כימות ציטוטוקסיות תאית תלוית נוגדנים במודל ספרואידי גידול: יישום לגילוי תרופות

אחד הטיפולים הממוקדים היעילים ביותר בסרטן מבוסס על נוגדנים כגון נוגדן anti-HER2 trastuzumab. הפעולה האנטי-סרטנית של trastuzumab כרוכה בציטוטוקסיות תלויית תאים תלוית נוגדנים, ADCC, על ידי תאי הרג טבעי או NK. הבנת מנגנונים המווסתים את רגישותם של תאים סרטניים לטיפול בנוגדנים נגד גורמי גדילה תוך התייחסות מיוחדת ל- ADCC עשויה להיות חיונית לפיתוח שיטות טיפול חדשניות ויעילות יותר.

מודלים תלת-ממדיים כגון ספרואידים של תאים סרטניים הוכיחו את עצמם כטובים יותר בניבוי תגובות חיסוניות של גידולים לטיפולים אנטי-סרטניים שונים. לכן, הקמנו מודל ספרואיד ADCC באמצעות קו תאי הרג טבעי NK92, תאי קרצינומה של השד JIMT-1 המבטאים GFP וטרסטוזומאב. הקמנו את מערכת בדיקת ADCC על ידי גרימת תאי קרצינומה של השד JIMT-1 חיוביים נגד HER2 ליצור אשכולות תלת ממדיים הנקראים ספרואידים.

קו התאים JIMT-1 ששימש בניסויים מבטא ביציבות את החלבון הפלואורסצנטי הירוק. אנו מתחילים את הניסוי על ידי הכנת צלחת 96 בארות להיווצרות ספרואידים. על מנת ליצור תחתית בצורת U ודוחה תאים, צפו את הצלחת בעלת 96 הבארות בתמיסה של 0.5% אגרוז ב-PBS.

דוגרים על הצלחת בטמפרטורת החדר כ-30 עד 45 דקות. בינתיים, טריפסיניזציה וספירת תאי JIMT-1 לזריעת תאים. לשטוף את התאים עם שני מיליליטר של PBS סטרילי.

הוסיפו שני מיליליטר של טריפסין-EDTA לצלוחית, והחזירו את הבקבוק לאינקובטור CO2 למשך 10 דקות. לאחר הדגירה, הקש על הבקבוק כדי לבדוק אם תאי JIMT-1 התנתקו. עצור את העיכול עם שני מיליליטר של מדיה JIMT-1, ולאסוף את תרחיף התא לתוך צינור 50 מיליליטר.

ספור את התאים עם Trypan Blue בתא Burker, והתאם את מספר התא ל -20, 000 תאים למ"ל. זרעו את התאים לתוך צלחת 96 בארות על ידי pipeting 100 microliters תאים תרחיף לכל באר עבור היווצרות spheroids. אפשרו לתאים להתגבש יחד במהלך זמן הדגירה בן שלושת הימים בטמפרטורה של 37 מעלות באינקובטור CO2.

בדוק את הגודל והצורה של ספרואידים באופן קבוע עם מיקרוסקופ הפוך. ביום השלישי לאחר השראת הספרואידים, יש לצפות את צלחת ההקרנה בעלת התכולה הגבוהה 96 בארות בתמיסה של F-127 פלורוני ב-DMSO. ציפוי חיוני למניעת חיבור של כדורי JIMT-1 EGFP למשטח הזכוכית או לצלחת.

לאחר תקופת דגירה של 45 דקות בטמפרטורת החדר, שאפו את תמיסת הציפוי, ושטפו את הבארות פעמיים עם מדיה ללא סרום DMEM F12. מעבירים את הספרואידים לצלחת ההקרנה בעלת 96 בארות בעלות תוכן גבוה בטריפליקטים באמצעות פיפטה של מיליליטר אחד. הוסף סוניטיניב לבארות בריכוז של 40 מיקרומולר ב-10 מיקרוליטר לבאר, ופיפטה טרייה JIMT-1 לבארות הבקרה כדי להעלות את הנפח.

לדגור על הצלחת במשך שעה באינקובטור CO2 ב 37 מעלות. בעוד הדגירה של הספרואידים שטופלו מראש נמשכת, לאסוף את תאי NK92 מן הבקבוק לתוך צינור 15 מיליליטר. ספור את התאים עם Trypan Blue בתא Burker, והתאם את מספר התא כדי להגיע ליחס אפקט למטרה של 20 ל- 1.

הכתימו את תאי ה-NK בתמיסה של 10 מיקרומולרית של CellTracker Blue, והכניסו אותם לאינקובטור CO2 למשך שעה אחת ב-37 מעלות. כדי לשטוף את עודפי הצבע, צנטריפוגו את תאי ה-NK פעמיים בטמפרטורה של 150 RCF למשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן השהה מחדש את התאים במדיה JIMT-1 טרייה.

הוסף את תאי ה- NK המוכתמים לספרואידים JIMT-1 EGFP היעד על ידי פיפטציה של 55 מיקרוליטר לבאר יחד עם נוגדן נגד HER2 trastuzumab. לדלל trastuzumab במדיה JIMT-1 כדי להגיע לריכוז של 10 מיקרוגרם למ"ל. הוסף את 110 מיקרוליטר של מדיה JIMT-1 טרי לבארות הבקרה, ודגר על הצלחת במשך 24 שעות באינקובטור CO2 ב 37 מעלות.

כתוצאה מכך, נפח הטיפול הכולל שנוסף ל- ADCC הוא 110 מיקרוליטר, וריכוז הסוניטיניב הסופי הוא 20 מיקרומול לליטר. כדי לזהות ולמדוד מוות של תאים אפופטוטיים לאחר הטיפולים, הכתימו את הספרואידים עם Annexin V Alexa Fluor 647 מצומד למשך שעה אחת במדיה JIMT-1. לאחר סיום שלבי הניסוי, העבר את הצלחת למכשיר ניתוח התוכן הגבוה.

הצלחת מצולמת 24 שעות לאחר הוספת גורמי NK לתאי המטרה. עבור הדמיה, אנו משתמשים במנתח תוכן גבוה ובתוכנת ניתוח תמונה. בחרו את סוג המיקרו-לוחית מרשימת הלוחות באמצעות האפשרות 'סוג לוחית'.

השתמש בצלחת הקרנה בעלת תוכן גבוה של 96 בארות. בחר שני מיקודים אוטומטיים עם שיא כמו הבדיקות שבוצעו בלוחות עם יעד 10x עם צמצם מספרי 0.3, באמצעות אפשרויות המיקוד האוטומטי והאובייקטיבי בהתאמה. בחר מצב Confocal עם האפשרות OptiMode, והחל Binning 2 על שימוש באפשרות Binning.

להדמיית ספרואידים, בחרו בערוצים המתאימים בעזרת האפשרות 'בחירת ערוץ'. כדי לזהות את תאי JIMT-1 המשולבים ב-EGFP, בחר EGFP עם זמן אינטגרציה של 200 אלפיות השנייה, עוצמת לייזר של 50%, גובה ערימה של שני מיקרומטר, עירור של 488 ננומטר ואורכי גל של פליטה של 500, 550 ננומטר. וכדי לזהות תאים אפופטוטיים, השתמש ב- Alexa 647 עם זמן אינטגרציה של 100 אלפיות השנייה, עוצמת לייזר של 50%, גובה ערימה של 10 מיקרומטר, עירור של 640 ננומטר, אורכי גל של פליטה של 650, 760 ננומטר.

כדי להמחיש את תאי ה- NK בתוך הספרואידים, בחר את הערוץ הבא, DAPI עם זמן אינטגרציה של 100 אלפיות השנייה, עוצמת לייזר של 50%, גובה ערימה של שני מיקרומטר, עירור של 405 ננומטר ואורך גל פליטה של 435, 418 ננומטר. באפשרות בחירת פריסה, בחר Z stacks מכיוון שתאים בכדורים נוטים להיות במישורי מוקד שונים של המיקרוסקופ. 10 מטוסים עם מרחק של 10 מיקרומטר מספיקים כדי לכסות את כל האזור הספרואידי.

הגדר את ערכי המישור הראשון והמישור האחרון על 0 מיקרומטר ו- 90 מיקרומטר, בהתאמה. לפני תחילת המדידה, ניתן לצלם תמונות לדוגמה באמצעות פונקציית Snapshot כדי לבדוק את ההגדרות הנכונות. הגדר את מספר הבארות והשדות להדמיה באמצעות האפשרות פריסה מוגדרת.

זהה את הספרואידים לפי תאי פלואורסצנטיות EGFP או JIMT-1 באמצעות האפשרות Fine Texture Region וסנן אותם לפי גודל. הסר אובייקטי גבול באמצעות מודול בחירת אוכלוסייה. מכיוון שתאי ה-Annexin-positive מופיעים על הספרואידים ההיקפיים, מודדים את עוצמת ה-Annexin בטבעת האפופטוטית.

במודול Select Region, הגדר את הגבול החיצוני למינוס 90. בטא ערכי עוצמת Annexin כעוצמה ממוצעת. כפי שצוין על ידי צביעת Annexin V, תוספת של תאי NK ו trastuzumab לתאי JIMT-1 גרמה למוות תאים בכדורי הגידול.

תאים אפופטוטיים חיוביים הופיעו באזור ההיקפי של הספרואידים. עם זאת, בהיעדר trastuzumab, תאי NK לא עוררו אפופטוזיס של תאי גידול. כדי להבחין בין ההשפעות הישירות או בתיווך ADCC של trastuzumab, trastuzumab-Fab2 חסר יכולת קישור אזור FC שימש במחקר זה כבקרה שלילית.

מכיוון ש- trastuzumab-Fab2 לא היה יעיל במודל זה, מוות של תאי גידול עשוי להיות מתווך באמצעות ADCC. יתר על כן, טיפול מקדים עם sunitinib הפחית את צביעת Annexin V בספרואידים, אישר עמידות ADCC המושרה על ידי sunitinib וחשף את מניעת מוות של תאים אפופטוטיים ב JIMT-1 spheroids מודגר יחד עם תאי NK ו trastuzumab. נתונים אלה אישרו את ההשפעה הציטוטית של סוניטיניב במודל ADCC וקוראים לזהירות בנוגע לשילובים האפשריים של אימונותרפיה מבוססת ADCC וסוניטיניב.

לסיכום, בדיקת HCS שלנו עשויה להתאים לזיהוי תרכובות מגבירות ADCC.