Name: תגובת שרשרת הכלאה RNA פלואורסצנטיות מלאה באתרה הכלאה של גנים כימו-סנסוריים בתוספות ריח יתושים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-11-17T13:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: חקור את שיטת HCR RNA WM-FISH לחקר ביטוי גנים של קולטנים כימו-חושיים באנטנות יתושי Anopheles. השיטה מאפשרת הדמיה מרובת-ממדית של קולטנים איונוטרופיים ומיפוי מרחבי של תבניות ביטוי גנים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים למרגו הררה ולמעבדת לסלי וושל על שיתוף פרוטוקול ההכלאה באתרם עבור נספחי ריח Aedes aegypti . עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכונים הלאומיים לבריאות ל- C.J.P. (NIAID R01Al137078), מלגת HHMI חנה גריי ל- J.I.R, פרס מאיץ פוסט-דוקטורט של ג'ונס הופקינס ל- J.I.R, ומלגת פוסט-דוקטורט של מכון ג'ונס הופקינס לחקר המלריה ל- J.I.R. אנו מודים למכון לחקר המלריה בג'ונס הופקינס ולקרן בלומברג על תמיכתם.

1. שיקולים והכנת חומרים
<ol><li>החלט אם הרכבה שלמה או הקפאה של רקמה תהיה מתאימה. פרוטוקול זה ממוטב להדמיית RNA באתרו בהרכבה מלאה באנטנת יתוש אנופלס ומישוש מקסילרי ללא חתך קריו. אם הדגימות עבות יותר מ-5 מ"מ, מומלץ לבצע חתך קריו-חתך כדי לאפשר חדירה לבדיקה.</li>
	<li>לזהות את הגנים המעניינים ולהעתיק את הרצפים כולל אינטרונים ואקסונים ממסד נתונים מתאים. תעתוק רצף הגן לרנ"א לסינתזה.</li>
	<li>קבע אם לרכוש בדיקות מספקים מסחריים או אם בדיקות יסונתזו במעבדה. הערה: במחקר זה, הגשושיות באתרן נרכשו מספק מסחרי (ראה טבלת חומרים). לחלופין, ניתן לסנתז אותו כפי שדווח בעבר10. ריאגנטים ששימשו במחקר מתוארים בטבלה 1. החומרים הדרושים להכנת הריאגנטים מפורטים בטבלת החומרים.</li>
</ol>2. קיבוע מראש רקמות
<ol><li>מרדימים 10-15 יתושי אנופלס קולוצי בוגרים (זן N'Gousso), בגילאי 5-10 ימים לאחר הופעתם, על ידי איסופם עם שואב פה לתוך נייר או צינור פלסטיק והנחתם בדלי המכיל קרח. ניתן לאשר הרדמה מוצלחת הנגרמת על ידי הצטננות כאשר היתושים אינם ניידים.</li>
	<li>ערפו את ראשיהם על ידי הסרת הראשים מאזור הצוואר בעזרת זוג מלקחיים. בעזרת היד הלא דומיננטית תופסים את בית החזה במלקחיים ומפרידים את הצוואר מהגוף בעזרת מלקחיים המוחזקים על ידי היד הדומיננטית. הניחו את הראשים בצינור של 1.5 מ"ל המכיל 500 מיקרוליטר של חיץ צ'יטינאז-כימוטריפסין דימתיל סולפוקסיד (חיץ CCD) על קרח. הערה: הקפאת בעלי חיים יכולה לעוות את האנטנות; מומלץ להפיל במהירות על הקרח. גילו של היתוש במהלך הבדיקה עשוי להשתנות בהתאם לפרויקט. חשוב לאשר ולתאם את מצבם הפיזיולוגי, כגון האם הם ניזונים מדם, מורעבים או מזדווגים. במחקר זה נדגמו נספחי ריח מיתושים שניזונו מדם והזדווגו.</li>
	<li>לפני חימום ראשי יתושים בחיץ CCD ב 37 ° C על בלוק חום במשך 5 דקות ולאחר מכן להעביר את הצינור המכיל את ראשי היתושים לתנור הכלאה ולסובב ב 37 ° C. זמן הדגירה במאגר CCD תלוי בסוג הרקמה. עבור אנטנות אנופלס נקביות, השתמש 20 דקות, אנטנות זכריות דורשות 15 דקות, בעוד זמן דגירה ארוך יותר (1 שעות) נדרש עבור palps מקסילרי.</li>
	<li>העבירו את כל תכולת הצינור לזכוכית שעון מנתח. מזגו בעדינות דגימה לתוך שקע זכוכית השעון (דיסקציה). אם ראשי יתושים תקועים בתוך הצינור, השתמשו בפיפטה כדי להוסיף חיץ CCD לתוך הצינור ולשטוף את הראש.</li>
	<li>השתמש במלקחיים כדי להעביר בזהירות את הראשים או כל אנטנה / palps מנותק במהלך הדגירה ולתקן 1 מ"ל של pre-fixative. הערה: ניתן לשמר מאגר CCD שאריות ב -20 ° C. ניתן לעשות שימוש חוזר במאגר עד פי 3. אם pre-fixative הופך מעט חום בגלל חיץ CCD לשאת על ידי הרקמות, להחליף אותו עם עוד 1 מ"ל של קיבוע.</li>
	<li>סובבו את הראשים בקיבוע מראש במשך 24 שעות ב-4°C באמצעות נוטטור. הערה: מהירות הנדנוד של הנוטטור ששימש במחקר זה לא הייתה ניתנת לכוונון; נעשה שימוש במהירות ברירת המחדל שנקבעה (12 סל"ד) על-ידי היצרן.</li>
</ol>3. דיסקציה של רקמות
<ol><li>יש לשטוף את הראשים 4 פעמים (5 דקות בכל שטיפה) עם 1 מ"ל של 0.1% PBS-Tween על קרח. כדי למנוע אובדן דגימה, השתמש פיפטה מחובר קצה העמסת ג'ל כדי להסיר את הנוזל. הערה: ניתן לבצע שתי שטיפות מהירות ולאחריהן שטיפה באורך 10 דקות, ושטיפה מהירה סופית במקום שלב 3.1.</li>
	<li>מעבירים את הראשים שבצינור לזכוכית שעון מנתח. מזגו בעדינות דגימה לתוך שקע של שעון. שטפו ראשי יתושים שתקועים בתוך הצינור עם 0.1% PBS-Tween.</li>
	<li>תחת מיקרוסקופ מנתח, הסר רקמות מעניינות (אנטנות/פאלפס) מהראש בעזרת מלקחיים חדים. החזק את החלק האחורי של הראש עם מלקחיים ותפוס אנטנה עם מלקחיים נוספת מהבסיס. נקו מלקחיים עם נייר טבול בממס נטול RNAse. הסר את palps באמצעות אותו תהליך.</li>
	<li>העבירו את האנטנות ואת המשטחים בעזרת מלקחיים לצינורות ריקים נטולי DNA/RNase המונחים על קרח. הפרידו את חלקי הרקמה השונים לצינורות שונים שסומנו מראש.</li>
	<li>יש לייבש רקמה ב-400 מיקרוליטר של ממס המכיל תערובת של מתנול (MeOH 80%) ודימתיל סולפוקסיד (DMSO 20%) למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. הערה: אין צורך להניח רקמה על nutator; הניחו לו לשבת על מדף צינורות בטמפרטורת החדר על ספסל המעבדה. מומלץ להשתמש בתערובת ממס טרי. לקבלת תמיסת מלאי של 500 μL, ערבבו 400 μL של MeOH עם 100 μL של DMSO.</li>
	<li>החלף את מגיב התייבשות עם 400 μL של מתנול מוחלט (100%) ולייבש רקמות לילה ב -20 ° C. לאפשר לרקמות להתיישב על ידי כוח הכבידה ולהשתמש פיפטה כדי להסיר את הנוזל. הערה: דגימות הן קיימא לתקופה ממושכת של התייבשות, עד 4 לילות נבדקו ללא אובדן אות.</li>
</ol>4. רקמה לאחר קיבוע
<ol><li>החזירו לחות לרקמות בסדרה בת ארבעה שלבים של MeOH/PBS-Tween מדורג של 400 μL למשך 10 דקות על קרח. התחל עם 75% MeOH/25% PBS-Tween ואחריו 50% MeOH / 50% PBS-Tween, לאחר מכן 25% MeOH / 75% PBS-Tween ולבסוף 100% PBS-Tween. הערה: ניתן להשתמש בקצה העמסת ג'ל עם פתח זעיר כדי להסיר את החיץ מהצינור כדי למנוע אובדן הרקמות. הסרת חיץ יכולה להיעשות תחת מיקרוסקופ ניתוח.</li>
	<li>יש לשטוף עם 400 μL של מלח חוצץ פוספט המכיל 0.1% Tween-20 (PBS-T) במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף על ידי הנחת המדגם על nutator.</li>
	<li>הכינו תמיסת פרוטאינאז-K של 20 מיקרוגרם/מ"ל ודגרו על תמיסת פרוטאינאז-K של 400 מיקרוליטר למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. הערה: לדלל 20 מ"ג / מ"ל מלאי Proteinase-K (1000x תמיסת מלאי) כלומר, 2 μL ב 2 מ"ל של 0.1% PBS-Tween. את השאריות ניתן לאחסן במקפיא -20 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>עצור עיכול אנזימטי של רקמות על ידי שטיפה 2x במשך 10 דקות עם 400 μL של 0.1% PBS-tween.</li>
	<li>מוסיפים 400 μL של הפוסט-קיבוע ודגרים במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. יש לכבס 3 פעמים, 15 דקות בכל כביסה, עם 400 מיקרוליטר של 0.1% PBS-Tween.</li>
</ol>5. הכלאה של בדיקה
<ol><li>לדגור על רקמה ב 400 μL של חיץ הכלאת בדיקה במשך 5 דקות. ודא שהרקמה שקועה לחלוטין במאגר על ידי פיפטוף עדין.</li>
	<li>היכונו לשלב הבא על ידי חימום aliquot של חיץ הכלאה בדיקה ל 37 ° C במשך 30 דקות.</li>
	<li>הסר את החיץ וקדם הכלאה עם 400 μL של חיץ הכלאה בדיקה מחומם מראש למשך 30 דקות ב 37 ° C.</li>
	<li>צור פתרון בדיקה עבור קולטני המטרה הכימו-סנסוריים (IR8a, IR76b, IR25a, IR41t.1, IR75d, IR7t, IR64a או Orco) על ידי הוספת 8 pM של בדיקה. הוסף 8 μL של מלאי בדיקה 1 μM למאגר הכלאה של בדיקה מחומם מראש של 500 μL.</li>
	<li>הסר את חיץ הכלאת הגשושית שחומם מראש והחלף אותו בתמיסת בדיקה מחוממת של 400 מיקרוליטר.</li>
	<li>רקמת הדגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שני לילות על nutator ממוקם בתוך אינקובטור מכוסה תחת קופסה.</li>
</ol>6. הגברה של בדיקה
<ol><li>חממו את מאגר שטיפת הבדיקה ל -37 מעלות צלזיוס. הסר תמיסת בדיקה עודפת על ידי שטיפת הרקמה 5x, 10 דקות לכל כביסה, עם 400 μL של חיץ שטיפת בדיקה ב 37 מעלות צלזיוס, אגוז באינקובטור. הערה: ההכנה לשלב 6.4 עשויה להתחיל. ראה את ההערה בשלב 6.4.</li>
	<li>יש לשטוף דוגמיות 2x, 5 דקות בכל כביסה, עם 400 μL של 5x מלוחים-נתרן ציטראט המכילים 10% Tween-20 (SSCT) בטמפרטורת החדר. הפשירו את חיץ ההגברה לטמפרטורת החדר על גבי ספסל.</li>
	<li>מכינים את הרקמה להגברה על ידי דגירה עם 400 מיקרוליטר של חיץ הגברה למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. בשל צמיגות חיץ ההגברה, רקמות לא יכול להיות שקוע לחלוטין. מערבבים על ידי פיטום עדין של חיץ ההגברה מתחת לרקמה והוצאת החיץ על גבי הרקמה עד שהם שקועים.</li>
	<li>הכינו בנפרד 18 pM של סיכת ראש h1 ו-18pM של סיכת ראש h2 על ידי חימום 6 μL של 3 μM ב-95°C למשך 90 שניות וצננו לטמפרטורת החדר במגירה חשוכה למשך 30 דקות. ודא שצינורות ה-PCR מכוסים היטב כדי למנוע אידוי של סיכות השיער בזמן חימום במחזור תרמי. הערה: כדי לחסוך זמן, ניתן להתחיל את שלב 6.4 בשלבהכביסה הרביעי בשלב 6.1. יש לחמם את סיכות השיער בנפרד כדי למנוע תגובה צולבת. אין לדלל סיכות שיער עם כל חיץ בשלב זה. את סיכות הראש ניתן לרכוש מיצרן הגשושית יחד עם הגשושיות.</li>
	<li>החלף את מאגר ההגברה שנוסף בשלב 6.3 בתערובת המכילה את סיכות השיער המחוממות (משלב 6.4) יחד עם 100 μL של חיץ הגברה. תגובה טיפוסית תכיל 6 μL של h1, 6 μL של h2, ו-100 μL של חיץ הגברה. הערה: ניתן לשלב את סיכות השיער h1 ו-h2 לאחר קירור לטמפרטורת החדר ולאחר מכן להוסיף אותן ל-100 μL של חיץ הגברה. כדי להימנע מהעברת דגימות הרקמה מצינור אחד למשנהו, ניתן להסיר את חיץ ההגברה בשלב 6.3 ולהחליפו בתערובת סיכות השיער המדוללות במאגר הגברה.</li>
	<li>יש לדגור על רקמה למשך הלילה ולאגוז בחושך בטמפרטורת החדר באמצעות מהירות ברירת המחדל של המזין.</li>
</ol>7. דגימת רקמה הרכבה
<ol><li>חיץ הגברה מדולל ברקמה המודגרת עם 300 μL של 5x SSCT (נתרן כלורי-נתרן ציטראט מדולל ב- Tween-20). הערה: הדילול עוזר להפחית את הצמיגות ומקל על הסרת חיץ ההגברה מהרקמה. השתמשנו ב-Triton-X 100 עבור השלב שלפני הקיבוע וב-Tween-20 עבור השלב שלאחר הקיבוע בגלל ההבדלים בפעולות שלהם כסוכנים לחדירת קרום התא.</li>
	<li>יש לשטוף רקמות 5x עם 400 μL של 5x SSCT בטמפרטורת החדר. הערה: יש לאחסן את הרקמה באופן זמני בטמפרטורה של 4°C עד להרכבה מוכנה להרכבה, במידת הצורך. לא חרגנו מיומיים לפני ההדמיה.</li>
	<li>הכינו 5 טיפות של תמיסת הרכבה על מגלשת זכוכית. חתכו את קצה קצה פיפטה בנפח 200 מיקרוליטר כדי להרחיב אותו והעבירו את הרקמה למגלשת זכוכית חדשה.</li>
	<li>תפוס את דגימות הרקמה בבסיסן במלקחיים וטבול ושטוף בעדינות בסדרה של טיפות תמיסת הרכבה. היזהר לא לשבור את הרקמות בשלב זה.</li>
	<li>הרכבה עם תמיסת הרכבה, יש להניח את הכיסוי ולאטום עם לק. תמונה באתרו דגימות רקמה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי.</li>
</ol>

מיפוי ביטוי גנים כימו-סנסורי בנספחי ריח יתושים

<ol><li>Konopka, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfaction+in+Anopheles+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Senses%22%5BJournal%5D)">Olfaction in Anopheles mosquitoes.</a> Chem Senses. 46, (2021).</li>
<li>Raji, J. I., Potter, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemosensory+ionotropic+receptors+in+human+host-seeking+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Insect+Sci%22%5BJournal%5D)">Chemosensory ionotropic receptors in human host-seeking mosquitoes.</a> Curr Opin Insect Sci. 54, 100967(2022).</li>
<li>Young, A. P., Jackson, D. J., Wyeth, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+technical+review+and+guide+to+RNA+fluorescence+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22PeerJ%22%5BJournal%5D)">A technical review and guide to RNA fluorescence in situ hybridization.</a> PeerJ. 8, e8806(2020).</li>
<li>Herre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-canonical+odor+coding+in+the+mosquito%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Non-canonical odor coding in the mosquito.</a> Cell. 185 (17), 3104-3123.e28 (2022).</li>
<li>Raji, J. I., Konopka, J. K., Potter, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+spatial+map+of+antennal-expressed+ionotropic+receptors+in+the+malaria+mosquito%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">A spatial map of antennal-expressed ionotropic receptors in the malaria mosquito.</a> Cell Rep. 42 (2), 112101(2023).</li>
<li>Choi, H. M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+in+situ+amplification+for+multiplexed+imaging+of+mRNA+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Programmable in situ amplification for multiplexed imaging of mRNA expression.</a> Nat Biotechnol. 28 (11), 1208-1212 (2010).</li>
<li>Choi, H. M. T., Beck, V. A., Pierce, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+in+situ+hybridization+chain+reaction%3A+higher+gain%2C+lower+cost%2C+greater+durability%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Next-generation in situ hybridization chain reaction: higher gain, lower cost, greater durability.</a> ACS Nano. 8 (5), 4284-4294 (2014).</li>
<li>Choi, H. M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Third-generation+in+situ+hybridization+chain+reaction%3A+multiplexed%2C+quantitative%2C+sensitive%2C+versatile%2C+robust%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Third-generation in situ hybridization chain reaction: multiplexed, quantitative, sensitive, versatile, robust.</a> Development. 145 (12), dev165753(2018).</li>
<li>Schwarzkopf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybridization+chain+reaction+enables+a+unified+approach+to+multiplexed%2C+quantitative%2C+high-resolution+immunohistochemistry+and+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Hybridization chain reaction enables a unified approach to multiplexed, quantitative, high-resolution immunohistochemistry and in situ hybridization.</a> Development. 148 (22), dev199847(2021).</li>
<li>Choi, H. M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+a+multiplexed+zoo+of+mRNA+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mapping a multiplexed zoo of mRNA expression.</a> Development. 143 (19), 3632-3637 (2016).</li>
<li>Pitts, R. J., Derryberry, S. L., Zhang, Z., Zwiebel, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variant+ionotropic+receptors+in+the+malaria+vector+mosquito+Anopheles+gambiae+tuned+to+amines+and+carboxylic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Variant ionotropic receptors in the malaria vector mosquito Anopheles gambiae tuned to amines and carboxylic acids.</a> Sci Rep. 7, 40297(2017).</li>
<li>Rinker, D. C., Zhou, X., Pitts, R. J., Rokas, A., Zwiebel, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antennal+transcriptome+profiles+of+anopheline+mosquitoes+reveal+human+host+olfactory+specialization+in+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Antennal transcriptome profiles of anopheline mosquitoes reveal human host olfactory specialization in Anopheles gambiae.</a> BMC Genomics. 14, 749(2013).</li>
<li>Maguire, S. E., Afify, A., Goff, L. A., Potter, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant-receptor-mediated+regulation+of+chemosensory+gene+expression+in+the+malaria+mosquito+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Odorant-receptor-mediated regulation of chemosensory gene expression in the malaria mosquito Anopheles gambiae.</a> Cell Rep. 38 (10), 110494(2022).</li>
<li>Athrey, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemosensory+gene+expression+in+olfactory+organs+of+the+anthropophilic+Anopheles+coluzzii+and+zoophilic+Anopheles+quadriannulatus%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Chemosensory gene expression in olfactory organs of the anthropophilic Anopheles coluzzii and zoophilic Anopheles quadriannulatus.</a> BMC Genomics. 18 (1), 751(2017).</li>
<li>Task, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemoreceptor+co-expression+in+Drosophila+melanogaster+olfactory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Chemoreceptor co-expression in Drosophila melanogaster olfactory neurons.</a> eLife. 11, e72599(2022).</li>
<li>Shah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+RNA+detection+at+depth+by+hybridization+chain+reaction+and+tissue+hydrogel+embedding+and+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Single-molecule RNA detection at depth by hybridization chain reaction and tissue hydrogel embedding and clearing.</a> Development. 143 (15), 2862-2867 (2016).</li>
<li>Trivedi, V., Choi, H. M. T., Fraser, S. E., Pierce, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multidimensional+quantitative+analysis+of+mRNA+expression+within+intact+vertebrate+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Multidimensional quantitative analysis of mRNA expression within intact vertebrate embryos.</a> Development. 145 (1), dev156869(2018).</li>
<li>Herre, M., Greppi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+in+situ+hybridization+and+immunohistochemistry+to+visualize+gene+expression+in+peripheral+chemosensory+tissues+of+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">RNA in situ hybridization and immunohistochemistry to visualize gene expression in peripheral chemosensory tissues of mosquitoes.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2023 (1), 48-54 (2023).</li>
<li>Marx, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+of+the+Year%3A+spatially+resolved+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Method of the Year: spatially resolved transcriptomics.</a> Nat Methods. 18 (1), 9-14 (2021).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

הדור השלישי של תגובת שרשרת הכלאה (HCR) יוצא דופן ברגישותו ובחוסנו כדי לדמיין מספר מטרות RNA8. HCR WM-FISH שימש בהצלחה על עוברים של דרוזופילה, תרנגולות, עכברים ודגי זברה, כמו גם על זחלים של נמטודות ודגי זברה 10,16,17. אנטנות יתושים ומישושים מקסילריים נוטים בדרך כלל לחדירה אוטופלואורסצנטית גבוהה וחדירה חלשה של גשושיות, שהן מאתגרות במיוחד בעת ביצוע שיטות מסורתיות של הרכבה שלמה באתרן. החסרונ...

וקטורים של יתושים כגון אנופלס גמביה מסתמכים על רפרטואר עשיר של גנים כימו-סנסוריים המתבטאים בתוספות הריח ההיקפיות שלהם כדי לשגשג בעולם כימי מורכב ולזהות ריחות רלוונטיים התנהגותית הנובעים מפונדקאים אנושיים, לאתר מקורות צוף ולאתר אתרי אוביפוזיציה1. אנטנת היתוש והמישוש המקסילרי מועשרים בגנים כימו-סנסוריים המניעים זיהוי ריחות בתוספות חוש הריח הללו. שלוש קבוצות עיקריות של תעלות יונים מגודרות ליגנד מניעות זיהוי ריחות בתוספות הריח של יתושים: קולטני הריח (ORs), הפועלים עם קולטן אובלנטי אובלנטי (Orco); קולטנים יונוטרופיים (IRs), אשר אינטראקציה עם קולטן IR אחד או יותר (IR8a, IR25a ו- IR76b); קולטני המשב הכימו-סנסורי (GRs), המתפקדים כקומפלקס של שלושה חלבונים לזיהוי פחמן דו-חמצני (CO2)1,2.
RNA fluorescence in situ hybridization הוא כלי רב עוצמה לזיהוי ביטוי של mRNA אנדוגני3. באופן כללי, שיטה זו משתמשת בבדיקת חומצת גרעין חד-גדילית עם תיוג פלואורופור עם רצף משלים ל-mRNA מטרה. קשירה של גשושית הרנ"א הפלואורסצנטי לרנ"א המטרה מאפשרת זיהוי תאים המביעים תעתיק עניין. ההתקדמות האחרונה מאפשרת כעת זיהוי תמלילים ברקמות יתוש שלמות 4,5. הדור הראשון של טכנולוגיית תגובת שרשרת הכלאה (HCR) השתמש במגבר HCR מבוסס RNA; זה השתפר בשיטת הדור השני שבמקום זאת השתמשה בדנ"א מהונדס עבור מגבר HCR 6,7. שדרוג זה הביא לעלייה של פי 10 בסיגנל, ירידה דרמטית בעלות הייצור ושיפור משמעותי בעמידות של ריאגנטים 6,7.
בפרוטוקול אנו מתארים את השימוש בשיטת הדור השלישי של HCR להכלאה מלאה של RNA באתרו (HCR RNA WM-FISH) המיועדת לאיתור לוקליזציה מרחבית וביטוי של כל גן 8,9. שיטה דו-שלבית זו משתמשת תחילה בבדיקות חומצות גרעין ספציפיות ל-mRNA המעניין, אך מכילות גם רצף זיהוי יוזם; השלב השני משתמש בסיכות ראש עם תיוג פלואורופור שנקשרות לרצף היוזם כדי להגביר את האות הפלואורסצנטי (איור 1). שיטה זו מאפשרת גם ריבוב של שתי בדיקות RNA או יותר והגברת אותות בדיקה כדי להקל על זיהוי וכימות RNA8. הדמיה של שפע התעתיק ודפוסי לוקליזציה של RNA של גנים כימו-סנסוריים המתבטאים בתוספות הריח מציעה את הקו הראשון של תובנה לגבי תפקודי גנים כימו-סנסוריים וקידוד ריח.

<table><tbody><tr><td>מאגר הגברה</td><td>מכשירים מולקולריים</td><td>מכשירים מולקולריים, בע"מ | הכלאה באתרה + אימונופלואורסצנציה</td><td>50 מ"ל</td></tr><tr><td>סידן כלורי (CaCl2) 1M&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'&nbsp;</td><td>21115-100 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>צ'יטינאז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>C6137-50UN</td><td></td></tr><tr><td>כימוטריפסין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>CHY5S-10VL&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד (DMSO)</td><td>צינור סיגמא-אולדריץ'</td><td>472301</td><td></td></tr><tr><td>אפנדורף</td><td>VWR</td><td>20901-551</td><td>1.5 מ"ל</td></tr><tr><td>מלקחיים</td><td>Dumont</td><td>11251</td><td>מספר 5</td></tr><tr><td>קצה טעינת ג'ל</td><td>Costar</td><td>4853</td><td>1-200 ומיקרו; L</td></tr><tr><td>tip סיכות ראש&nbsp;</td><td>מכשירים מולקולריים</td><td>מכשירים מולקולריים, בע"מ | הכלאה באתרה + אימונופלואורסצנציה</td><td>h1 ו-h2 יוזם פיצולים</td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>IR25a בדיקה</td><td>מכשירים מולקולריים</td><td>מזהה סט: PRK149&nbsp;</td><td>AGAP010272</td></tr><tr><td>בדיקה IR41t.1</td><td>מכשירים מולקולריים</td><td>&nbsp; מזהה סט בדיקה: PRK978</td><td>AGAP004432</td></tr><tr><td>IR64a בדיקה</td> מכשירים <td>מולקולריים</td><td>מזהה סט בדיקה: PRK700&nbsp;</td><td>AGAP004923</td></tr><tr><td>בדיקה IR75d</td> בדיקה מכשירים <td>מולקולריים</td><td>מזהה סט: PRK976</td><td>AGAP004969</td></tr><tr><td>IR76b בדיקה</td> מכשירים <td>מולקולריים</td><td>מזהה סט בדיקה: PRI998</td><td>AGAP011968</td></tr><tr><td>IR7t בדיקה</td> מכשירים <td>מולקולריים</td><td>מזהה סט: PRL355</td><td>AGAP002763</td></tr><tr><td>IR8a בדיקה</td> מכשירים <td>מולקולריים</td><td>מזהה בדיקה: PRK150</td><td>AGAP010411</td></tr><tr><td>צינורות LoBind</td><td>VWR</td><td>80077-236</td><td>0.5 מ"ל DNA/RNA צינורות LoBind</td></tr><tr><td>מגנסיום כלוריד (MgCl2) 1M</td><td>תרמו פישר</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>מתנול</td><td>פישר&nbsp;</td><td>A412-500</td><td></td></tr><tr><td>מים ללא נוקלאז</td><td>תרמו פישר</td><td>43-879-36</td><td></td></tr><tr><td>Nutator</td><td>דנוויל סיינטיפיק</td><td>דגם 135</td><td>תלת מימד מיני נדנדה</td></tr><tr><td>Orco בדיקה מכשירים</td><td>מולקולריים</td><td>סט בדיקה מזהה PRD954</td><td>AGAP002560</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (20%)</td> <td>שירותי מיקרוסקופיה אלקטרונית&nbsp;</td><td>15713-S</td><td></td></tr><tr><td>פוספט חוצץ מלח (10X PBS)</td> <td>Thermo Fisher</td><td>AM9625</td><td></td></tr><tr><td>מאגר הכלאה בדיקה</td><td>מכשירים מולקולריים https://www.molecularinstruments.com/</td><td></td> <td>50 מ"ל</td></tr><tr><td>מאגר שטיפת בדיקה</td><td>מכשירים מולקולריים</td><td>מכשירים מולקולריים, בע"מ | הכלאה באתרה + אימונופלואורסצנציה</td><td>100 מ"ל</td></tr><tr><td>פרוטאינאז-K</td><td>תרמו פישר</td><td>AM2548</td><td></td></tr><tr><td>מי מלח-נתרן ציטראט (SSC) 20x&nbsp;</td><td>תרמו פישר</td><td>15-557-044</td><td></td></tr><tr><td>SlowFade יהלום</td><td>תרמו פישר&nbsp;</td><td>פתרון הרכבה</td> <td>S36972</td></tr><tr><td>נתרן כלורי (NaCl) 5M</td><td>Invitrogen</td><td>AM9760G</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp; (10%)</td><td>סיגמא-אולדריץ'&nbsp;</td><td>93443</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20 (10%)</td> <td>Teknova</td><td>T0027</td><td></td></tr><tr><td>זכוכית שעון</td><td>קרולינה</td><td>742300</td><td>&nbsp; 1 5/8 אינץ' מרובע; שקוף</td></tr></tbody></table>

תגובת שרשרת הכלאה rna פלואורסצנטיות מלאה באתרה הכלאה של גנים כימו-סנסוריים בתוספות ריח יתושים

Hybridization Chain Reaction RNA Whole-Mount Fluorescence In situ Hybridization of Chemosensory Genes in Mosquito Olfactory Appendages

יתושים הם וקטורים יעילים של מחלות קטלניות ויכולים לנווט בסביבתם הכימית באמצעות קולטנים כימו-סנסוריים המתבטאים בתוספות הריח שלהם. הבנת האופן שבו קולטנים כימו-סנסוריים מאורגנים מרחבית בתוספות הריח ההיקפיות יכולה להציע תובנות לגבי האופן שבו ריח מקודד במערכת חוש הריח של יתושים ולספק דרכים חדשות להילחם בהתפשטות מחלות המועברות על ידי יתושים. הופעתה של תגובת שרשרת הכלאה מהדור השלישי RNA פלואורסצנטי באתרו (HCR RNA, WM-FISH) מאפשרת מיפוי מרחבי ופרופיל ביטוי סימולטני של גנים כימו-סנסוריים מרובים. כאן, אנו מתארים גישה מדורגת לביצוע HCR RNA WM-FISH על אנטנת יתוש אנופלס ומישוש מקסילרי. חקרנו את הרגישות של טכניקה זו על ידי בחינת פרופיל הביטוי של קולטני ריח יונוטרופיים. שאלנו אם טכניקת HCR WM-FISH שתוארה מתאימה למחקרים מרובים על ידי קשירת גשושיות RNA לשלושה פלואורופורים מובחנים ספקטרלית. התוצאות סיפקו ראיות לכך ש- HCR RNA WM-FISH רגיש מאוד לזיהוי בו זמנית של גנים כימו-סנסוריים מרובים באנטנה ובתוספות הריח של מישוש הריח המקסילרי. חקירות נוספות מעידות על התאמתו של HCR WM-FISH לפרופיל ביטוי משותף של מטרות RNA כפולות ומשולשות. טכניקה זו, כאשר מיושמת עם שינויים, יכולה להיות ניתנת להתאמה כדי למקם גנים בעלי עניין ברקמות הריח של מיני חרקים אחרים או בנספחים אחרים.

זיהוי חזק של גנים כימו-סנסוריים באנטנת אנופלס חקרנו את הרגישות של שיטת HCR FISH (איור 1) כדי לזהות את הביטוי של קולטנים כימו-חושיים ברקמות ריח של יתושים. בהנחיית נתוני תעתיק RNA שדווחו מוקדם יותר על אנטנת יתוש אנופלס הנקבית, יצרנו גשושיות כדי להתמקד במגוון של IRs. ערכי התעתיק הממוצעים מארבעה מחקרי תעתיק אנטנה עצמאיים גילו כי Ir41t.1 (11 RPKM), Ir75d (12 RPKM) ו- Ir7t (13 RPKM) היו פחות נפוצים באנטנה בהשוואה לקולטני המשנה Ir25a (197 RPKM) ו- Ir76b (193 RP...

המאמר מתאר את השיטות והריאגנטים הדרושים לביצוע הכלאה של תגובת שרשרת RNA, הכלאה פלואורסצנטית באתרה (HCR RNA, WM-FISH) כדי לחשוף תובנות לגבי הרזולוציה המרחבית והתאית של גנים קולטנים כימו-סנסוריים באנטנת היתושים ובמישוש המקסילרי.

תגובת שרשרת הכלאה RNA פלואורסצנטיות מלאה באתרה הכלאה של גנים כימו-סנסוריים בתוספות ריח יתושים

Mosquitoes are effective vectors of deadly diseases and can navigate their chemical environment using chemosensory receptors expressed in their olfactory ...

הקבוצה שלנו מתעניינת במערכת הכימו-חושית של יתושים. אנו מקווים שעל ידי התמקדות בחוש הטעם והריח של יתוש, נוכל למנוע ממנו למצוא אותנו ולנשוך אותנו. תגובת שרשרת הכלאה היברידית פלואורסצנטית באתרה היא התפתחות עדכנית.טכנולוגיה זו רגישה מאוד, חזקה ומסוגלת להכפיל מספר מטרות גנים כך שנוכל לדמיין את הביטוי והלוקליזציה של גנים אלה בו זמנית בתוך סביבתם הטבעית. תעתיק מיוחד היא שיטה חדשנית המשמשת בתחום הביולוגיה המרחבית. טכנולוגיה זו מסוגלת להכפיל כמה אלפי גנים, ואתה יכול לדמיין את הביטוי של גנים אלה בו זמנית.הפרוטוקול שלנו מאפשר לנו לדמיין ישירות אילו תאי עצב באנטנה מבטאים כל אחד מ-50 הקולטנים היונוטרופיים האפשריים. זה מספק לנו מפת דרכים בסיסית שתנחה את הבנתנו כיצד קולטני גורמים קלאסיים אלה עשויים לתווך התנהגויות. נוירוני ריח בתוך איברי ריח של חרק כמו האנטנה, קבורים בדרך כלל בתוך קליפה מגוננת.זה הופך את הדמיה של ביטוי קולטני ריח בתאי עצב אלה למאתגרת מאוד. הפרוטוקול שלנו משתמש בשילוב של טיפולי כיטינאז ופרוטוקולים פלואורסצנטיים ושקופים חדישים כדי להתגבר על אתגרים אלה.

hybridization-chain-reaction-rna-whole-mount-fluorescence-situ

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

זמן ומרחב ביטוי ניתוח גנטי תפקיד מכריע גנומיקה תפקודית. כל...

הכלאה<em&gt; באתרו</em&gt; של בלוטות הרוק, השחלות, ועוברים של וקטור יתושים

בין השלושה סוגי היתושים,...

פלואורני<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה על כרומוזומים mitotic של יתושים

כאן אנו מתארים שלם הר...

הר כולו RNA פלורסנט<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים

באמצעות שתי שיטות להערכת ביטוי גנים בנספחים התעוררו אצל הגדולים של Aedes aegypti, זיהינו הקבוצה של גני putatively בסיס התגובות עצביות לתרכובות מרות ודוחות, כפי שנקבע על ידי בדיקת אלקטרו.

הקלטות פיסיולוגיות וRNA רצף של האיברים התעוררו אצל של יתוש הקדחת הצהובה Aedes aegypti

מאמר זה מתאר פרוטוקול RNA מפורט ויעיל בפרוטוקול הכלאה באתרו, במיוחד עבור גנים של קולטנים (OR), המופיעים ברמה נמוכה, וכן בגנים אחרים, באנטנות חרקים באמצעות בדיקות דיגוקיגנין (DIG) או תוויות ביוטין.

לוקליזציה של גנים קולטן Odorant ב אנטנות ארבה על ידי RNA<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה

בהתחשב באנטומיה הפשוטה שלהם, אשכי אנופלס מציעים מודל ציטולוגי טוב לחקר זרע. פרוטוקול זה מתאר הכלאה פלואורסצנטית באתרה , טכניקה המשמשת לחקר תהליך ביולוגי זה, כמו גם את הפנוטיפ של זנים טרנסגניים בעלי מוטציות בגנים המעורבים בייצור זרע.

הכלאה פלואורסצנטית באתרה לחקר ספרמטוגנזה ביתוש האנופלס

פעמיים פלואורסצנטי באתרו הכלאה בסעיפים המוח טריים

שילוב של טכניקות שונות על מנת למקסם את איסוף הנתונים מרקמות העכבר מוצג.

שילוב של צבע lipophilic, באתרו</emהכלאה>, אימונוהיסטוכימיה ו היסטולוגיה

כאן אנו מתארים את התהליך של צביעה חיסונית שלמה של אנטנות דרוזופילה, המאפשר לנו להבין טוב יותר את המנגנונים המולקולריים המעורבים בגיוון נוירונים של קולטני ריח (ORN).

הר immunolabeling השלם של חוש הריח קולטן נוירונים<em&gt; דרוזופילה</em&gt; אנטנה

Lampreys לשחזר תנועה לאחר פגיעה בחוט השדרה מלאה. עם זאת, חלק מתאי העצב מקרין שדרה הם regenerators טוב ואחרים לא. מאמר זה ממחיש את הטכניקות לזחלי צמד ים ים דיור (ומבוגרים הפכו לאחרונה), הפקת transections חוט השדרה מלאה והכנת מוח wholemount וחוט שדרה לכלאה באתר.

חוט השדרה מלא פגיעה ומוח Dissection פרוטוקול Wholemount לאחר<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה בזחל ים צמד ים

חקור את שיטת HCR RNA WM-FISH לחקר ביטוי גנים של קולטנים כימו-חושיים באנטנות יתושי Anopheles. השיטה מאפשרת הדמיה מרובת-ממדית של קולטנים איונוטרופיים ומיפוי מרחבי של תבניות ביטוי גנים.

תגובת שרשרת הכלאה RNA פלואורסצנטיות מלאה באתרה הכלאה של גנים כימו-סנסוריים בתוספות ריח יתושים

גלה סרטונים נוספים