים שנערכו בהקשר של עלבונות או פציעות כדי לאפיין באופן מקיף אוכלוסיות תאים נפרדות. בידוד תאים מהעכבר הבוגר מציע מספר יתרונות על פני קווי תאים או בעלי חיים בילוד, שכן הוא מאפשר ניתוח של תאים בתנאים פתולוגיים ובנקודות זמן ספציפיות. יתר על כן, התמקדות בבידוד ספציפי לחוט השדרה, למעט מעורבות מוחית, מאפשרת מחקר על פתולוגיות של חוט השדרה, כולל אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית, פגיעה בחוט השדרה וטרשת אמיוטרופית צידית. פרוטוקול זה מציג שיטה יעילה לבידוד אסטרוציטים ותאי מיקרוגליה מחוט השדרה של העכבר הבוגר, ומאפשר ניתוח מיידי או עתידי עם יישומים פוטנציאליים במחקרים פונקציונליים, מולקולריים או פרוטאומיים במורד הזרם.

השיטות המתוארות בפרוטוקול זה מאפשרות בידוד של מיקרוגליה ואסטרוציטים טהורים וברי קיימא מחוט השדרה של העכבר הבוגר, ומקלות על יישומים שונים במורד הזרם, כולל בדיקות פונקציונליות או היסטולוגיות במבחנה וניתוח RNA.
בידוד מוצלח למחקרי מבחנה יביא להתרבות תאים רציפה במשך מספר ימים. תאים בוגרים מציגים קצב התרבות איטי יותר בהשוואה לתאים שבודדו מבעלי חיים בילודים, וחלק מהפסולת עשויה להיות נוכחת בימים הראשונים. לאחר 4 ימים במבחנה (DIV), התאים צריכים להיות נקיים במידה רבה מפסולת, כ...

פרוטוקול זה מתאר את הבידוד של אסטרוציטים מטוהרים ותאי מיקרוגליה מחוט השדרה של העכבר הבוגר, ומקל על יישומים עתידיים כגון ניתוח RNA ותרבית תאים. הוא כולל שיטות ונהלים מפורטים לדיסוציאציה של תאים שנועדו לשפר הן את האיכות והן את התפוקה של תאים מבודדים.

Astrocytes and microglia play pivotal roles in central nervous system development, injury responses, and neurodegenerative diseases. These highly dynamic ...

מטרת המחקר שלנו היא לאפיין אוכלוסיות תאים ספציפיות במערכת העצבים המרכזית, ובפרט בחוט השדרה, באמצעות מודלים פרה-קליניים של מחלות. ואנחנו מנסים לקבוע כיצד תאים אלה מושפעים בתנאים פתולוגיים ובנקודות זמן שונות. זה יכול להיות מאתגר לנתח תאים, במיוחד במערכת העצבים המרכזית מכיוון שהתאים במוח ובחוט השדרה יוצרים מטריצה מורכבת מאוד והכל מחובר בצורה הדוקה מאוד, כך שיכול להיות קשה לבודד תאים אלה מבלי לפגוע במערכת.הפרוטוקול שלנו מטפל במגבלות בשיטות הקיימות לחקר מחלות חוט השדרה על ידי בידוד יעיל של אסטרוציטים של מיקרוגליה בת קיימא מחוט השדרה של עכבר בוגר קטן עשיר במיאלין. זה מאפשר מחקר חוץ גופי על מחלות הקשורות לחוט השדרה בניתוח במורד הזרם, וממלא פער מחקרי מכריע. פרוטוקול זה מציג מספר יתרונות כגון ניתוח אסטרוציטים ותאי מיקרוגליה בתנאים פתולוגיים ובנקודות זמן ספציפיות.הוא גם מתמקד באופן ייחודי בבידוד תאי גלייה מחוט השדרה הבוגר הזה בלבד, למעט מעורבות מוחית. זה מאפשר לחוקרים לחקור פתולוגיות חוט השדרה ברמה התאית.

isolation-pure-astrocytes-microglia-from-adult-mouse-spinal-cord-for

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

בסרטון זה אנו מתארים את השיטה להשגת הכנה טהורה של אסטרוציטים מעכברים שזה עתה נולדו.

בידוד אסטרוציטים: שיטה להשגת הכנה טהורה של אסטרוציטים קורטיקליים של עכבר

הסרטון מדגים טכניקה לבידוד תאי מיקרוגליה מקליפת המוח של מוח עכבר בוגר. ראשית, קליפת המוח עוברת סגמנטציה והומוגניזציה כדי להסיר תאי עצב ותאי גלייה אחרים, תוך שמירה על תאי מיקרוגליה. לאחר מכן, תרחיף התא נחשף למיקרו-כדוריות מגנטיות אנטי-מיאלין ולשדה מגנטי, המפריד ביעילות תאי מיקרוגליה ומיאלואיד מפסולת המיאלין ותאים המכילים מיאלין.

בידוד תאי מיקרוגליה מקליפת המוח של מוח עכבר בוגר

האסטרוציטים הוכרו כתאים צדדיים המשתתפים בתהליכים ביולוגיים בסיסיים שחיוניים להתפתחות המוח ותפקודו תקין, ותיקון מערכת עצבים מרכזי. כאן אנו מציגים הליך מהיר לקבלת תרבויות astrocyte עכבר טהורות ללמוד ביולוגיה בכיתה זו גדולה של תאים במערכת עצבים מרכזיים.

בידוד ותרבות של האסטרוציטים עכבר קליפתיים

מפתח אחד לחקירה מוצלחת של הביולוגיה microglial הוא שימור immunofunction microglial vivo לשעבר במנותק מרקמת מערכת העצבים המרכזית. בידוד מיקרוגליה דרך תוצאות רועדות סיבוביות בתרביות תאים טהורות וimmunofunctional מאוד כפי שהוערך על ידי הדמיה ניאון, immunocytochemistry, והפעלת מיקרוגליה הבאות ELISA עם lipopolysaccharide מעודדי דלקת הגירויים (LPS) ופאם 3 צסק"א 4 (פאם).

בידוד של קליפת המוח Microglia עם immunophenotype משומר ופונקציונאלי מילודי Murine

התפתחות כאב נוירופתי כרוך שינויים פתולוגיים של תאי גלייה בחוט השדרה. מערכת תרבות גליה אמינה נגזרה רקמת חוט שדרה מבוגרת ועוצבה ללימוד תאים אלה במבחנה חסרה. לכן, אנו מציגים כאן כיצד להקים תרבויות גליה מעורבות עיקריות מרקמות כבל מבוגר עכבר שדרה.

הכנת תרבויות גליה מעורבת ראשיים מרקמות קורד למבוגרים עכבר השדרה

פרוטוקול עבור בידודו של ראשי מיקרוגלייה מן המוח מאתר מוצג. טכניקה זו מסייעת בהבנה הנוכחי של מחלות נוירולוגיות. צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות הפרדה מגנטית משולבים כדי לייצר תשואה מספקת של מדגם מאוד טהור. יתר על כן, אנו חלוקה לרמות את השלבים עבור אפיון מיקרוגלייה.

אפיון ובידוד של העכבר מיקרוגלייה העיקרי על ידי צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות

אנו מספקים פרוטוקול עבור בידוד של מיקרוגלייה מאזורים בגזור שונים של המוח העכבר באמצע המחצית, ואחריו הכנה חצי אוטומטי הספריה לרצף העמוק של RNA תא בודד של טרנססקריפט באורך מלא. שיטה זו תסייע להבהיר טרוגניות תפקודית של מיקרוגלייה בריאות ומחלות.

בידוד של אזור-מיקרוגליה ספציפי מתוך חצי הכדור השני של המוח העכבר עבור רצפי RNA של תא יחיד בודד

פיתחנו שיטה המעשירה ומבודדת אוכלוסיות אסטרוציטים אנושיות מרקמה קפואה טרייה לשימוש בניתוחים מולקולריים במורד הזרם.

בידוד של אוכלוסיות אסטרוציטים אנושיות בוגרות מקורטקס קפוא טרי באמצעות מיון גרעינים המופעלים על ידי פלואורסצנציה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד וטיהור מיקרוגליה ראשונית במודלים של בעלי חיים של מחלות דה-מיאלינציה, תוך שימוש במיון תאים המופעלים על ידי מגנטים.

בידוד של מיקרוגליה ראשונית של עכבר על ידי מיון תאים המופעלים מגנטית במודלים של בעלי חיים של Demyelination

כאן אנו מתארים פרוטוקול מפורט ליצירת תרביות מועשרות מאוד של אסטרוציטים שמקורם באזורים שונים במערכת העצבים המרכזית של עכברים לאחר הלידה ואת המרתם הישירה לנוירונים פונקציונליים על ידי ביטוי כפוי של גורמי שעתוק.

בידוד ותכנות מחדש ישיר של נוירונים של אסטרוציטים של עכברים

מיקרוגליה נחשבים לחלק מהתאים הרבגוניים ביותר בגוף, המסוגלים להסתגלות מורפולוגית ותפקודית. ההטרוגניות והרב-תכליתיות שלהם מאפשרות שמירה על הומאוסטזיס מוחי, תוך שהם קשורים גם לפתולוגיות נוירולוגיות שונות. כאן מתוארת טכניקה לטיהור מיקרוגליה של חוט השדרה.

העשרה מהירה ויעילה של תאי מיקרוגליה בחוט השדרה של עכבר

למדו לבודד אסטרוציטים ותאי מיקרוגליה מחוט השדרה של עכבר בוגר לצורך מחקרים חוץ גופיים. פרוטוקול זה מאפשר ניתוח תאי תגובות מורפולוגיות וחיים של 92-93% לחקר מחלות מערכת העצבים.

בידוד אסטרוציטים טהורים ותאי מיקרוגליה מחוט השדרה של העכבר הבוגר עבור בדיקות חוץ גופיות ומחקרי שעתוק

גלה סרטונים נוספים