חתך ויברטומי אוטומטי של רקמת ריאה משובצת אגרוז להדמיית פלואורסצנטיות מרובת משתתפים
6 באוקטובר 2023
פיתחנו טכניקת עיבוד רקמות המשתמשת ברקמת ריאה משובצת ויברטומה ואגרוז ליצירת קטעי ריאה, ובכך אפשרנו רכישה של תמונות ברזולוציה גבוהה של ארכיטקטורת ריאות. השתמשנו בצביעת אימונופלואורסנציה כדי לצפות בביטוי חלבונים מרחבי באמצעות סמנים מבניים ספציפיים של הריאה.
פרוטוקול זה שימושי במיוחד במודלים של בעלי חיים גדולים של השתלת ריאות והתחדשותם, כגון חזירים, שבהם אנו יכולים לדגום חתיכות קטנות לאורך זמן. טכניקה זו יכולה לעזור לנו להבין טוב יותר את הביולוגיה המרחבית הפועלת במודלים האלה. טכניקה זו מייצרת פרוסות ריאה בעיבוד מינימלי המתאימות להדמיית אימונופלואורסנציה ללא צורך בשליפת אנטיגן, והייתה יעילה בכל הנוגדנים שנבדקו עד כה.
הליך זה יכול להיות מותאם לחתוך חלקים עבים מעט יותר, נניח סביב מילימטר אחד, אשר ניתן להשתמש בהם במיקרוסקופ פלואורסצנטי של יריעות אור כדי לחקור את ביטוי החלבון המרחבי בנפח תלת ממדי יותר. המחקר שלנו חוקר גורמים המשפיעים על דחיית השתלת ריאות, ומפתח טיפולים להפחתת דחייה באמצעות מודל החזיר שלנו. טכניקה זו מסייעת להבין שינויים חלבוניים מרחביים המשפיעים על תוצאות ההשתלה לאחר הניתוח.
אנו משתמשים כעת בטכניקה זו כדי לחקור את נוף ביטוי החלבונים המרחבי במודל השתלת ריאות החזיר שלנו. אנו מקווים שזה יעזור לנו להבין טוב יותר את המנגנונים שמאחורי הטיפולים הניסיוניים שלנו. המפתח להצלחה כאן טמון בתצפיות ויברטום, אמפליטודות להב גבוהות ומהירויות כוח נמוכות יותר הם דברים מרכזיים שיש להסתכל עליהם אם החתך משתבש.
סקירה כללית
מחקר זה מציג טכניקה חדשנית לעיבוד רקמות המשתמשת בויברטום וברקמת ריאה הטמיעה באגרוז כדי להפיק חתכי ריאה ברזולוציה גבוהה. השיטה מאפשרת צביעה אימונופלואורסצנטית לצורך תצפית על ביטוי חלבונים מרחבי בארכיטקטורת הריאה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה
- השתלת ריאות
רקע
- הבנת הביולוגיה המרחבית במודלים של ריאה היא חיונית למחקר על השתלות ריאה.
- הטכניקה מייצרת פרוסות ריאה במעבדת מינימלית המתאימות לדימות.
- היא נמצאה יעילה עם נוגדנים שונים ללא צורך בשחזור אנטיגן.
- ניתנת להתאמה עבור חתכים עבים יותר לטכניקות דימות מתקדמות.
מטרת המחקר
- לבחון גורמים המשפיעים על דחיית השתקת ריאה.
- לפתח טיפולים שמטרתם להפחית דחייה בהשתקת ריאות.
- לחקור ביטוי חלבונים מרחבי במודל של השתקת ריאה בחזיר.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- טמיעת רקמת ריאה באגרוז לצורך חיתוך.
- שימוש בויברטום ליצירת פרוסות ריאה בעובי מוגדר.
- צביעה אימונופלואורסצנטית להדמיית ביטוי חלבונים.
- ניתוח השוואתי של התפלגות פנומוציטים מסוג 2 בדגימות אנושיות.
תוצאות עיקריות
- הפקה מוצלחת של חתכי ריאה ברזולוציה גבוהה.
- זיהוי שינויים מרחביים בחלבונים המשפיעים על תוצאות השתלה.
- ספירה גבוהה יותר של פנומוציטים מסוג 2 וכיסוי רחב יותר של הפיגום בדגימות של תינוקות בהשוואה למבוגרים.
- שימוש יעיל בטכניקה במגוון דגימות של רקמת ריאה.
מסקנות
- טכניקת הוויברטום (vibratome) משפרת את ההבנה של מבנה הריאה.
- היא מספקת תובנות לגבי ביטוי חלבוני מרחבי הרלוונטי לביולוגיה של השתלות.
- שיטה זו עשויה לסייע למחקרים עתידיים בהשתלות ריאה ובגנרציה של ריאות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
חיתוך אוטומטי של רקמת ריאה הטמיעה באגרוז באמצעות ויברטום מאפשר קבלת פרוסות ריאה בעלות עיבוד מינימלי וניתנות לשחזור, לצורך דימוי פלואורסצנציה מרובה (multiplex) במינים שונים. סבב עבודה זה נותן מענה לאתגר של שימור המבנה המקורי של הריאה והאנטיגניות שלה, ותומך בניתוח מרחבי של חלבונים בעל תוכן גבוה, החיוני למחקר ריאות תרגומי. גישה זו משפרת את הביטחון החזוי במודלים פרה-קליניים של ריאות ומספקת מידע למחקרים מכניסטיים על פגיעה, התחדשות ותוצאות השתלה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה של ביטוי חלבוני מרחבי ברקאת ריאה טבעית לצורך הפחתת סיכונים מכניסטיים.
- תומך בתיקוף תפקודי של מטרות על ידי שימור האנטיגניות ללא צורך בשחזור אנטיגן.
- מקל על ביצוע מחקרים השוואתיים בדגימות מעכבר, חזיר ובני אדם להעלאת רמת הוודאות לגבי המטרה בין מינים שונים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק פרוסות ריאה סטנדרטיות וניתנות לשחזור, המתאימות לבדיקות אימונופלואורסצנציה מרובות-סמנים (multiplex).
- מספק תוצאות מרחביות כמותיות עבור מיקום ושפע של חלבונים.
- מאפשר התרחבות של הבדיקה (scalability) ושימוש חוזר בפלטפורמה לצורך תיקוף וסריקה של נוגדנים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתיישב עם מודלים רלוונטיים למחלה, כולל השתלת ריאה ופגיעה בריאה בבעלי חיים גדולים.
- תומך בגילוי ביומרקרים תרגומיים על ידי מתן אפשרות למיפוי מרחבי ברזולוציה גבוהה של שינויים בחלבונים.
- מסייע בקידום טיפולים ניסיוניים המותאמים לסיכון, באמצעות הבנה מכניסטית של עיצוב מחדש של רקמות ודחייה.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
שיטה זו משלבת שלבים החל מהגילוי המוקדם ועד לאישור הפרה-קליני, ותומכת בתהליכי עבודה במחקרים על פגיעה בריאות, התחדשות והשתלה.
- ביולוגיה של גילוי: מקדמת את בדיקת ההשערות בנוגע לדינמיקה מרחבית של חלבונים במבנה ריאה שלם.
- סריקה: מספקת פלטי דימוי כמותיים הניתנים לשחזור לצורך הערכת נוגדנים וסמנים ביולוגיים.
- אנליטיקה: מאפשרת השוואה סטטיסטית של התפלגות חלבונים ושכיחות סוגי תאים בין תנאים ושלבי התפתחות שונים.
- מחקר תרגומי: מגשרת בין ממצאים פרה-קליניים במודלים של בעלי חיים לבין ניתוח רקמות אנושיות לצורך התאמת סמנים ביולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה הניתנת לשימוש חוזר לעיבוד רקמות ודימוי, הניתנת להתאמה למספר תוכניות מחקר של הריאה.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקרי רקמות ריאה.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של עיבוד רקמות והדמיה לצורך הדירות ויכולת הרחבה בין פרויקטים.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) על ידי אפשור ניתוח חלבוני מרחבי רב-עוצמה במודלים תרגומיים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם סיכונים של תרפיהות המכוונות לריאות ותוכניות של סמנים ביולוגיים.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בהפעלת ויברטום (vibratome) ובדימות אימונופלורסצנטית.
- נדרשת גישה למכשור ויברטום ולמיקרוסקופיה פלורסצנטית מולטיפלקס (multiplex).
- נדרש סטנדרזציה בין-צוותית של פרוטוקולי החיתוך והצביעה לצורך הדירות (reproducibility).
- ניתן להסבה למגוון מודלים של ריאה, אך עשוי להידרש אופטימיזציה עבור עובי הרקמה ותאימות הנוגדנים.
- יש לבקר בקפידה את פרמטרי החיתוך ואת הטיפול ברקמה כדי לשמר את המבנה הטבעי ואת האנטיגניות.
