Name: מדידת עצירות במודל דרוזופילה של מחלת פרקינסון (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-22T14:40:00.000+00:00
Duration: 3 min 20 s
Description: למדו שיטה פשוטה למדידת עצירות בזבובי פירות עם ניוון עצבי הקשור לפרקינסון. השיטה משתמשת בצבע כחול כדי לעקוב אחרי זמן מעבר במעי ומאפשרת חקר תסמינים שאינם מוטוריים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לד"ר מל פאני מבית החולים בריגהם ונשים ובבית הספר לרפואה של הרווארד על המתנה האדיבה של הבקרה והאלפא-סינוקלאין המבטאים קווי דרוזופילה . אנו מכירים במקורות הבאים לתמיכה במענקים לד"ר אולסן: NINDS K08, מלגת ג'ורג' קוטציאס של האגודה האמריקאית למחלות פרקינסון, פרס החוקר המוקדם של מחלת הפרקינסון של משרד ההגנה.

זבובים המשמשים בבדיקה זו: בקרה: nSyb-QF2, nSyb-Gal4/+; זבובי אלפא-סינוקלאין: nSyb-QF2, nSyb-Gal4, QUAS-alpha-synuclein/+; 1 ו -10 ימים לאחר האקלוסיה; זבובים זכרים ונקבות (מזווגים ולא מזווגים) (ראו טבלת חומרים).
1. הכנת מזון הזבובים הצבועים
<ol><li>יש לערבב משחת כמוסת ג'ל כחולה לצבעי מאכל (ראו טבלת חומרים) עם מים מזוקקים ביחס של 1:1 (v/v). הערה: השתמשו בצבעי מאכל מסחריים המכילים רק צבעים שאינם נספגים, שכן צבעים כחולים מסוימים הוכחו כבעלי השפעות נוירו-פרוטקטיביות21.</li>
	<li>חממו במיקרוגל את הבקבוקונים של מזון זבובים המורכב מקמח תירס סטנדרטי (ראו טבלת חומרים) במרווחים של 10-15 שניות עד שהמזון נמס לנוזל או לתרחיץ. אין לאפשר לאוכל לרתוח.</li>
	<li>מוסיפים את תערובת הצבעים לכל בקבוקון מזון לקבלת צבע אחיד בין הבקבוקונים. ערבבו בתערובת הצבעים עד שהמזון יהיה כחול הומוגני (איור 1). מוסיפים כמות מתערובת הצבע הכחול כך שצבע המזון רווי, ואין שונות בצבע בין הבקבוקונים. הערה: שלב זה חייב להיעשות מיד לאחר microwaving, כמו המזון מתמצק במהירות. אם המזון מתמצק, חממו שוב את הבקבוקון במיקרוגל.</li>
	<li>השאירו את בקבוקוני המזון הצבוע להתייבש באוויר עד שהוא יתמצק. הניחו מגבת נייר דקה על פתחי בקבוקונים בזמן הייבוש כדי למנוע מזבובים תועים לנחות בבקבוקון.</li>
	<li>לאחר שהמזון התקרר והתמצק, העבירו את הזבובים שישמשו לבדיקה למזון הכחול. הערה: עבור בקבוקונים צרים (25 מ"מ), מומלץ להוסיף 9-14 זבובים לכל בקבוקון. עבור בקבוקונים רחבים (28.5 מ"מ), מומלץ להוסיף 10-20 זבובים לכל בקבוקון. הזבובים אינם מופרדים על ידי מין או ניסיון הזדווגות וכוללים אוכלוסייה מעורבת של זבובים זכרים ונקבות, עם נקבות מזווגות ולא מזווגות.</li>
	<li>לדגור על בקבוקונים עם זבובים לילה ב 25 °C (75 °F) באינקובטור.</li>
</ol>2. הדמיה של הזבובים
הערה: שלב זה הוא אופציונלי (איור 2).
<ol><li>למחרת בבוקר (זמן 0), להרדים את הזבובים המייצגים עם פחמן דו חמצני במשך 60 שניות. הניחו את הזבוב כך שהצד הגחוני פונה כלפי מעלה.</li>
	<li>באמצעות מצלמה (ראו טבלת חומרים), לכדו תמונות של הזבובים בכל שעה כדי להמחיש את כמות המזון הכחול שנותרה במערכת העיכול. הערה: אין להשתמש בזבובים אלה עבור החלק הכמותי של הבדיקה (שלב 3), שכן הרדמה עלולה להשפיע על התוצאות.</li>
	<li>בכל שעה, להרדים ולצלם זבובים חדשים.</li>
</ol>3. ביצוע בדיקת עצירות
<ol><li>מעבירים את הזבובים הנותרים (שאינם מורדמים) לבקבוקונים עם מזון דרוזופילה סטנדרטי. מספר כל בקבוקון.</li>
	<li>השאירו את הזבובים באינקובטור ב 25 °C למשך 60 דקות.</li>
	<li>לאחר 60 דקות, מעבירים את הזבובים לבקבוקונים חדשים עם מזון דרוזופילה סטנדרטי. התחל להקליט נתונים מקבוצת הבקבוקונים הראשונה.</li>
	<li>ציירו קו מקווקו לאורך הבקבוקון כדי לסמן את הנקודה שממנה תתחיל הספירה.</li>
	<li>ספור ידנית את מספר הנקודות הקטנות והעגולות על הקיר של כל בקבוקון. אין לספור נקודות שנמצאו על תקע המזון או הבקבוקון.</li>
	<li>התחילו בספירת מספר הנקודות הכחולות על הקיר של כל בקבוקון.</li>
	<li>ספרו את מספר הנקודות האטומות וחסרות הצבע על הקיר של כל בקבוקון. הערה: כל נקודה היא צואת זבובים, שהיא שילוב של שתן וחומר צואתי22. לעיתים, זבוב עשוי ללכת על הצואה ולהשאיר שובל, ובמקרה זה, לספור רק את הנקודה המקורית, ולא כל סימן בודד בשביל.</li>
	<li>רשום את היחס בין נקודות כחולות למספר הכולל של נקודות עבור כל בקבוקון. הערה: מספר הנקודות הכולל הוא מספר הנקודות הכחולות על קיר בקבוקון שנוסף למספר הנקודות חסרות הצבע על הקיר של אותו בקבוקון. זה ישמש לחישוב אחוז חומר צואה כחול לשעה.</li>
	<li>חזור על שלבים 3.2-3.8 שבע פעמים נוספות, ואסוף נתונים בכל שעה במשך 8 שעות בסך הכל.</li>
</ol>4. ניתוח נתונים
<ol><li>גרף את אחוז החומר הצואה הכחול לשעה עבור כל מצב.</li>
	<li>השווה את הנתונים בין התנאים. הערה: ניתן לקבוע מובהקות סטטיסטית בשלוש דרכים: על ידי השוואת נקודות זמן בודדות בין תנאים, על ידי מדידת שיפוע הקו לאורך זמן, או על ידי השוואת השטח מתחת לעקומה.</li>
</ol>

בדיקות עצירות בזבובי דרוזופילה

<ol><li>Kalia, L. V., Lang, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease.</a> Lancet. 386 (9996), 896-912 (2015).</li>
<li>Bloem, B. R., Okun, M. S., Klein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease.</a> Lancet. 397 (10291), 2284-2303 (2021).</li>
<li>Ball, N., Teo, W. P., Chandra, S., Chapman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease+and+the+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurol%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease and the environment.</a> Front Neurol. 10, 218(2019).</li>
<li>Zhou, J., Li, J., Papaneri, A. B., Kobzar, N. P., Cui, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+neuron+challenge+test+for+early+detection+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Parkinsons+Dis%22%5BJournal%5D)">Dopamine neuron challenge test for early detection of Parkinson's disease.</a> NPJ Parkinsons Dis. 7 (1), 116(2021).</li>
<li>Ueki, A., Otsuka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+style+risks+of+Parkinson%27s+disease%3A+association+between+decreased+water+intake+and+constipation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol%22%5BJournal%5D)">Life style risks of Parkinson's disease: association between decreased water intake and constipation.</a> J Neurol. 251 (Suppl 7), vII18-vII23 (2004).</li>
<li>Houser, M. C., Tansey, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gut-brain+axis%3A+is+intestinal+inflammation+a+silent+driver+of+Parkinson%27s+disease+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Parkinsons+Dis%22%5BJournal%5D)">The gut-brain axis: is intestinal inflammation a silent driver of Parkinson's disease pathogenesis.</a> NPJ Parkinsons Dis. 3, 3(2017).</li>
<li>Pfeiffer, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-motor+symptoms+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Parkinsonism+Relat+Disord%22%5BJournal%5D)">Non-motor symptoms in Parkinson's disease.</a> Parkinsonism Relat Disord. 22 (Suppl 1), (2016).</li>
<li>Klann, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Gut-brain+axis+and+its+relation+to+parkinson%27s+disease%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Aging+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The Gut-brain axis and its relation to parkinson's disease: A review.</a> Front Aging Neurosci. 13, 782082(2021).</li>
<li>Mukherjee, A., Biswas, A., Das, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+dysfunction+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Gut dysfunction in Parkinson's disease.</a> World J Gastroenterol. 22 (25), 5742-5752 (2016).</li>
<li>Yemula, N., Dietrich, C., Dostal, V., Hornberger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease+and+the+gut%3A+symptoms%2C+nutrition%2C+and+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22J+Parkinsons+Dis%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease and the gut: symptoms, nutrition, and microbiota.</a> J Parkinsons Dis. 11 (4), 1491-1505 (2021).</li>
<li>Chen, S. J., Lin, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+microenvironmental+changes+as+a+potential+trigger+in+Parkinson%27s+disease+through+the+gut-brain+axis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Sci%22%5BJournal%5D)">Gut microenvironmental changes as a potential trigger in Parkinson's disease through the gut-brain axis.</a> J Biomed Sci. 29 (1), 54(2022).</li>
<li>Hawrysh, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRKN%2Fparkin-mediated+mitophagy+is+induced+by+the+probiotics+Saccharomyces+boulardii+and+Lactococcus+lactis%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">PRKN/parkin-mediated mitophagy is induced by the probiotics Saccharomyces boulardii and Lactococcus lactis.</a> Autophagy. 19 (7), 2094-2110 (2023).</li>
<li>Liu, W., Lim, K. L., Tan, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestine-derived+%CE%B1-synuclein+initiates+and+aggravates+pathogenesis+of+Parkinson%27s+disease+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Neurodegener%22%5BJournal%5D)">Intestine-derived α-synuclein initiates and aggravates pathogenesis of Parkinson's disease in Drosophila.</a> Transl Neurodegener. 11 (1), 44(2022).</li>
<li>Rota, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constipation%2C+deficit+in+colon+contractions+and+alpha-synuclein+inclusions+within+the+colon+precede+motor+abnormalities+and+neurodegeneration+in+the+central+nervous+system+in+a+mouse+model+of+alpha-synucleinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Neurodegener%22%5BJournal%5D)">Constipation, deficit in colon contractions and alpha-synuclein inclusions within the colon precede motor abnormalities and neurodegeneration in the central nervous system in a mouse model of alpha-synucleinopathy.</a> Transl Neurodegener. 8, 5(2019).</li>
<li>Diwakarla, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATH434+reverses+colorectal+dysfunction+in+the+A53T+mouse+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Parkinsons+Dis%22%5BJournal%5D)">ATH434 reverses colorectal dysfunction in the A53T mouse model of Parkinson's disease.</a> J Parkinsons Dis. 11 (4), 1821-1832 (2021).</li>
<li>Ordonez, D. G., Lee, M. K., Feany, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B1-synuclein+Induces+mitochondrial+dysfunction+through+spectrin+and+the+actin+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">α-synuclein Induces mitochondrial dysfunction through spectrin and the actin cytoskeleton.</a> Neuron. 97 (1), 108.e6-124.e6 (2018).</li>
<li>Olsen, A. L., Feany, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+%CE%B1-synuclein+promotes+neurodegeneration+characterized+by+a+distinct+transcriptional+program+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Glial α-synuclein promotes neurodegeneration characterized by a distinct transcriptional program in vivo.</a> Glia. 67 (10), 1933-1957 (2019).</li>
<li>Cognigni, P., Bailey, A. P., Miguel-Aliaga, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+neurons+and+systemic+signals+couple+nutritional+and+reproductive+status+with+intestinal+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Enteric neurons and systemic signals couple nutritional and reproductive status with intestinal homeostasis.</a> Cell Metab. 13 (1), 92-104 (2011).</li>
<li>Urquhart-Cronish, M., Sokolowski, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene-environment+interplay+in+Drosophila+melanogaster%3A+chronic+nutritional+deprivation+in+larval+life+affects+adult+fecal+output%5BTitle%5D)+AND+%22J+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Gene-environment interplay in Drosophila melanogaster: chronic nutritional deprivation in larval life affects adult fecal output.</a> J Insect Physiol. 69, 95-100 (2014).</li>
<li>Popovic, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blocking+dPerk+in+the+intestine+suppresses+neurodegeneration+in+a+Drosophila+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Blocking dPerk in the intestine suppresses neurodegeneration in a Drosophila model of Parkinson's disease.</a> Cell Death Dis. 14 (3), 206(2023).</li>
<li>Poteet, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+actions+of+methylene+blue+and+its+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective actions of methylene blue and its derivatives.</a> PLoS One. 7 (10), e48279(2012).</li>
<li>Miguel-Aliaga, I., Jasper, H., Lemaitre, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+and+physiology+of+the+digestive+tract+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Anatomy and physiology of the digestive tract of Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 210 (2), 357-396 (2018).</li>
<li>Schlichting, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+neural+network+underlying+circadian+entrainment+and+photoperiodic+adjustment+of+sleep+and+activity+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A neural network underlying circadian entrainment and photoperiodic adjustment of sleep and activity in Drosophila.</a> J Neurosci. 36 (35), 9084-9096 (2016).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

ישנם מספר שלבים בפרוטוקול זה שיסייעו לסיום מוצלח של הבדיקה. ראשית, חשוב לוודא שמרווחי הזמן בין כל סבב לכל בקבוקון יהיו עקביים לאורך כל הניסוי. תיוג הבקבוקונים במספרים יעזור למנוע את הצורך בתיאורי גנוטיפ ארוכים, ויחסוך זמן. בנוסף, חיוני שהשיטה לספירת חומר צואתי22 תישאר עקבית לאורך כל הניסוי. בעוד חומר צואתי כחול נראה על מזון תקע בקבוקון, חומר צואה חסר צבע לא. לכן, אין לספור את הנקודות הכחולות על תקע המזון או הבקבוקון.
עם בדיקות התנהגותיות, תמיד קיימת אפשרות של חוסר עקביות בתוצאות עקב תנודות בהתנהגות הזבוב או משתנים לא ידועים המשפיעים על הבדיקה. אנו ממליצים להשתמש באותה מדיה של דרוזופילה , באותו צבע מאכל ובאותו מותג בקבוקונים לכל הניסויים. באופן מעניין, במספר ניסויים נצפה כי זבובים נוטים לעשות את צרכיהם בתדירות נמוכה יותר בשעות אחר הצהריים המוקדמות, אולי בגלל השעון הביולוגי של הזבובים23. עם זאת, התנהגות זו עקבית הן בזבובי ביקורת והן בזבובים המבטאים אלפא-סינוקלאין, ולכן היא לא צריכה לעורר חששות.
אם הזבובים אינם מפרישים חומר צואתי כחול בתחילת הבדיקה, ייתכן שהצבע בו משתמשים אינו פיגמנטי מספיק. במקרה זה, ניתן להגדיל את היחס בין צבע למים מזוקקים בהתאם. ייתכן גם שכאשר נשארת רק כמות קטנה של מזון כחול במערכת העיכול של הזבוב, ייתכן שיהיה קשה לקבוע אם החומר הצואתי הוא כחול בהיר או חסר צבע. כאשר זה קורה, הצבת גיליון נייר לבן מאחורי בקבוקון יעזור לקבוע את הצבע של נקודה צואה. גם אם החומר הצואתי הוא כחול בהיר מאוד, עדיף לרשום אותו כחומר צואתי כחול ולא כחומר צואתי חסר צבע.
מגבלה אחת של בדיקה זו היא שהיא דורשת ספירה ידנית של כתמי צואה. כדי לשפר את הפוטנציאל לסינון בתפוקה גבוהה, פרוטוקול זה עשוי להשתנות בעתיד כדי לאפשר כימות אוטומטי של כתמי צואה כחולים המיוצרים על ידי זבובים בודדים בצלחות מרובות בארות. מגבלה נוספת היא שלמרות שלמודל אלפא-סינוקלאין יש פוטנציאל להתפתח למודל פרודרומלי של פרקינסון, עדיין לא זוהתה נקודת זמן אופטימלית שבה עצירות קיימת ללא ניוון עצבי.
לסיכום, שיטה זו מציעה גישה פשוטה ופשוטה למידול עצירות, תסמין פרקינסון לא מוטורי שלא נחקר מספיק, במודל דרוזופילה של פרקינסון.

מחלת פרקינסון (PD) היא הפרעה נוירודגנרטיבית מתקדמת המאופיינת קלינית בנוכחות תסמינים מוטוריים כגון ברדיקינזיה, נוקשות ורעד, וכתוצאה מכך תחלואה משמעותית1. מבחינה פתולוגית, מחלת פרקינסון מוגדרת על ידי אובדן נוירונים דופמינרגיים בחומר השחור וקיפול שגוי של אלפא-סינוקלאין, מה שמוביל להיווצרות גופי לוי ונויריטים לויים. הפתוגנזה של מחלת פרקינסון עדיין אינה מובנת היטב, ככל הנראה כתוצאה מיחסי גומלין מורכבים של גורמים גנטיים וסביבתיים 2,3. נכון לעכשיו, טיפולים משנים מחלה אינם זמינים, אולי בשל השלב המתקדם של הפתולוגיה הקיימת בזמן האבחון. מחקרים הראו כי יותר מ -60% מהנוירונים הדופמינרגיים בחומר השחור כבר אבדו עם הופעת הסימפטומים המוטוריים, מה שמדגיש את הצורך לחקור סמנים ביולוגיים פוטנציאליים לגילוי מוקדם של מחלות4. סמן ביולוגי קליני אחד כזה הוא עצירות, הנפוצה בקרב חולי פרקינסון 5,6 ועשויה להקדים את הופעת התסמינים המוטוריים בשנים ואף עשרות שנים.
למרות ההגדרה הקלינית של פרקינסון המבוססת על תסמינים מוטוריים, עצירות היא אחד ממספר תסמינים לא מוטוריים המאתגרים יותר לטיפול סימפטומטי וגורמים לפגיעה משמעותית באיכות החיים של החולים7. שינויים בציר מעי-מוח, המייצג תקשורת דו-כיוונית בין המוח למערכת העצבים האנטרית, היו מעורבים בפתוגנזה של פרקינסון. אגרגטים של אלפא-סינוקלאין נמצאו בדגימות רקמה ממערכת העיכול של חולי פרקינסון8, ומודלים של בעלי חיים מציעים כי אגרגטים של אלפא-סינוקלאין במערכת העצבים האנטרית התפשטו באופן דמוי פריון למערכת העצבים המרכזית9. נוסף על כך, חולי פרקינסון מפגינים חריגות במיקרוביום המעי10 ועלולים לחוות דלקת מעיים מוגזמת11. עצירות בפרקינסון לא נחקרה מספיק, עם מעט מודלים מדווחים של עצירות הקשורה לפרקינסון בזבובים12,13 או מכרסמים14,15.
בדיקה זו משתמשת במודל דרוזופילה של פרקינסון שבו זבובים מבטאים את הגן אלפא-סינוקלאין האנושי תחת שליטתו של נהג פאן-עצבי, n-synaptobrevin. זבובים אלה מציגים את כל המאפיינים הבולטים של מחלת פרקינסון, כולל צבירת אלפא-סינוקלאין, תפקוד מוטורי לקוי וניוון עצבי הקשור לגיל, וכתוצאה מכך אובדן נוירונים דופמינרגיים16,17. מחקרים קודמים הציגו מדידה של תפוקת צואה בזבובים כדי להעריך תפקוד לקוי של המעיים, כימות חומר צואתי של זבובים והשוואת כמויות הפרשות על פני קווים גנטיים שונים כדי לגלות הבדלים תפקודיים במערכת העיכול 18,19,20. כאן, אנו מדגימים את בדיקת העצירות באמצעות זבובים המבטאים אלפא-סינוקלאין אנושי. כלי פשוט אך רב ערך זה מאפשר לחקור סימפטום לא מוטורי חשוב של פרקינסון.

<table><tbody><tr><td>1400 גרם סוכרוז</td><td>MP ביומדיקל</td><td>904713</td><td></td></tr><tr><td>1800 גרם דקסטרוז</td><td>MP ביומדיקל</td><td>901521</td><td></td></tr><tr><td>2884 גרם שמרים</td><td>MP ביומדיקל</td><td>903312</td><td></td></tr><tr><td>428 גרם אגר</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>10253156</td><td></td></tr><tr><td>4600 מ"ל מולסה</td><td>מולסה של סבתא</td><td>7971942</td><td></td></tr><tr><td>68 ליטר מים</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>680 מ"ל תערובת טגוספט (1200 גרם טגוספט ב-6 ליטר אתנול)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>6864 גרם קמח תירס</td><td>טחינת פנינה</td><td>125045</td><td></td></tr><tr><td>תערובת חומצה 800 מ"ל (83 מ"ל חומצה זרחתית ב-1 ליטר מים + 836 מ"ל חומצה פרופיונית ב-1 ליטר מים)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>cellSens תוכנה סטנדרטית</td><td>אולימפוס</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>Pharmco-Aper</td><td>111ACS200</td><td></td></tr><tr><td>זיזים לבקבוקוני פלסטיק רחבים</td><td>Genesee Scientific</td><td>49-101</td><td></td></tr><tr><td>בקבוקוני Flystuff רחבים של Drosophila, פוליסטירן</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-117</td><td></td></tr><tr><td>Graphpad</td><td>Prism GraphPad</td><td>N/A</td><td>גרסה 9.5.1</td></tr><tr><td>מצלמת Olympus DP23 Olympus</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus SZX12 מיקרוסקופ סטריאו</td><td>Olympus</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>חומצה זרחתית</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>S25470A</td><td></td></tr><tr><td>חומצה פרופיונית</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>A258 - 500&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>משחת ג'ל רכה צבע מאכל, כחול רויאל</td><td>AmeriColor</td><td>202</td><td></td></tr><tr><td>Tegosept</td><td>Apex</td><td>20-258</td><td></td></tr><tr><td>Drosophila Stocks</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>nSyb-QF2, nSyb-Gal4</td><td>כל הקווים המסופקים על ידי Dr. Mel Feany</td><td>N/A</td><td>Lines זמינים ישירות מ-Dr. Feany&nbsp;</td></tr><tr><td>nSyb-QF2, nSyb-Gal4, QUAS-alpha synuclein</td><td></td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>w1118</td><td></td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

מדידת עצירות במודל דרוזופילה של מחלת פרקינסון

Measuring Constipation in a Drosophila Model of Parkinson's Disease

תסמינים לא מוטוריים במחלת פרקינסון (PD) שכיחים, קשים לטיפול ופוגעים משמעותית באיכות החיים. סימפטום לא מוטורי שכיח אחד הוא עצירות, אשר יכולה להקדים את האבחנה של PD בשנים או אפילו עשרות שנים. עצירות לא נחקרה מספיק במודלים של פרקינסון בבעלי חיים וחסרה טיפולים ספציפיים. בדיקה זו משתמשת במודל דרוזופילה של פרקינסון שבו אלפא-סינוקלאין אנושי מבוטא תחת מניע פאן-עצבי. זבובים המבטאים אלפא-סינוקלאין מפתחים את המאפיינים הבולטים של מחלת פרקינסון: אובדן נוירונים דופמינרגיים, ליקוי מוטורי ותכלילי אלפא-סינוקלאין.
פרוטוקול זה מתווה שיטה לחקר עצירות בזבובים אלה. זבובים מונחים על מזון זבובים עם תוסף צבע כחול במשך הלילה ולאחר מכן מועברים מזון רגיל למחרת. לאחר מכן הם מועברים לבקבוקונים חדשים עם מזון זבובים סטנדרטי כל שעה במשך 8 שעות. לפני כל העברה מחושב אחוז כתמי הצואה בצבע כחול בהשוואה לסך כתמי הצואה על דופן הבקבוקון. זבובי בקרה חסרי אלפא-סינוקלאין מגרשים את כל הצבע הכחול שעות לפני שזבובים המבטאים אלפא-סינוקלאין. בנוסף, ניתן לעקוב אחר מעבר המזון בצבע כחול מהמעיים באמצעות צילום פשוט. הפשטות של בדיקה זו מאפשרת את השימוש בו במסכים גנטיים או כימיים קדמיים כדי לזהות משנים של עצירות בדרוזופילה.

מכיוון שהבטן של דרוזופילה שקופה, ניתן לדמיין מזון כחול בתוך המעיים בזבובים מורדמים חיים. ניתן להעריך הבדלים איכותיים במעבר המעי על ידי צילום תמונות של הזבובים בנקודות זמן שונות. בזבובי ביקורת, המזון הכחול מגורש במהירות, בעוד שבזבובי אלפא-סינוקלאין, המזון הכחול נשאר נוכח במעיים למשך 8 שעות (איור 2).
זבובי אלפא-סינוקלאין מציגים ניוון עצבי הקשור לגיל, עם פנוטיפ חזק המתפתח עד 10 ימים לאחר האקלוסיה10. בנקודת הזמן הזו, הבדלים בזמן המעבר של המעי בהשוואה לזבובי ביקורת נראים על-ידי השוואת נקודות זמן בודדות בין תנאים, על-ידי מדידת שיפוע הקו לאורך זמן, או על-ידי השוואת השטח שמתחת לעקומה (איור 3). לא נצפו הבדלים במעבר המעיים בין זבובי הבקרה לזבובי אלפא-סינוקלאין בנקודת זמן מוקדמת יותר, ביום הראשון שלאחר האקלוסיה, כאשר גם תפקוד מוטורי לקוי וניוון עצבי עדיין אינם נוכחים (איור 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65966/65966fig1v2.jpg"> איור 1: בקבוקוני מזון כחולים וכתמי צואה. (A) כל הבקבוקונים מכילים מזון בצבע כחול. בנקודה זו בזמן, זבובים הוכנסו זה עתה למזון הכחול, ואין חומר צואתי כחול גלוי. (B) בקבוקון לאחר W1118 הועבר למזון טרי למשך שעה אחת, ואז הוסר. הכניסה השמאלית מוגדלת ב- (C), והכניסה הימנית מוגדלת ב- (D). (ג) אזור שהוחרג מהניתוח בשל הימצאות מזון לזבובים. (D) תצוגה מוגדלת של כתמי צואה, המציינת כתמים כחולים (חצים שחורים) וכתמים שאינם כחולים (חיצים צהובים). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65966/65966fig1v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65966/65966fig02.jpg"> איור 2: הדמיה של מעבר מעיים של מזון צבוע לאורך זמן. זבובי בקרה וזבובי ביקורת המבטאים אלפא-סינוקלאין אנושי בתאי עצב הושארו על מזון צבוע כחול למשך הלילה ולאחר מכן הועברו למדיה סטנדרטית למחרת. זבובים הועברו באופן סדרתי למזון זבובים סטנדרטי חדש בכל שעה. מוצגות תמונות מייצגות בזמן אפס ו- 2, 4, 6 ו- 8 שעות לאחר ההעברה. זבובי בקרה ואלפא-סינוקלאין מראים כתמים דומים של מזון כחול במעיים בזמן אפס. בנקודות הזמן הבאות, לזבובי הבקרה יש פחות מזון כחול מאשר לזבובי אלפא-סינוקלאין, וכל המזון הכחול נעלם בנקודת הזמן של 8 שעות בזבובי הביקורת. הגנוטיפים עבור כל קו זבוב הם כדלקמן: בקרה (nSyb-QF2, nSyb-Gal4/+); זבובי אלפא-סינוקלאין (nSyb-QF2, nSyb-Gal4, QUAS-alpha-synuclein/+). נקבות זבובים משמשות להדמיה בשל יכולתן הקלה יותר לדמיין את הבטן בגלל גודלן הגדול יותר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65966/65966fig2v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65966/65966fig3v2.jpg"> איור 3: בדיקת עצירות בזבובים שלאחר אקלוסיה ביום ה-10. זבובי ביקורת וזבובי ביקורת המבטאים אלפא-סינוקלאין אנושי בתאי עצב הושארו על מזון צבוע כחול למשך הלילה ולאחר מכן הועברו למזון זבובים סטנדרטי למחרת. זבובים הועברו באופן סדרתי למדיה סטנדרטית חדשה בכל שעה. (A) אחוז חומר צואתי כחול לשעה. קווי שגיאה מייצגים סטיית תקן. N = 6 בקבוקונים לכל גנוטיפ; כל בקבוקון הכיל 9-14 זבובים. כל הניתוחים הסטטיסטיים בוצעו ב-Graphpad Prism (ראו טבלת חומרים). מובהקות סטטיסטית בכל נקודת זמן חושבה באמצעות ANOVA דו-כיוונית. שיפוע הקו וההפרש בין השיפועים חושבו באמצעות ניתוח רגרסיה ליניארית. (B) השטח מתחת לעקומה עבור כל גנוטיפ חושב. קווי שגיאה מייצגים סטיית תקן. הגנוטיפים עבור כל קו זבוב הם כדלקמן: בקרה (nSyb-QF2, nSyb-Gal4/+); זבובי אלפא-סינוקלאין (nSyb-QF2, nSyb-Gal4, QUAS-alpha-synuclein/+). גם הזבובים הזכרים וגם הזבובים הנקביים נכללים במספרים שווים פחות או יותר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65966/65966fig3v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65966/65966fig4v2.jpg"> איור 4: בדיקת עצירות בזבובים שלאחר אקלוסיה ביום הראשון. זבובי בקרה וזבובי ביקורת המבטאים אלפא-סינוקלאין אנושי בתאי עצב הושארו על מזון צבוע כחול למשך הלילה ולאחר מכן הועברו למדיה סטנדרטית למחרת. זבובים הועברו באופן סדרתי למזון זבובים סטנדרטי חדש בכל שעה. (A) אחוז חומר צואתי כחול לשעה. קווי שגיאה מייצגים סטיית תקן. N = מינימום 5 בקבוקונים לכל גנוטיפ; כל בקבוקון הכיל 9-14 זבובים. כל הניתוחים הסטטיסטיים בוצעו ב-Graphpad Prism. מובהקות סטטיסטית בכל נקודת זמן חושבה באמצעות ANOVA דו-כיוונית. שיפוע הקו וההפרש בין השיפועים חושבו באמצעות ניתוח רגרסיה ליניארית. (B) השטח מתחת לעקומה עבור כל גנוטיפ חושב. קווי שגיאה מייצגים סטיית תקן. הגנוטיפים עבור כל קו זבוב הם כדלקמן: בקרה (nSyb-QF2, nSyb-Gal4/+); זבובי אלפא-סינוקלאין (nSyb-QF2, nSyb-Gal4, QUAS-alpha-synuclein/+). גם הזבובים הזכרים וגם הזבובים הנקביים נכללים במספרים שווים פחות או יותר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65966/65966fig4v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

פרוטוקול זה מציג בדיקה למידול עצירות במודל דרוזופילה מבוסס אלפא-סינוקלאין של מחלת פרקינסון.

Non-motor symptoms in Parkinson's disease (PD) are common, difficult to treat, and significantly impair quality of life. One prevalent non-motor symptom ...

מחלת פרקינסון מוגדרת על ידי הסימפטומים המוטוריים של ברדיקינזיה, רעד ונוקשות. אך חולי פרקינסון רבים סובלים מתסמינים לא מוטוריים, שקשים יותר לטיפול וגורמים לפגיעה גדולה יותר באיכות החיים. אלה לא נחקרו היטב במודלים של בעלי חיים של המחלה, מה שמגביל את יכולתנו למצוא טיפולים חדשים עבורם.פרוטוקול זה הוא פשוט וזול, אך מייצר תוצאות הניתנות לשחזור. זה קל ללמוד ולא דורש ציוד מיוחד. עם בדיקה פשוטה זו, אנו יכולים להעריך עצירות אצל זבובים שיש להם ניוון עצבי.בעתיד, אנו מקווים לפתח מודל שבו זבובים מפתחים עצירות לפני תחילת ניוון עצבי. זה יאפשר לנו להבין טוב יותר את הפתוגנזה של מחלת פרקינסון.

measuring-constipation-in-a-drosophila-model-of-parkinson-s-disease

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

מבחני התנהגות למדידת פונקציות של תנועה, למידה, ויכולות...

Assaying של תנועה, למידה, וזיכרון גירעונות תסיסנית מודלים של ניוון מוחיים

מחלת פרקינסון היא הפרעה ניוונית של מערכת עצבים, הנובעת מהניוון של נוירונים דופאמין במערכת העצבים המרכזית, גורמים לליקויי תנועה. מודלים Rotenone מחלת פרקינסון בדרוזופילה. מאמר זה מתאר שני מבחני המאפיינים את ליקויי תנועה הן ספונטניים ולהבהיל מושרים נגרמים על ידי rotenone.

שיטות כדי לאפיין ספונטניות ומושרות רתיעת תנועה במודל של מחלת פרקינסון מושרה Rotenone של<em&gt; דרוזופילה</em

אנו מציגים בדיקת גיאוטקסיס שלילית אופטימלית, זולה ואמינה ב-Drosophila melanogaster כמודל להפרעות ניווניות. בהיותה רגישה יותר לפגמים תנועתיים קלים, בדיקה זו תעזור לסנן אינטראקציות גנטיות פוטנציאליות ומטרות תרופתיות.

ניתוח כמותי של פגמים טיפוס בדגם תסיסנית של הפרעות ניווניות

במאמר זה, אנו מציגים כיצד להשתמש במערכת ניקוד של שבע נקודות כדי לכמת באופן עקבי שינויים במורפולוגיה של נוירון דנדריט דופאמין ב- C. elegans. מערכת זו מיועדת לנתחים של בדיקות ניוון עצבי דופאמין באמצעות מודלים גנטיים, כימיים ומבוססי גיל של הפרעות ניווניות.

כימות רמות של נוירון דופאמין שינוי מורפולוגי ניוון ב elegans Caenorhabditis

פרוטוקול זה מפרט בדיקת הצואה הכמותית ב-Caenorhabditis elegans צעירים מ-RAC1/CED-10, ומספק מודל פשוט לחקר שלבי מחלת פרקינסון פרודרומליים. היא מתגברת על מגבלות של מודלים בעלי חיים אחרים ומקלה על בדיקות אסטרטגיות טיפוליות המתמקדות בפתולוגיה פרקינסונית מוקדמת.

הערכת תנועתיות מערכת העיכול במוטנטים CAENORHABDITIS elegans RAC1/CED-10 ככלי לחקר מחלת פרקינסון מוקדמת

מאמר זה מתאר assay התנהגותיים המשתמש כונן הזדווגות זכר תסיסנית melanogaste r ללמוד מוטיבציה. באמצעות שיטה זו, חוקרים יכולים לנצל טכניקות neurogenetic זבוב מתקדם לחשוף את המנגנונים הגנטיים, מולקולריים והמכשירים סלולריים העומדים בבסיס המוטיבציה הזו.

מדידת כונן מזווג סירוס ועיקור במאלה<em&gt; תסיסנית</em

כאן אנחנו מדגימים כיצד מולקולה בודדת לוקליזציה מופעל צילום מיקרוסקופ יכול להתבצע על הטרמינל עצבים מוטוריים של חיים דרוזופילה melanogaster השלישי instar זחל.

אין ויוו מעקב אחר בתחנת האוטובוסים Presynaptic עצבים מוטוריים דרוזופילה מולקולה בודדת

פרוטוקול זה מתמקד ניתוח כמותי של מורכבות עצביים arborization דנדריטים (NDAC) דרוזופילה, אשר יכול לשמש עבור מחקרים של מורפוגנזה דנדריטים.

ניתוח כמותי של Arborization דנדריטים עצביים מורכבות בדרוזופילה

המטרה של מאמר זה היא לתאר את השלבים הדרושים עבור הדור של סיבים אלפא-synuclein, בקרת איכות הבאים, והשימוש של סיבים מראש בvivo.

דור של אלפא-סינונוקלאומין מראש בנוי ממונמרים והשימוש ב Vivo

כאן אנו מתארים את מערכת RatWalker, שנבנתה על ידי תכנון מחדש של מנגנון MouseWalker כדי להתאים לגודל ולמשקל המוגדלים של חולדות. מערכת זו משתמשת בהשתקפות פנימית כוללת מתוסכלת (FTIR), לכידת וידאו במהירות גבוהה ותוכנת ניתוח בגישה פתוחה כדי לעקוב אחר פרמטרים של הליכה ולכמת אותם.

יישום מערכת RatWalker לניתוח הליכה במודל חולדה גנטי של מחלת פרקינסון

למדו שיטה פשוטה למדידת עצירות בזבובי פירות עם ניוון עצבי הקשור לפרקינסון. השיטה משתמשת בצבע כחול כדי לעקוב אחרי זמן מעבר במעי ומאפשרת חקר תסמינים שאינם מוטוריים.

מדידת עצירות במודל דרוזופילה של מחלת פרקינסון

גלה סרטונים נוספים