Name: העשרה מהירה ויעילה של תאי מיקרוגליה בחוט השדרה של עכבר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 15 s
Description: למד שיטה יעילה להפרדת תאי מיקרוגליה מחוט השדרה של עכברים. הפרוטוקול משתמש בעיכול סומטי ובהפרדה צפיפותית להשגת טוהר של עד 99% ללא זיהום אסטרוציטים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמלגה שהוענקה על ידי המועצה הלאומית למדע וטכנולוגיה (CONACYT) (702361). המחברים מודים לתוכנית הדוקטורט במדעי הכימיה הביולוגית של בית הספר הלאומי למדעים ביולוגיים של המכון הפוליטכני הלאומי.

המחקר נערך בהתאם לתקן המקסיקני הרשמי NOM-062-ZOO-1999 והמדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. האישור למחקר התקבל מוועדות המחקר, האתיקה והבטיחות הביולוגית של בית החולים לילדים במקסיקו (HIM/2023/006) ומועדת המחקר והביואתיקה של בית החולים הכללי של מקסיקו אדוארדו ליסאגה (DI/21/501/04/62). שלושה עכברי C57BL/6 בגילאי 6 עד 8 שבועות התקבלו מבית החולים לילדים במקסיקו, שם גודלו בתנאים מבודדים במדפים מונשמים, בהתאם להנחיות המוסדיות לטיפול ושימוש בבעלי חיים.
1. הכנת חומרים וריאגנטים
<ol><li>PBS ללא Ca2 + ו-Mg2+ טרום חם, כמו גם תמיסת מלח מאוזנת של האנק (HBSS) ל-37°C.</li>
	<li>השלימו את תמיסת HBSS עם 100 מיקרוגרם/מ"ל של Liberase ו-4 מיקרוגרם/מ"ל של DNase (HBSS-LD). ודא כי הפתרון שומר על pH פיזיולוגי של 7.4. הערה: 1 מ"ל של פתרון עבודה לכל חוט השדרה יהיה צורך.</li>
	<li>הכינו תמיסה איזוטונית של 90% לצנטריפוגה הדרגתית בצפיפות (זמינה מסחרית, ראו טבלת חומרים) וחממו אותה מראש ל-37°C.</li>
	<li>הכינו את חיץ הצביעה על ידי שילוב של סרום בקר עוברי 5% מומת חום (FBS) עם PBS, ואחסנו את התערובת על קרח.</li>
	<li>חימום מראש של גלוקוז בינוני-גבוה של Dulbecco של Dulbecco (1g / L) (DMEM) עד 37 ° C.</li>
	<li>השלם את מדיום DMEM עם 10% FBS, 2 mM L-גלוטמין, 200 U / מ"ל פניצילין, 200 מיקרוגרם / מ"ל של סטרפטומיצין, ו 500 pg / מ"ל של אמפוטריצין B (ראה טבלה של חומרים) להכנת DMEM-S.</li>
</ol>2. דיסקציה והכנה של חוט השדרה
<ol><li>המתת חסד העכבר עם מנת יתר intraperitoneal של pentobarbital במינון של 150 מ"ג / ק"ג. לעקר את בית החזה והגב של העכבר באמצעות 70% אתנול. הערה: ודא שהמתת החסד בוצעה בהצלחה לפני שתמשיך בנתיחת העכבר.</li>
	<li>יש לגלח את אזור בית החזה ולהצמיד את הגפיים ללוח הדיסקציה באמצעות סרט הדבקה.</li>
	<li>באמצעות אזמל, בצעו חתך זהיר לאורך קו האמצע הגבי מהעורפית לאזור העצה (איור 2).</li>
	<li>בעזרת מיקרוסקופ כירורגי סטריאוסקופי יש לנתח בשכבות עד להגעה לעמוד השדרה המותני וזיהוי הקשת הקוסטלית האחרונה. הערה: 13 הקשתות הקוסטליות מבוטאות בחוליות בית החזה; כאשר הם מנותחים, הם נראים עליונים על חוליה L12.</li>
	<li>קבעו את החוליה הצווארית האחרונה ואת עצם העצה, ואז בצעו חתך כדי להפריד את עמוד השדרה (איור 2).</li>
	<li>באמצעות שימוש במלקחיים מנתחים, בצעו כריתת למינקטומיה גבית של החוליות כדי לחלץ את חוט השדרה (איור 3A-D). הערה: למעט שתי החוליות הצוואריות הראשונות (אטלס וציר), כל החוליות הנעות חולקות עיצוב מורפולוגי משותף באזורים שונים (צוואר הרחם, בית החזה או מותני). כל חוליה ניידת טיפוסית כוללת גוף חוליה גלילי בקצה הקדמי שלה. לחלק האחורי של הגוף מחוברת קשת גרמית המכונה קשת חולייתית (קשת עצבית), המורכבת מתהליכים למינה ועמוד השדרה. בין מבנים אלה נמצא פתח החוליות15.</li>
	<li>הסירו את העצבים היוצאים דרך הפורמינה (שורשים גביים וגחונים) שמרכיבים את מערכת העצבים ההיקפית ועשויים להכיל מקרופאגים שחדרו (איור 3D). הערה: אין צורך להסיר את pia mater או את קרומי המוח מכיוון שתווך שיפוע הצפיפות מבטל ביעילות אסטרוציטים מזהמים. בנוסף, שמירה על קרומי המוח מפחיתה את זמן הטיהור ומשפרת את הכדאיות.</li>
</ol>3. עיכול רקמות ובידוד של מיקרוגליה
<ol><li>הניחו את חוט השדרה על לוח הניתוח, ובעזרת מספריים של Vannas, חתכו את חוט השדרה לחתיכות של 2 מ"מ, והניבו בממוצע 10 חלקים.</li>
	<li>העבירו את חלקי חוט השדרה למיקרו-צינורית שטוחה בנפח 2 מ"ל (איור 3E,F).</li>
	<li>הוסף 1 מ"ל של פתרון העבודה HBSS-LD (שלב 1.2). יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 25 דקות, תוך ערבול נמרץ כל 5 דקות.</li>
	<li>מעבירים את התוכן של כל עיכול דרך מסננת של 40 מיקרומטר, ולאחר מכן מוסיפים 7 מ"ל של HBSS עם 2% FBS כדי לנטרל את העיכול.</li>
	<li>למחוץ את הרקמה הנותרת באמצעות מזרק 1 מ"ל בוכנה. צנטריפוגה את המתלה בצינור חרוטי 50 מ"ל במשך 5 דקות ב 220 x גרם, 4 ° C.</li>
	<li>השליכו את הסופרנאטנט באמצעות מיקרופיפטה של 1 מ"ל, והשהו מחדש את הגלולה ב-2 מ"ל HBSS עם 2% FBS בצינור חרוטי של 15 מ"ל. שלב עם 2 מ"ל של מדיום שיפוע צפיפות איזוטונית 90%. צנטריפוגה למשך 25 דקות ב 160 x גרם, 18 ° C. הערה: השתמש בהאצה איטית והימנע משימוש בבלם.</li>
	<li>השתמש פיפטה העברה כדי לאחזר את הממשק ולהעביר אותו לצינור חרוטי 15 מ"ל. לשטוף את התאים עם 10 מ"ל של PBS וצנטריפוגה במשך 5 דקות ב 220 x גרם, 4 ° C.</li>
	<li>השהה מחדש את התאים ב- DMEM-S (שלב 1.6) ושמור אותם מאוחסנים על קרח.</li>
</ol>4. קביעת טוהר/כדאיות
<ol><li>לכימות תאים בני קיימא באמצעות תא המוציטומטר, השתמש בכתם כחול טריפאן 0.4% (ראה טבלת חומרים). הערה: בממוצע, עכבר יחיד מספק 4-6 מיליון תאים.</li>
	<li>כדי לכמת תאים בני קיימא באמצעות ציטומטר זרימה, השתמש בצביעת צבע פלואורסצנטי תגובתי אמין זמין מסחרית (ראה טבלת חומרים).<ol><li>העבר מיליון תאים לתוך צינור פוליסטירן בעל תחתית עגולה (FACS) של 5 מ"ל. לדלל את הצבע הפלואורסצנטי עם PBS ביחס של 1:1000 (יצירת פתרון עבודה כדאיות).</li>
		<li>לדגור את הדגימות עם פתרון קיימא בחושך ב 4 ° C במשך 30 דקות. שטפו את התאים עם PBS קר כקרח פעמיים. להשהות מחדש את התאים ב 400 μL של חיץ צביעה (שלב 1.4).</li>
		<li>חסום את התאים עם 2.4G2 anti-FcRIII/I (ראה טבלת חומרים) במאגר הצביעה הקר כקרח למשך 15 דקות ב- 4°C.</li>
		<li>ניסוח קוקטייל צביעת הנוגדנים על ידי הוספת נוגדנים חד-שבטיים בעלי תווית פלואורסצנטית CD45-PerCP ו-CD11b-eFluor 450 למאגר הצביעה (בדילול של 1:300) (ראה טבלת חומרים). הערה: כאשר שתי הטכניקות זמינות, בחר את זו המתאימה ביותר לפרוטוקול הבא.</li>
		<li>לדגור את הדגימות עם קוקטייל מכתים נוגדנים בחושך ב 4 ° C במשך 30 דקות. שטפו את התאים עם חיץ כתמים קר כקרח פעמיים. להשהות מחדש את התאים ב 400 μL של חיץ צביעה.</li>
		<li>רכוש 250,000 אירועים על ציטומטר זרימה, כפי שמתואר על ידי אסטרטגיית gating בשלב 6 (איור 4).</li>
	</ol></li>
</ol>5. צביעה אימונופלואורסצנטית
<ol><li>מניחים את הכיסוי המטופל מראש בבאר של צלחת בעלת 6 בארות. הערה: כדי לטפל בכיסויים, הניחו אותם בצלחת פטרי עם תמיסת L-פוליליזין (0.01 מ"ג/מ"ל, ראו טבלת חומרים) ודגרו במשך שעה אחת. לאחר מכן, שטפו אותם שלוש פעמים במים מזוקקים ואפשרו להם להתייבש.</li>
	<li>זרעו 200,000 תאים על הכיסוי המטופל באמצעות 500 μL של תמיסת DMEM-S. דגירה במשך 24 שעות.</li>
	<li>הסירו את הכיסויים וקיבעו את התאים באמצעות 3.7% פרפורמלדהיד (PFA) למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. שטפו את הכיסויים שלוש פעמים עם PBS קר כקרח.</li>
	<li>חדרו לתאים עם 0.2% Triton X-100 ב-PBS למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, לשטוף את coverslips שלוש פעמים עם PBS קר. חסום את התאים עם 0.2% BSA ב- PBS למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>יש לדלל את הנוגדנים החד-שבטיים בעלי התווית הפלואורסצנטית (בדילול של 1:300, ראו טבלת חומרים) בתמיסת החסימה ולדגור במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. שטפו את הכיסויים שלוש פעמים עם PBS קר כקרח.</li>
	<li>החל אמצעי הרכבה המכיל DAPI על השקופית ולאחר מכן אטם אותה באמצעות כיסוי. הערה: ניתן לנתח את השקופיות באופן מיידי באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי או קונפוקלי, או לאחסן אותן עד 3 חודשים בטמפרטורה של -20°C.</li>
</ol>6. אסטרטגיית Gating עבור מיקרוגליה חוט השדרה
<ol><li>צור תרשים נקודה וקבע שער לבידוד תאים בני קיימא בהתבסס על צביעת כדאיות ותעלה פלואורסצנטית ריקה16. אל תכלול תאים שאינם בני קיימא.</li>
	<li>הפק חלקה נוספת תוך שימוש בפרמטרים של פיזור קדימה וצד כדי לסלק פסולת16.</li>
	<li>לפתח תרשים נקודה נוסף ולנתח את הביטוי של CD11b ו- CD45 כדי להבדיל מיקרוגליה.</li>
</ol>

חילוץ וטיהור אנזימטי של מיקרוגליה מחוט השדרה של העכבר

<ol><li>Schröder,, Moser,, Huggenberger, <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchr%C3%B6der%2C+H+%22Neuroanatomy+of+the+Mouse%22">Neuroanatomy of the Mouse</a>. , Springer, Switzerland. 59-78 (2020).</li>
<li>Sengul, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoarchitecture+of+the+spinal+cord+of+the+postnatal+%28P4%29+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">Cytoarchitecture of the spinal cord of the postnatal (P4) mouse.</a> Anat Rec. 295, 837-845 (2012).</li>
<li>Bab, I., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBab%2C+I+%22Microtomographic+atlas+of+the+mouse+skeleton%22">Microtomographic atlas of the mouse skeleton</a>. VIII, First ed, Springer. 205(2007).</li>
<li>Nayak, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Microglia development and function.</a> Annu Rev Immunol. 32, 367-402 (2014).</li>
<li>Martinez, F. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+activation+and+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">Macrophage activation and polarization.</a> Front Biosci. 13, 453-461 (2008).</li>
<li>Masuda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+heterogeneity+in+the+single-cell+era%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Microglia heterogeneity in the single-cell era.</a> Cell Rep. 30 (5), 1271-1281 (2020).</li>
<li>Prinz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+biology%3A+one+century+of+evolving+concepts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Microglia biology: one century of evolving concepts.</a> Cell. 179 (2), 292-311 (2019).</li>
<li>de Haas, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Region-specific+expression+of+immunoregulatory+proteins+on+microglia+in+the+healthy+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Region-specific expression of immunoregulatory proteins on microglia in the healthy CNS.</a> Glia. 56 (8), 888-894 (2008).</li>
<li>Xuan, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+of+microglia+in+the+brain+and+the+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differences of microglia in the brain and the spinal cord.</a> Front Cell Neurosci. 13, 504(2019).</li>
<li>Paolicelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+states+and+nomenclature%3A+A+field+at+its+crossroads%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Microglia states and nomenclature: A field at its crossroads.</a> Neuron. 110 (21), 3458-3483 (2022).</li>
<li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+IL-36%CE%B3%2FIL-36R+participates+in+the+maintenance+of+chronic+inflammatory+pain+through+astroglial+JNK+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Spinal IL-36γ/IL-36R participates in the maintenance of chronic inflammatory pain through astroglial JNK pathway.</a> Glia. 67 (3), 438-451 (2019).</li>
<li>Prinz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+and+central+nervous+system-associated+macrophages-from+origin+to+disease+modulation%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Microglia and central nervous system-associated macrophages-from origin to disease modulation.</a> Annu Rev Immunol. 39, 251-277 (2021).</li>
<li>Yip, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+isolation+and+culture+of+primary+microglia+from+adult+mouse+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid isolation and culture of primary microglia from adult mouse spinal cord.</a> J Neurosci Methods. 183 (2), 223-237 (2009).</li>
<li>Akhmetzyanova, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Severity-+and+time-dependent+activation+of+microglia+in+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mo.+Sci%22%5BJournal%5D)">Severity- and time-dependent activation of microglia in spinal cord injury.</a> Int J Mo. Sci. 24 (9), 1-16 (2023).</li>
<li>Mahadevan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+of+the+vertebral+column%5BTitle%5D)+AND+%22Surgery%22%5BJournal%5D)">Anatomy of the vertebral column.</a> Surgery. 36 (7), 327-332 (2018).</li>
<li>Krukowski, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporary+microglia-depletion+after+cosmic+radiation+modifies+phagocytic+activity+and+prevents+cognitive+deficits%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Temporary microglia-depletion after cosmic radiation modifies phagocytic activity and prevents cognitive deficits.</a> Sci Rep. 8 (1), 1-13 (2018).</li>
<li>Cardona, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+murine+microglial+cells+for+RNA+analysis+or+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry.</a> Nat Protoc. 1, 1947-1951 (2006).</li>
<li>Schmidt, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+enzymatic+efficiency+of+Liberase+TM+and+tumor+dissociation+enzyme%3A+effect+on+the+viability+of+cells+digested+from+fresh+and+cryopreserved+human+ovarian+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Biol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Comparison of the enzymatic efficiency of Liberase TM and tumor dissociation enzyme: effect on the viability of cells digested from fresh and cryopreserved human ovarian cortex.</a> Reprod Biol Endocrinol. 16 (57), 1-14 (2018).</li>
<li>Kusminski, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MitoNEET-parkin+effects+in+pancreatic+%CE%B1-+and+%CE%B2-cells%2C+cellular+survival%2C+and+intrainsular+cross+talk%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">MitoNEET-parkin effects in pancreatic α- and β-cells, cellular survival, and intrainsular cross talk.</a> Diabetes. 65 (6), 1534-1555 (2016).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

פרוטוקולים רבים פותחו לחקר תאי מיקרוגליה בשל חשיבותם בהומאוסטזיס של המוח. בשיטות אלה, תאי מיקרוגליה מקורם בדרך כלל בהמיספרות מוחיות של חולדות ועכברים עובריים או יילודים17. מספר מצומצם של מחקרים התייחסו לטיהור תאי מיקרוגליה מחוט השדרה של עכברים בוגרים13,14. טכניקות אלה כוללות עיכול אנזימטי באמצעות collagenase ו / או פפאין יחד עם DNAse, לעתים קרובות בשילוב עם הפרדה הדרגתית באמצעות Percoll או OptiPrep. עם זאת, שימוש בעיכול חוט השדרה מבוסס פפא...

המאפיין המגדיר של בעלי חוליות הוא עמוד השדרה או עמוד השדרה, שבו הנוטוכורד הוחלף ברצף של עצמות מקוטעות הנקראות חוליות, המחולקות על ידי דיסקים בין-חולייתיים. רצף זה של חומר גלוסקמי מעצב את תעלת עמוד השדרה, חלל התוחם ומגן על חוט השדרה1. בסוג Rodentia, עמוד השדרה נוצר בדרך כלל על ידי שבע חוליות צוואריות, שלוש עשרה חוליות בית החזה, שש חוליות מותניות ומספר משתנה של חוליות קאודליות 2,3. אורך חוט השדרה דומה לזה של עמוד השדרה, והפילום הטרמינלי הוא מבנה לא עצבי המעגן את חוט השדרה לעצה. בנוסף, סיבי עצב יוצאים דרך הפתח הבין חולייתי1.
התפתחותה ותפקודה התקין של מערכת העצבים המרכזית ביונקים תלויים באופן קריטי בפעילות המקרופאגים השוכנים במערכת העצבים, הנקראים מיקרוגליה4. למרות שתאי מיקרוגליה תוארו בתחילה כפגוציטים שוכני מוח, מחקר שנערך לאחרונה ייחס תפקודים דינמיים רבים לתאים אלה 5,6. גודלה של מיקרוגליה נע בין 7 ל -10 מיקרומטר בהומאוסטזיס; הם נחשבים בין התאים הרבגוניים ביותר בגוף ויכולים להסתגל מורפולוגית ותפקודית לסביבתם המשתנה ללא הרף7. תאים אלה מפגינים הטרוגניות גבוהה הן בשלב העוברי והן בשלב הבוגר 8,9, ואילו בשלב הבוגר הם מפגינים גם הטרוגניות תפקודית מורכבת בהתבסס על ההקשר המרחבי-זמני שלהם10. ההטרוגניות והתפקודים המרובים של תאי מיקרוגליה מאפשרים ביטוי גנים דיפרנציאליים והתנהגות בחוט השדרה ובמוח. הוכח כי ביטוי CD11b, CD45, CD86 ו- CCR9 גבוה יותר בחוט השדרה בהשוואה למוח 8,9.
קיימים פרוטוקולים מרובים לבידוד תאי מיקרוגליה במוח11,12; עם זאת, רק מעטים קיימים עבור מיקרוגליה חוט השדרה13,14. אופטימיזציה של שיטה לטיהור מיקרוגליה מחוט השדרה מאפשרת פיתוח של מחקרים מרובים המתמקדים בגילוי הפיזיולוגיה של מיקרוגליה. פרוטוקול זה נועד לתאר מיצוי פשוט וקל מאוד לשחזור של חוט השדרה של העכבר וטיהור תאי מיקרוגליה (איור 1).

<table><tbody><tr><td>צינורות איסוף 15 מ"ל</td><td>קורנינג, ארה"ב</td><td>430790</td><td></td></tr><tr><td>2 מ"ל מיקרו-צינורות</td><td>Axygen, ארה"ב</td><td>MCT-200-G</td><td></td></tr><tr><td>2.4G2 anti-FcR</td><td>BioLegend, ארה"ב</td><td>101302</td><td></td></tr><tr><td>צינורות איסוף 50 מ"ל</td><td>קורנינג, ארה"ב</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>70% אתנול</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אנטיביוטיקה-אנטימיקוטית (פניצילין, סטרפטומיצין, אמפוטריצין b)</td><td>Gibco, ארה"ב</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן CD11b eFluor 450 נגד עכברים</td><td>eBioscience, ארה"ב</td><td>48-0112</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן CD45 PerCP נגד עכבר&nbsp; &nbsp;</td><td>BioLegend, ארה"ב</td><td>103130</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מלח מאוזנת (PBS) סידן- קורנינג ללא מגנזיום</td><td>, ארה"ב</td><td>46-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>מסננת תאים כחולים 40 &mu; מ</td><td>קורנינג, ארה"ב</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Costar 6 בארות ברורות לא מטופלות&nbsp;</td><td>קורנינג, ארה"ב</td><td>CLS3736</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>חימום דיגיטלי רועד Drybath&nbsp;</td><td>Thermo Scientific Digital HS Drybath, ארה"ב</td><td>88870001</td><td></td></tr><tr><td>ניתוח מלקחיים למיקרו-כירורגיה</td><td>FT מאת DUMONT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Roche, ארה"ב</td><td>4536282001</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&acute; s נשר שונה וחריף; s גלוקוז בינוני-גבוה (DMEM)&nbsp;</td><td>Merck, ארה"ב</td><td>D6429</td><td></td></tr><tr>מכונת <td></td><td></td><td></td><td>גילוח חשמלית</td></tr><tr><td>FACS צינור</td><td>תרמו, ארה"ב</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td> <td>PAN Biotech, Alemania</td><td>P30-3306</td><td></td></tr><tr><td>ציטומטר זרימה ציטופלקס&nbsp;</td><td>בקמן קולטר</td><td></td><td></td></tr><tr><td>האנק תמיסת מלח מאוזנת&nbsp;</td><td>Merck, ארה"ב</td><td>H2387</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין</td><td>קורנינג, ארה"ב&nbsp;</td><td></td><td></td>15393631</tr><tr><td>Liberase TM&nbsp;</td><td>רוש, ארה"ב</td><td>5401119001</td><td></td></tr><tr><td>לשכת נויבאואר Counting Chambers</td><td>China</td><td>1103</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Percoll&nbsp;</td><td>Merck, ארה"ב</td><td></td><td>צנטריפוגה שיפוע צפיפות 17089101&nbsp;</td></tr><tr><td>תמיסת פולי-L-ליזין&nbsp;</td><td>Merck, ארה"ב</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>אזמל מס' 25&nbsp;</td><td>HERGOM, מקסיקו</td><td>H23</td><td></td></tr><tr><td>Snaplock Microcentrifuge Tubes 2 מ"ל</td><td>Axygen, ארה"ב</td><td>10011-680</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ סטריאוסקופי</td><td>Velab, מקסיקו</td><td>HG927831</td><td></td></tr><tr><td>מספריים כירורגיים ישרים (10 ס"מ)</td><td>HERGOM, מקסיקו</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מספריים ישרים של</td><td>HERGOM, מקסיקו</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Merck, ארה"ב</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>כתם כחול טריפן 0.4%&nbsp;</td><td>Merck, ארה"ב</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>מערבל מערבולת</td><td>DLAB, סין</td><td>8031102000</td><td></td></tr><tr><td>Zombie Aqua ערכת כדאיות ניתנת לתיקון</td><td>BioLegend, ארה"ב</td><td>423102</td><td>צביעת צבע פלואורסצנטי תגובתי לאמין&nbsp;</td></tr></tbody></table>

העשרה מהירה ויעילה של תאי מיקרוגליה בחוט השדרה של עכבר

Rapid and Efficient Enrichment of Mouse Spinal Cord Microglia

עמוד השדרה מגדיר חוליה ומעצב את תעלת עמוד השדרה, חלל התוחם ושומר על חוט השדרה. התפתחות ותפקוד תקין של מערכת העצבים המרכזית של יונקים מסתמכים באופן משמעותי על פעילותם של מקרופאגים מקומיים המכונים מיקרוגליה. מיקרוגליה מציגה הטרוגניות ורב-תפקודיות, ומאפשרת ביטוי גנים והתנהגות מובחנים בתוך חוט השדרה והמוח. מחקרים רבים בחנו את תפקוד תאי המיקרוגליה במוח, ומפרטים בהרחבה את שיטות הטיהור. עם זאת, טיהור תאי מיקרוגליה מחוט השדרה בעכברים חסר תיאור מקיף. לעומת זאת, השימוש בקולגנאז מטוהר מאוד, בניגוד לתמצית לא מזוקקת, חסר דיווח ברקמות מערכת העצבים המרכזית. במחקר זה, עמוד השדרה וחוט השדרה נכרתו מעכברי C57BL/6 בני 8-10 שבועות. העיכול שלאחר מכן השתמש בקולגנאז מטוהר מאוד, וטיהור מיקרוגליה השתמש בשיפוע צפיפות. התאים עברו צביעה לצורך ציטומטריית זרימה, הערכת כדאיות וטוהר באמצעות צביעת CD11b ו-CD45. התוצאות הניבו כדאיות ממוצעת של 80% וטוהר ממוצע של 95%. לסיכום, מניפולציה של מיקרוגליה בעכבר כללה עיכול עם קולגן מטוהר מאוד, ואחריו שיפוע צפיפות. גישה זו יצרה למעשה אוכלוסיות משמעותיות של מיקרוגליה בחוט השדרה.

עיכול אנזימטי באמצעות רקמת חוט השדרה של עכבר בוצע באמצעות תערובת מועשרת מאוד בקולגנאז ותרמוליזין. הרקמה המעוכלת שנוצרה עברה מעבר דרך מסנן של 40 מיקרומטר כדי לחסל חומר לא מעוכל. התאים שנאספו הועשרו באמצעות שיפוע צפיפות פרקול, עם 90% בחלק התחתון ו-45% בחלק העליון. התאים המועשרים במיקרוגליה בתוך הממשק הוכתמו בנוגדנים CD45 ו-CD11b ועברו ניתוח ציטומטרי של זרימה (איור 1).
דיסקציה של עמוד השדרה המשתרע מאזור העורף אל העצה, כרוכה בחשיפה ודיסקציה של השרירים הפרא-חולייתיים. ...

מיקרוגליה נחשבים לחלק מהתאים הרבגוניים ביותר בגוף, המסוגלים להסתגלות מורפולוגית ותפקודית. ההטרוגניות והרב-תכליתיות שלהם מאפשרות שמירה על הומאוסטזיס מוחי, תוך שהם קשורים גם לפתולוגיות נוירולוגיות שונות. כאן מתוארת טכניקה לטיהור מיקרוגליה של חוט השדרה.

The vertebral column defines a vertebrate and shapes the spinal canal, a cavity that encloses and safeguards the spinal cord. Proper development and ...

המחקר שלנו מתמקד בהטרוגניות של תאי מיקרוגליה, אשר יכולים להפגין התנהגויות פרו-דלקתיות ונוגדות דלקת על פני פתולוגיות ואזורים שונים כמו המוח וחוט השדרה. אנו שואפים לאפשר הבנה עמוקה יותר של התנהגות תאי מיקרוגליה בחוט השדרה בתרחישים מגוונים. ההטרוגניות של מיקרוגליה הקשתה על סיווגם .השנה הוצע סיווג חדש ורחב החורג מעבר לסטטוס פרו או אנטי דלקתי בלבד. כיום, השגת טוהר וג'ל גבוהים בבידוד מיקרוגליה של חוט השדרה ממודלים של בעלי חיים של פתולוגיות נוירולוגיות היא ניסוי ואתגר משמעותי. זיהינו מסלול איתות ציטוקינים חדשני במיקרוגליה של חוט השדרה במהלך כאב כרוני.הפרוטוקול שלנו מאפשר עיכול מבוקר וסומטי יותר, ואחריו שיפוע צפיפות. שתיהן גורמות לפחות זיהום על ידי אסטרוציטים בהשוואה לטכניקות המשמשות כיום לטיהור תאי מיקרוגליה מחוט השדרה, המוח או העוברים.

rapid-and-efficient-enrichment-of-mouse-spinal-cord-microglia

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

בסרטון זה אנו מתארים פרוטוקול לבידוד תאי CD11b, כולל מיקרוגליה, ממוחות של גורי עכברים באמצעות מיון תאים המופעל באמצעות מגנטית. רקמות המוח הומוגניות כדי לקבל תרחיפים חד-תאיים, אשר מודגרים עם מיקרו-חרוזים מצופים נוגדנים נגד CD11b, ולאחר מכן הפרדה מבוססת עמודה מגנטית כדי לטהר את אוכלוסיית התאים CD11b+.

בידוד מגנטי של תאי מיקרוגליה ממוחות של גורי עכברים

סרטון זה מדגים טכניקה לבידוד וטיפוח תאי גלייה מעורבים ראשוניים מרקמת חוט השדרה של עכבר בוגר. הפרוטוקול כולל עיכול אנזימטי של הרקמה, ואחריו הסרת קרומי תאים שבורים ופסולת מיאלין כדי להשיג אוכלוסייה של תא יחיד. לאחר מכן התאים מתורבתים במדיה המותאמת לגידול תאי גלייה מעורבים.

הקמת תרביות תאי גליה מעורבים ראשוניים מחוט השדרה של עכבר

אנו מתארים שיטות לבידוד היעילה ומהיר / התרבות של microglia קיימא מקליפת המוח וחוט השדרה בילוד מבוגר. הנתיחה והציפוי של microglia קליפת המוח יכולים להיות מושלמת תוך 90 דקות, עם קציר microglial שלאחר מכן מתקיים ~ 10 ימים לאחר הנתיחה הראשונית.

Microglia culturing ממערכת העצבים המרכזי וילודים למבוגרים

התפתחות כאב נוירופתי כרוך שינויים פתולוגיים של תאי גלייה בחוט השדרה. מערכת תרבות גליה אמינה נגזרה רקמת חוט שדרה מבוגרת ועוצבה ללימוד תאים אלה במבחנה חסרה. לכן, אנו מציגים כאן כיצד להקים תרבויות גליה מעורבות עיקריות מרקמות כבל מבוגר עכבר שדרה.

הכנת תרבויות גליה מעורבת ראשיים מרקמות קורד למבוגרים עכבר השדרה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבודד microglia מ גורי עכבר לאחר לידה (יום 1) עבור ניסויים במבחנה. שיטה מאולתרת זו של בידוד מייצר היא גבוהה תשואה וטוהרת, יתרון משמעותי על פני שיטות חלופיות המאפשר התנסות במגוון רחבה לצורך הבהרת ביולוגית microglial.

בידוד ראפיד ומעודן CD11b מגנטי של Microglia הראשי עם טוהר משופר רבגוני

פרוטוקול עבור בידודו של ראשי מיקרוגלייה מן המוח מאתר מוצג. טכניקה זו מסייעת בהבנה הנוכחי של מחלות נוירולוגיות. צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות הפרדה מגנטית משולבים כדי לייצר תשואה מספקת של מדגם מאוד טהור. יתר על כן, אנו חלוקה לרמות את השלבים עבור אפיון מיקרוגלייה.

אפיון ובידוד של העכבר מיקרוגלייה העיקרי על ידי צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות

אנו מספקים פרוטוקול עבור בידוד של מיקרוגלייה מאזורים בגזור שונים של המוח העכבר באמצע המחצית, ואחריו הכנה חצי אוטומטי הספריה לרצף העמוק של RNA תא בודד של טרנססקריפט באורך מלא. שיטה זו תסייע להבהיר טרוגניות תפקודית של מיקרוגלייה בריאות ומחלות.

בידוד של אזור-מיקרוגליה ספציפי מתוך חצי הכדור השני של המוח העכבר עבור רצפי RNA של תא יחיד בודד

פרוטוקול זה הוא שיטה יעילה, חסכונית וחזקה של בידוד microglia ראשוני מלחיות, מבוגר, רקמת מוח אנושית. microglia אנושי ראשוני מבודד יכול לשמש ככלי לחקר תהליכים תאיים בהונואוסטזיס ומחלות.

קבלת מיקרוליה אנושית רקמת מוח אנושית בוגרת

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד וטיהור מיקרוגליה ראשונית במודלים של בעלי חיים של מחלות דה-מיאלינציה, תוך שימוש במיון תאים המופעלים על ידי מגנטים.

בידוד של מיקרוגליה ראשונית של עכבר על ידי מיון תאים המופעלים מגנטית במודלים של בעלי חיים של Demyelination

פרוטוקול זה מתאר את הבידוד של אסטרוציטים מטוהרים ותאי מיקרוגליה מחוט השדרה של העכבר הבוגר, ומקל על יישומים עתידיים כגון ניתוח RNA ותרבית תאים. הוא כולל שיטות ונהלים מפורטים לדיסוציאציה של תאים שנועדו לשפר הן את האיכות והן את התפוקה של תאים מבודדים.

בידוד אסטרוציטים טהורים ותאי מיקרוגליה מחוט השדרה של העכבר הבוגר עבור בדיקות חוץ גופיות ומחקרי שעתוק

זיהוי מיקרוגליה (MG) ומקרופאגים חודרים היקפיים (Mø) בחוט השדרה הפגועים הוא קשה. בפרוטוקול זה, נעשה שימוש בזרימה ציטומטרית (FCM) לזיהוי MG דמוי M1, MG דמוי M2, M1 דמוי Mø ו-M2 דמוי Mø, בהתאמה. ניתן ליישם טכנולוגיה זו גם על מחלות אחרות של מערכת העצבים המרכזית כדי להבין את תפקידם של MG ו-Mø.

זיהוי מיקרוגליה ומקרופאגים חודרים היקפיים בחוט השדרה הפגוע באמצעות ציטומטריית זרימה

למד שיטה יעילה להפרדת תאי מיקרוגליה מחוט השדרה של עכברים. הפרוטוקול משתמש בעיכול סומטי ובהפרדה צפיפותית להשגת טוהר של עד 99% ללא זיהום אסטרוציטים.

העשרה מהירה ויעילה של תאי מיקרוגליה בחוט השדרה של עכבר

גלה סרטונים נוספים