Name: בידוד חד-שלבי של בועיות חוץ-תאיות מדגימות בנפח גדול באמצעות התקן מיקרופלואידי A4F מפוצל (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-02T14:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 28 s
Description: למד בידוד בועיות חוץ-תאיות מדגימות בנפח גדול באמצעות התקן מיקרופלואידי A4F מפוצל. שיטה זו מאפשרת זרימה רציפה ואוטומציה לשימושים ביורפואיים קליניים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לכל התורמים שהשתתפו במחקר זה, לצוות מאגר הגנום הלטבי על מסירת הדגימות. המכון לפיסיקה של מצב מוצק, אוניברסיטת לטביה כמרכז המצוינות קיבל מימון מתוכנית המסגרת Horizon 2020 של האיחוד האירופי H2020-WIDESPREAD-01-2016-2017-TeamongPhase2 תחת הסכם מענק מס '739508, פרויקט CAMART2. עבודה זו נתמכה על ידי המועצה הלטבית למדע פרויקט מס '. lzp-2019/1-0142 ומספר פרויקט: lzp-2022/1-0373.

מכשיר מיקרופלואידי לבידוד שלפוחית חוץ-תאי רציף משתן אנושי

<ol><li>Colombo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis%2C+secretion%2C+and+intercellular+interactions+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 255-289 (2014).</li>
<li>Tricarico, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+and+biogenesis+of+shed+microvesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Small+GTPases%22%5BJournal%5D)">Biology and biogenesis of shed microvesicles.</a> Small GTPases. 8 (4), 220-232 (2017).</li>
<li>Yáñez-Mó, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+properties+of+extracellular+vesicles+and+their+physiological+functions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions.</a> J Extracell Vesicles. 4 (1), 27066(2015).</li>
<li>Théry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+%28MISEV2018%29%3A+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).</li>
<li>Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+as+an+emerging+drug+delivery+system+for+cancer+treatment%3A+Current+strategies+and+recent+advances%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Pharmacother%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles as an emerging drug delivery system for cancer treatment: Current strategies and recent advances.</a> Biomed Pharmacother. 153, 113480(2022).</li>
<li>Royo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+separation+and+characterization+of+extracellular+vesicles%3A+Results+of+a+Worldwide+Survey+Performed+by+the+ISEV+Rigor+and+Standardization+Subcommittee%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Methods for separation and characterization of extracellular vesicles: Results of a Worldwide Survey Performed by the ISEV Rigor and Standardization Subcommittee.</a> Cells. 9 (9), 1955(2020).</li>
<li>Sidhom, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+exosomal+isolation+methods%3A+Is+size+exclusion+chromatography+the+best+option%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">A review of exosomal isolation methods: Is size exclusion chromatography the best option.</a> Int J Mol Sci. 21 (18), 6466(2020).</li>
<li>Reshi, Q. U. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+extracellular+vesicles+%28EVs%29+using+benchtop+size+exclusion+chromatography+%28SEC%29+columns%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of extracellular vesicles (EVs) using benchtop size exclusion chromatography (SEC) columns.</a> Methods Mol Biol. 2273, 201-206 (2021).</li>
<li>Liangsupree, T., Multia, E., Riekkola, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modern+isolation+and+separation+techniques+for+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+A%22%5BJournal%5D)">Modern isolation and separation techniques for extracellular vesicles.</a> J Chromatogr A. 1636, 461773(2021).</li>
<li>Priedols, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bifurcated+asymmetric+field+flow+fractionation+of+nanoparticles+in+PDMS-free+microfluidic+devices+for+applications+in+label-free+extracellular+vesicle+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Polymers%22%5BJournal%5D)">Bifurcated asymmetric field flow fractionation of nanoparticles in PDMS-free microfluidic devices for applications in label-free extracellular vesicle separation.</a> Polymers. 15 (4), 789(2023).</li>
<li>Zhang, H., Lyden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric-flow+field-flow+fractionation+technology+for+exomere+and+small+extracellular+vesicle+separation+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Asymmetric-flow field-flow fractionation technology for exomere and small extracellular vesicle separation and characterization.</a> Nat Protoc. 14 (4), 1027-1053 (2019).</li>
<li>Talebjedi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploiting+microfluidics+for+extracellular+vesicle+isolation+and+characterization%3A+Potential+use+for+standardized+embryo+quality+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Vet+Sci%22%5BJournal%5D)">Exploiting microfluidics for extracellular vesicle isolation and characterization: Potential use for standardized embryo quality assessment.</a> Front Vet Sci. 7, 620809(2020).</li>
<li>van Meer, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+absorption+by+PDMS+in+the+context+of+drug+response+bioassays%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Small molecule absorption by PDMS in the context of drug response bioassays.</a> Biochem Biophys Res Commun. 482 (2), 323-328 (2017).</li>
<li>Jia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+extracellular+vesicles+isolation+and+separation%3A+Current+techniques%2C+pending+questions+and+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Small extracellular vesicles isolation and separation: Current techniques, pending questions and clinical applications.</a> Theranostics. 12 (15), 6548-6575 (2022).</li>
<li>Bussooa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+of+oxygen+levels+within+thermoplastic+Organ-on-Chip+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%3A+X%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring of oxygen levels within thermoplastic Organ-on-Chip devices.</a> Biosensors and Bioelectronics: X. 11, 100198(2022).</li>
<li>Tang, L., Lee, N. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+facile+route+for+irreversible+bonding+of+plastic-PDMS+hybrid+microdevices+at+room+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A facile route for irreversible bonding of plastic-PDMS hybrid microdevices at room temperature.</a> Lab Chip. 10 (10), 1274-1280 (2010).</li>
<li>Borda, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformable+neural+interface+based+on+off-stoichiometry+thiol-ene-epoxy+thermosets%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Conformable neural interface based on off-stoichiometry thiol-ene-epoxy thermosets.</a> Biomaterials. 293, 121979(2023).</li>
<li>Sandström, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reaction+injection+molding+and+direct+covalent+bonding+of+OSTE%2B+polymer+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Micromechanics+and+Microengineering%22%5BJournal%5D)">Reaction injection molding and direct covalent bonding of OSTE+ polymer microfluidic devices.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 25 (7), 075002(2015).</li>
<li>Sticker, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiol-ene+based+polymers+as+versatile+materials+for+microfluidic+devices+for+life+sciences+applications%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl+Mater+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Thiol-ene based polymers as versatile materials for microfluidic devices for life sciences applications.</a> ACS Appl Mater Interfaces. 12 (9), 10080-10095 (2020).</li>
<li>Bajo-Santos, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+isolation+from+large+volume+samples+using+a+polydimethylsiloxane-free+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles isolation from large volume samples using a polydimethylsiloxane-free microfluidic device.</a> Int J Mol Sci. 24 (9), 7971(2023).</li>
<li>Claridge, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+extracellular+vesicle+therapeutics%3A+Challenges%2C+considerations%2C+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of extracellular vesicle therapeutics: Challenges, considerations, and opportunities.</a> Front Cell Dev Biol. 9, 734720(2021).</li>
<li>Rezaie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+on+exosomes+application+in+clinical+trials%3A+Perspective%2C+questions%2C+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Commun+Signal%22%5BJournal%5D)">Review on exosomes application in clinical trials: Perspective, questions, and challenges.</a> Cell Commun Signal. 20 (1), 145(2022).</li>
<li>Aragón, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+urinary+tract+microbiome+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Urol+Focus%22%5BJournal%5D)">The urinary tract microbiome in health and disease.</a> Eur Urol Focus. 4 (1), 128-138 (2018).</li>
</ol>

A.A., G.M. ו-R.R. הם מייסדים, חברי דירקטוריון ובעלי מניות ב-Cellbox Labs, LLC

המכשיר המיקרופלואידי המוצג מציע שיטה מבטיחה לבידוד וחילוץ של כלי רכב חשמליים מנוזלים ביולוגיים, תוך מתן מענה לחלק מהמגבלות הקריטיות של שיטות תקן הזהב הקיימות כגון UC ו- SEC12. UC ו-SEC ידועות כעתירות עבודה, גוזלות זמן רב וסובלות מתשואה נמוכה, מה שהופך אותן לפחות מתאימות ליישומים בעלי תפוקה גבוהה שבהם נדרשות כמויות גדולות של כלי רכב חשמליים 21,22. לעומת זאת, המכשיר המיקרופלואידי המתואר יכול לעבד ברציפות נפח משמעותי של עד 20 מ"ל של נוזל ביולוגי עם קלט משתמש מינימלי, מה שהופך אותו למשנה משחק פוטנציאלי עבור סביבות תעשייתיות או קליניות. אחד היתרונות העיקריים של התקן מיקרופלואידי זה הוא יכולתו לתקנן את בידוד הרכב החשמלי ולשפר את יכולת השחזור בהשוואה לשיטות מסורתיות הכוללות שלבים ידניים. על ידי הפחתת השונות של ייצור מכשירי בידוד EV באמצעות ייצור המוני, ביצועי המכשיר יכולים להיות מבוקרים ועקביים טוב יותר, דבר חיוני עבור יישומים כמו טיפולים ואבחון מבוססי EV. יתר על כן, תאימות המכשיר לייצור בכמויות גדולות באמצעות הזרקת תגובה של מצעים מתאימים משפרת עוד יותר את הפוטנציאל שלו למדרגיות ולאימוץ רחב יותר.
כדי להבטיח יכולת שחזור וביצועים עקביים, יש צורך בפרוטוקול נרחב ומוגדר היטב, הן לייצור השבב והן לשימוש בו בניסויים. השבב תוכנן תוך התחשבות בתיעוש. עם זאת, במהלך ייצור המכשיר בסביבת המעבדה, יש לשים לב למניעת היווצרות בועות, הבטחת הדבקה מדויקת וחזקה, וביצוע בדיקות יסודיות במהירויות זרימה גבוהות יותר מאלה הצפויות בניסויים אמיתיים. אמצעי זהירות זה חשוב במיוחד עבור מכשירי COC-OSTE, מכיוון שהם עלולים להיות מועדים לדליפה עקב הדבקה לא מוצלחת, במיוחד בקצבי זרימה גבוהים יותר. בנוסף, מכיוון ש-OSTE הוא חומר רגיש לאור, יש לבצע את ייצור המכשיר באור צהוב כדי למנוע חשיפה מיותרת לקרינת UV. מכיוון שטכנולוגיה זו עדיין נמצאת בשלביה הראשונים, החוקרים צריכים להתנסות במהירויות זרימה שונות כדי לזהות את ההגדרה האופטימלית ליישום הספציפי שלהם, מכיוון שפרוטוקולים סטנדרטיים לשיטה חדשנית זו טרם נקבעו, וצמיגות נוזלים יכולה להשפיע בבירור על יעילות בידוד הרכב החשמלי בהתבסס על התוצאות שלנו. על ידי ביצוע הנחיות אלה והתמודדות עם אתגרי התקינה, הפוטנציאל של התקן מיקרופלואידי זה לבידוד EV יכול להתממש במלואו בתחומי מחקר ויישומים שונים.
שיטת בידוד הרכב החשמלי באמצעות המכשיר המיקרופלואידי מאפשרת שינויים נרחבים ופתרון בעיות כדי לייעל את הביצועים. כדי לשפר את הפרדת החלקיקים, חוקרים יכולים לחקור ערוצים ארוכים יותר, נקבוביות קרום שונות וצפיפויות נקבוביות, וממדים משתנים. אם יש הרבה חלקיקים גדולים בשקע החלקיקים הקטנים, בדיקת מהירות כניסת חיץ גבוהה יותר יכולה להועיל, ואילו אם יש הרבה חלקיקים קטנים בשקע החלקיקים הגדולים, מומלץ להתנסות בתעלה ארוכה יותר או בקרום עם נקבוביות גדולות יותר. טיפול בספיגת חלקיקים יכול להיות כרוך בהתאמת מהירויות זרימה, שינויים בפני השטח והרכב OSTE או שינוי זמן החשיפה לקרינת UV. עבור מכשירים שחווים חוסר יציבות ודליפה, הפחתת מהירויות הזרימה והקפדה על הדבקה נכונה הם צעדים חיוניים. כדי למזער את נזקי הרכב החשמלי, חוקרים יכולים להפחית את מהירויות הזרימה, לשטוף עם PBS ביסודיות רבה יותר לאחר עיקור המכשיר, ולשקול שימוש בנקבוביות קטנות יותר של הממברנה או בטכניקות וחומרים חלופיים לעיצוב עובש. באמצעות התאמות אלה, ניתן לכוונן את המכשיר המיקרופלואידי ולשחרר את הפוטנציאל שלו ליישומים מגוונים במחקר רכב חשמלי ובתחומים קשורים. בנוסף, כדי לייעל את ביצועי המכשיר, ניתן לשלב אפיון דגימה במעלה הזרם, כולל מדידות צפיפות וצמיגות, כדי להתאים את פרמטרי הזרימה. יתר על כן, יש לשים דגש מיוחד על אופי המדגם, בהתחשב באי-סטריליות המבוססת של נוזלים ביולוגיים23. כתוצאה מכך, יש לשקול כראוי את עיקור הדגימות לפני מתן שלהן ביישומים קליניים.
למרות אתגרים אלה, המכשיר המיקרופלואידי טומן בחובו פוטנציאל עצום בתחומי מחקר שונים. יכולתה לבודד באופן רציף כלי רכב חשמליים מכמויות גדולות של דגימות הטרוגניות מאוד פותחת את הדלת לאוטומציה, מאפשרת יישומים בעלי תפוקה גבוהה ומאפשרת ניתוח מעמיק יותר של כלי רכב חשמליים ממקורות מגוונים. שילוב מודול מיקרופלואידי זה בהתקנים שונים, כגון מחסניות ביוריאקטור חלולות של תאי סיבים או ציטומטרים של זרימה ברזולוציה גבוהה, יכול להפוך יישומי רכב חשמלי לידידותיים יותר לתעשייה ולהניע חדשנות בתחומים כמו אספקת תרופות, אבחון וקוסמטיקה4. בסך הכל, התקן מיקרופלואידי זה מהווה צעד משמעותי קדימה בתחום המחקר של רכב חשמלי, ומציע שיטה יעילה וסטנדרטית לבידוד רכב חשמלי עם יישומים מבטיחים במגוון רחב של מחקרים בסביבות תעשייתיות.

שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) הן חלקיקים הקשורים לקרום התא הכוללים שני סוגים עיקריים: אקסוזומים (30-200 ננומטר) ומיקרו-שלפוחיות (200-1000 ננומטר)1. אקסוזומים נוצרים באמצעות ניצנים פנימיים של הממברנה האנדוזומלית בתוך גוף רב-שלפוחית (MVB), ומשחררים שלפוחיות תוך-לומינליות (ILVs) לתוך החלל החוץ תאי באיחוי עם קרום פלזמה1. לעומת זאת, מיקרובועיות נוצרות על ידי ניצנים חיצוניים וביקוע של קרום התא2. כלי רכב חשמליים ממלאים תפקיד מכריע בתקשורת בין-תאית על ידי הובלת חלבונים, חומצות גרעין, שומנים ומטבוליטים, המשקפים את המצב הפיזיולוגי של התא, כולל גדילה, אנגיוגנזה, גרורות, שגשוג ועמידות לטיפול3. כתוצאה מכך, הם התגלו כסמנים ביולוגיים מבטיחים וכמטרות טיפוליות למחלות, כולל סרטן, תוך הדגשת הפוטנציאל שלהם במערכות אבחון ואספקת תרופות4.
כדי לנצל באופן מלא את כלי הרכב החשמליים באבחון מחלות וטיפולים, בידוד יעיל מנוזלים ביולוגיים שונים הוא חיוני5. שיטות נפוצות כוללות אולטרה-צנטריפוגה (UC), צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות, כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל (SEC), סינון ובידוד חיסוני6. UC היא טכניקה נפוצה אך עשויה להניב חלקיקים בעלי צפיפות דומה שאינם EVs ויכולה ליצור אגרגטים של EV7. SEC צברה פופולריות בשל יכולתה לספק דגימות טוהר גבוהות יותר על ידי אי הכללת חלקיקים על בסיס גודל ולא צפיפות8. עם זאת, בחירה זהירה של גודל הנקבוביות המתאים לעמודת SEC ואופטימיזציה של תנאי הכרומטוגרפיה חיוניים כדי למזער בידוד משותף של חלקיקים לא רצויים כמו כילומיקרונים וליפופרוטאינים בצפיפות נמוכה8. למרות יעילותן, שתי השיטות גוזלות זמן רב ומאתגרות לאוטומציה, במיוחד עבור דגימות בנפח גדול יותר כמו מדיה סלולרית או שתן, מה שמגביל את יכולת ההרחבה שלהן עבור יישומים תעשייתיים9.
בשנים האחרונות, שבר שדה זרימת שדה אסימטרי (A4F) התפתח כטכניקת הפרדה רבת עוצמה עבור גודל וציפה מבוססת מיקרו וציפה חלקיקים בגודל מיקרו וננומטר10. עקרון הפעולה של A4F מסתמך על תעלה מיקרופלואידית בעלת קרום נקבובי בבסיסה, המייצרת כוח המופעל כלפי הממברנה הנקרא זרימה צולבת10. בשילוב עם תנועה בראונית וזרימת פואזיל הטבועה במערכת, זרימה צולבת מאפשרת הפרדת חלקיקים יעילה עקב מיקום חלקיקים משתנה בתוך דינמיקת הזרימה11. למרות היתרונות, שיטה זו מוגבלת לנפחי דגימה בטווח המיקרוליטר12 ודורשת שלב מיקוד נוסף, המאריך את משך התהליך10.
במהלך העשור האחרון, מיקרופלואידיקה צברה בולטות ככלי להפרדה מהירה, יעילה ואמינה קלינית של EV13. עם זאת, רוב השיטות המיקרופלואידיות המתוכננות להפרדת EV ממוטבות עבור דגימות EV בנפח קטן ובריכוז גבוה או תלויות בהליכי הפרדה מורכבים14. יתר על כן, בתחום המיקרופלואידיקה, פולידימתילסילוקסאן (PDMS) מוכר כחומר תקן הזהב בשל השקיפות האופטית שלו, תאימות ביולוגית וקלות השימוש15. עם זאת, נטייתו הידועה לספוג מולקולות ליפופיליות קטנות, כולל כלי רכב חשמליים, עלולה להיות בעייתית ליישומו בתחום הרכב החשמלי13.
קופולימר אולפין מחזורי (COC) הוא חומר נפוץ במיקרופלואידיקה עקב תאימות ביולוגית, ספיגה קטנה של מולקולות ועמידות כימית גבוהה15. עם זאת, ייצור של מכשירי COC כרוך לעתים קרובות בתהליכים מורכבים או ציוד מיוחד16. לחלופין, off-stoichiometry thiol-ene (OSTE) הוא חלופה מבטיחה PDMS בשל ספיגה מופחתת של מולקולות קטנות, יציבות כימית מעולה, קלות ייצור, תהליך ייצור מדרגי17,18. עם זאת, בשל חיבורים מורכבים לצנרת, מכשירים עלולים להיות מועדים לדליפה19.
מטרת מחקר זה הייתה להנדס ולייצר מכשיר מיקרופלואידי המשלב OSTE ו-COC ועקרון A4F מפוצל להפרדת EV מדגימות בנפח גדול כגון שתן או מדיה תאית.

<table><tbody><tr><td>0.1 ומיקרו; m קרבוקסילט FluoSpheres</td><td>Invitrogen</td><td>#F8803</td><td>ריכוז מלאי: 3.6 x 1013 חרוזים/מ"ל (תלוי אצווה)</td></tr> <tr><td>0.5 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה</td><td>Starstedt</td><td>72.704</td><td></td></tr><tr><td>1 מ"ל מזרק חרוט Luer לשימוש חד פעמי ללא מחט</td><td>RAYS</td><td>TUB1ML</td><td></td></tr><tr><td>1.0 & micro; m פוליסטירן FluoSpheres</td><td>Invitrogen</td><td>#F13083</td><td>ריכוז מלאי: 1 x 1010 חרוזים/מ"ל (תלוי באצווה )</td></tr><tr><td>10 מ"ל פיפטות סרולוגיות</td><td>Sarstedt</td><td>86.1254.001</td><td></td></tr><tr><td>15 מ"ל (100k) Amicon מסננים אולטרה צנטריפוגליים</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC910024</td><td></td></tr><tr><td>2.0 מ"ל חלבון LoBind צינורות</td><td>Eppendorf</td><td>30108132</td><td></td></tr><tr><td>20 מ"ל BD</td><td>PlastikPak</td><td></td><td></td>10569215</tr><tr><td>250 ומיקרו; m ID polyether ether ketone צינורות</td><td>Darwin Microfluidics</td><td>CIL-1581</td><td></td></tr><tr><td>3 kDa MWCO יחידות סינון צנטריפוגליות</td><td>Merck Millipore,UFC200324</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>5 מ"ל מזרק רפואי ללא מחט</td><td>Anhui Hongyu Wuzhou Medical</td><td>159646</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל צינורות חרוטיים</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>70 Ti רוטור אולטרה-צנטריפוגה בזווית קבועה</td><td>בקמן קולטר</td><td></td><td></td>337922</tr><tr><td>800 ומיקרו; m ID polytetrafluoroethylene צינורות</td><td>Darwin Microfluidics</td><td>LVF-KTU-15</td><td></td></tr><tr><td>96 באר מיקרופלייט, f-bottom, med. מחייב</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655001</td><td>ELISA</td></tr><tr><td>plate B-27 תוסף (50x), ללא סרום</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>בקר סרום אלבומין</td><td>SigmaAldrich</td><td>A7906-100G</td><td></td></tr><tr><td>COC Topas מיקרוסקופיה פלטפורמת</td> <td>שקופיותMicrofluidic Chipshop</td><td>10000002</td><td></td></tr><tr><td>COC Topas מיקרוסקופיה פלטפורמת שקופיות 2 x 16 מיני Luer&nbsp;</td><td>Microfluidic Chipshop</td><td>10000387</td><td></td></tr><tr><td>Elveflow OB1 בקר לחץ</td><td>Elvesys Group</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Luer מחברי</td><td>Darwin Microfluidics</td><td>&nbsp; CS-10000095</td><td></td></tr><tr><td>מיישר מסכות Suss MA/BA6</td><td>SUSS MicroTec Group</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mixer Thinky ARE-250</td><td>Thinky Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoSight NS300</td><td>Malvern Panalytical</td><td>NS300</td><td>מנתח ננו-חלקיקים&nbsp;</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ אופטי Nikon Eclipse LV150N</td><td>Nikon Metrology NV</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OSTE 322 Crystal Clear</td><td>Mercene Labs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS TABLETS.Ca/Mg חינם. פישר ביוריאגנטים. 100 גרם</td><td>קרום פישר סיינטיפיק</td><td>BP2944-100</td><td></td></tr><tr><td>PC (קוטר נקבוביות 50 ננומטר, צפיפות של 11.8%)</td> <td>it4ip SA, Louvain-La Neuve, בלגיה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>צלחות פטרי, סטרילי</td><td>Sarstedt</td><td>82.1472.001</td><td></td></tr><tr><td>פלזמה אשר GIGAbatch 360 M</td><td>PVA TePla America, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>qEVoriginal/35 ננומטר עמודה</td><td>Izon</td><td>SP5</td><td>SEC</td></tr><tr><td>ערכת אלסטומר סיליקון QSIL 216</td><td>PP& S</td><td></td><td></td></tr><tr><td>שרף קשוח</td><td>שחור Zortrax</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SW40 Ti נדנדה רוטור אולטרה-צנטריפוגה</td><td>בקמן קולטר</td><td>331301</td><td></td></tr><tr><td>משאבת מזרק</td><td>DK Infusetek</td><td>ISPLab002</td><td></td></tr><tr><td>T175 בקבוק השעיה</td><td>Sarstedt</td><td>83.3912.502</td><td></td></tr><tr><td>חלבון TIM4-Fc</td><td>Adipogen LifeSciences</td><td>AG-40B-0180B-3010</td><td></td></tr><tr><td>TMB (3,3',5,5'-טטרמתילבנזידין)</td><td>SigmaAldrich</td><td>T0440-100ML</td><td>מצע פרוקסידאז חזרת</td></tr><tr><td>Tween20</td><td>SigmaAldrich</td><td>P1379-100ML</td><td></td></tr><tr><td>אולטרה-צנטריפוגה אופטימה L100XP</td><td>בקמן קולטר</td><td></td><td></td></tr><tr><td>יחידת ניקוי אולטרסאונד P 60 H</td><td>Elma Schmidbauer GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטר</td> <td>מיקרופלייט אוניברסלימכשירי Bio-Tek</td><td>71777-1</td><td></td></tr><tr><td>כוס איסוף שתן, 150 מ"ל,</td><td>APTACA סטרילי</td><td>2120_SG</td><td></td></tr><tr><td>מסנן מזרק Whatman Anotop 25</td><td>SigmaAldrich</td><td>68092002</td><td></td></tr><tr><td>Zetasizer Nano ZS</td><td>Malvern מערכת פיזור אור דינמי אנליטי</td><td></td><td>(DLS)&nbsp;</td></tr><tr><td>Zortrax Inkspire</td><td>Zortrax</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

בידוד חד-שלבי של בועיות חוץ-תאיות מדגימות בנפח גדול באמצעות התקן מיקרופלואידי a4f מפוצל

Single Step Isolation of Extracellular Vesicles from Large-Volume Samples with a Bifurcated A4F Microfluidic Device

שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) טומנות בחובן פוטנציאל עצום ליישומים ביו-רפואיים שונים, כולל אבחון, אספקת תרופות ורפואה רגנרטיבית. עם זאת, המתודולוגיות הנוכחיות לבידוד כלי רכב חשמליים מציבות אתגרים משמעותיים, כגון מורכבות, צריכת זמן והצורך בציוד מגושם, המעכב את תרגומם הקליני. כדי להתמודד עם מגבלות אלה, שאפנו לפתח מערכת מיקרופלואידית חדשנית המבוססת על קופולימר או-סטויכיומטריה מחזורי של אולפין תיול-אן (COC-OSTE) לבידוד יעיל של כלי רכב חשמליים מדגימות בנפח גדול באופן רציף. על ידי ניצול הפרדה מבוססת גודל וציפה, הטכנולוגיה ששימשה במחקר זה השיגה התפלגות גודל צרה משמעותית בהשוואה לגישות קיימות מדגימות שתן ומדיה תאית, ואפשרה מיקוד של שברים ספציפיים בגודל EV ביישומים עתידיים. תכנון ההתקן המיקרופלואידי החדשני COC-OSTE שלנו, המשתמש בטכנולוגיית שבר זרימת שדה זרימה אסימטרית מפוצלת, מציע גישה פשוטה ורציפה לבידוד EV עבור דגימות בנפח גדול. יתר על כן, הפוטנציאל לייצור המוני של התקן מיקרופלואידי זה מציע מדרגיות ועקביות, מה שהופך את שילוב בידוד הרכב החשמלי לאפשרי באבחון קליני שגרתי ובתהליכים תעשייתיים, שבהם עקביות ותפוקה גבוהות הן דרישות חיוניות.

יצרנו מכשיר מיקרופלואידי באמצעות תבנית שלילית כפולה מודפסת בתלת-ממד (איור 1) באמצעות ליתוגרפיה רכה (איור 2A) להפרדת EV בתפוקה גבוהה בהתבסס על עקרון A4F המפוצל (איור 2B,C). ההתקנה דורשת משאבה ותחנת זרימה, כפי שניתן לראות באיור 3, לבידוד אוטומטי של כלי רכב חשמליים. ראשית, כדי להעריך את הוכחת ההיתכנות של המכשירים, תערובת של חרוזי פוליסטירן בקטרים של 100 ננומטר ו -1000 ננומטר הוכנה כדי לייצג שלפוחיות ופסולת תאים עדינה, בהתאמה10. נערכו ניסויים עם קצבי זרימה משתנים עבור תערובת החרוזים, עם ובלי זרימה מפוצלת, כדי לחקור את ההשפעה של מהירות ליניארית על יעילות ההפרדה. בכל הניסויים, ההתאוששות של חרוזים קטנים נותרה עקבית ומעל 90%10, מה שמראה את הפוטנציאל של המכשיר לשחזר כלי רכב חשמליים.
לאחר מכן, הערכנו והשווינו את הפוטנציאל של מכשיר COC-OSTE בבידוד כלי רכב חשמליים מנפחים גדולים (&gt;1 מ"ל) מנוזלים ביולוגיים מורכבים עם עיבוד מקדים מינימלי. לכן, שתן מ-10 תורמים בריאים (איור 4) ומדיה תאית משני קווי תאי ערמונית שונים (איור 5) שימשו כתבנית לבידוד סימולטני של כלי רכב חשמליים בעקבות שלושה הליכים שונים: אולטרה-צנטריפוגה (UC), כרומטוגרפיה של אי-הכללת גודל (SEC) והתקן OSTE-COC מבוסס מיקרופלואידיקה A4F. לאחר הבידוד, המספר הכולל של חלקיקים והתפלגות גודלם הוערכו באמצעות ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים (NTA). בממוצע, התקן OSTE-COC הראה התאוששות חלקיקית כוללת טובה יותר מנוזלים ביולוגיים בהשוואה ל-UC, אולם המובהקות הסטטיסטית הושגה רק כאשר משלבים את מספרי החלקיקים משתי היציאות (איור 4A). על מנת להשוות את ביצועי המכשיר עם מערכות אחרות, יש לקחת בחשבון את שקע R &amp; L יחד. כפי שניתן לראות באיור 4, הביצועים של יציאות L ו-R יחד בשחזור כלי רכב חשמליים עולים על הביצועים של UC ו-SEC. בנפרד, יציאת ה-L תוכננה ללכוד את החלק הקטן של הרכב החשמלי, בעוד שיציאת ה-R תוכננה לאסוף את החלק הגדול יותר של הרכב החשמלי עם מולקולות אחרות בגודל דומה. באופן מעניין, ההתאוששות באמצעות R-PORT של התקן OSTE-COC הייתה מעט גבוהה יותר מאשר SEC ו-UC בלבד (איור 4A). ביטוי CD63 הראה דפוס דומה (איור 4C). ממצא זה מצביע על כך שמכשיר OSTE-COC היה יעיל יותר בשחזור כולל של רכב חשמלי. התפלגות גודל שווה נמצאה בין המתודולוגיות השונות, למעט UC, שמראה התפלגות גודל חלקיקים גדולה יותר (איור 4B).
תוצאות דומות נצפו בתרביות מדיה תאית. בשני התרחישים, שחזור החלקיקים הכולל משתי יציאות ההתקן הציג ביצועים טובים יותר בהשוואה למתודולוגיות SEC או UC (כמתואר באיור 5A,B). יש לציין כי כלי רכב חשמליים שמקורם בתאי PC3 הדגימו התפלגות גודל מובחנת, עם הומוגניות גדולה יותר בהתפלגות L-PORT בהשוואה לקבוצות ניסוי אחרות (איור 5C,D). יתר על כן, ניתוח ביטוי CD63 אישר את שיעורי ההתאוששות הגבוהים יותר של EV שהושגו באמצעות מכשיר COC-OSTE (כפי שמודגם באיור 5E,F). סיכום המשווה בין מאפייני הבידוד של המתודולוגיות השונות שנבחנו במחקר זה ניתן למצוא בטבלה 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66019/66019fig01.jpg"> איור 1: מידות תבנית שלילית כפולה בצורת סרפנטין 3DP ותצוגה איזומטרית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66019/66019fig01large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66019/66019fig02.jpg"> איור 2: התקן מיקרופלואידי COC-OSTE. (A) סכימה של השלבים העיקריים השונים של ייצור התקן OSTE-COC. (B) עקרון העבודה של המכשיר. (C) תמונה של ההתקן המוגמר. סרגל קנה מידה: 15 מ"מ. נתון זה שונה באישור Priedols et al.10 ו- Bajo-Santos et al.20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66019/66019fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66019/66019fig03.jpg"> איור 3: תצורה ניסיונית של המכשיר. משאבת המזרק נמצאת בצד שמאל, מכשיר OSTE-COC נמצא באמצע, ותחנת השחזור נמצאת בצד ימין. נתון זה שונה באישור Priedols et al.10 ו- Bajo-Santos et al.20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66019/66019fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66019/66019fig04.jpg"> איור 4: התפלגות גודל רכב חשמלי בשתן ושחזור חלקיקים מ-10 תורמים באמצעות אולטרה-צנטריפוגה (UC), כרומטוגרפיה של אי-הכללת גודל (SEC) ומכשיר COC-OSTE. (A) כמות החלקיקים המוחזרת מכל שיטת בידוד באמצעות ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים (NTA). הנתונים מיוצגים כממוצע +/- סטיית תקן. מובהקות סטטיסטית המסומנת ב- * (עמ&lt;0.05). (B) קופסאות מציגות את התפלגות גודל החלקיקים הממוצעת בין כל דגימות השתן שנבדקו על ידי נת"ע, כאשר השפם מציין את ערכי המינימום והמקסימום. ערכי P נגזרו מהשוואות ל-UC, כאשר **** מציין מובהקות סטטיסטית גבוהה (p&lt;0.0001). (C) החציון והטווח של כמות CD63 הממוצעת, שהוערכו באמצעות בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזים כפול סנדוויץ' (dsELISA), עבור כל שיטת בידוד, חושבו בכל הדגימות. L-יציאה: יציאה שמאלית; יציאת R: יציאה ימנית. נתון זה שונה באישור Bajo-Santos et al.20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66019/66019fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66019/66019fig05.jpg"> איור 5: אפיון כלי רכב חשמליים שבודדו מתאי PC3 ו-LNCaP בשיטות שונות. (A) כמות החלקיקים המשוחזרת ממדיית PC3 באמצעות ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים (NTA) המיוצג על ידי ממוצע +/- סטיית תקן. (B) כמות החלקיקים המשוחזרת ממדיה סלולרית LNCaP באמצעות NTA המיוצגת כממוצע +/- סטיית תקן. (C) התפלגות גודל החלקיקים החציונית של כלי רכב חשמליים מתבירות PC3, יחד עם הטווח, נקבעה על ידי נת"ע. (D) התפלגות הגודל החציונית של כלי רכב חשמליים שבודדו מתרביות LNCaP עם טווח. (E) חציון וטווח ביטוי CD63 עבור כל שיטת בידוד עבור EV הנגזר מקו תאי PC3, באמצעות בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזים כפול סנדוויץ' (dsELISA). (F) חציון וטווח של ביטוי EV CD63 הנגזר מ-LNCaP על ידי dsELISA עבור כל שיטת בידוד. UC: Ultracentrifugation; SEC: כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל; L-יציאה: יציאה שמאלית; יציאת R: יציאה ימנית. נתון זה שונה באישור Bajo-Santos et al.20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66019/66019fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>UC</td>
			<td>שניה</td>
			<td>COC-OSTE</td>
		</tr><tr><td>זמן עיבוד/מדגם</td>
			<td>++/+++</td>
			<td>+++</td>
			<td>+</td>
		</tr><tr><td>תפוקת</td>
			<td>++</td>
			<td>+</td>
			<td>+++</td>
		</tr><tr><td>עלות/מדגם</td>
			<td>+</td>
			<td>+++</td>
			<td>++</td>
		</tr><tr><td>טוהר</td>
			<td>+</td>
			<td>+++</td>
			<td>++</td>
		</tr><tr><td>אוטומציה</td>
			<td>++</td>
			<td>+</td>
			<td>+++</td>
		</tr><tr><td>תפוקת EV</td>
			<td>++</td>
			<td>++</td>
			<td>+++</td>
		</tr><tr><td>בחירת גודל</td>
			<td>+</td>
			<td>++</td>
			<td>++</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 1. השוואה של מאפייני בידוד של כלי רכב חשמליים עם שלוש השיטות: UC SEC ומכשיר COC-OSTE. UC: Ultracentrifugation; SEC: כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל. COC-OSTE: קופולימר אולפין מחזורי-אוף-סטויכיומטריה תיול-אן. +: נמוך; ++: בינוני; +++: גבוה. * תלוי במכשיר.

שלפוחיות חוץ-תאיות טומנות בחובן הבטחה עצומה ליישומים ביו-רפואיים, אך שיטות הבידוד הנוכחיות גוזלות זמן רב ואינן מעשיות לשימוש קליני. במחקר זה אנו מציגים מכשיר מיקרופלואידי המאפשר בידוד ישיר של בועיות חוץ-תאיות מכמויות גדולות של נוזלים ביולוגיים באופן רציף ובמינימום צעדים.

בידוד חד-שלבי של בועיות חוץ-תאיות מדגימות בנפח גדול באמצעות התקן מיקרופלואידי A4F מפוצל

Extracellular vesicles (EVs) hold immense potential for various biomedical applications, including diagnostics, drug delivery, and regenerative medicine. ...

אנו רואים את הפוטנציאל של שלפוחיות חוץ-תאיות, אך גם מכירים בקושי בבידודן, במיוחד מדגימות גדולות של נוזלים ביולוגיים כגון מדיה ביוריאקטורים. במחקר זה בדקנו אם אנו יכולים להשתמש במקטע זרימת שדה זרימה אסימטרי כדי לבודד בועיות חוץ-תאיות. נכון לעכשיו, בידוד שלפוחיות חוץ-תאיות ישירות מנוזלים ביולוגיים בזרימה רציפה לצורך השתלבות בביוריאקטורים אינו אפשרי.במקום זאת, יש לאסוף ולעבד תחילה נוזלים ביולוגיים, ולהוסיף שונות ועבודה. המכשיר שלנו המיועד לבידוד שלפוחית חוץ-תאית מנוזלים ביולוגיים בנפח גדול מאפשר אינטגרציה עם ביוריאקטורים לזרימה רציפה ואוטומציה. מצאנו כי צמיגות נוזלית עשויה להשפיע על בידוד שלפוחיות חוץ-תאיות באמצעות שבירת זרימת שדה אסימטרית.אנו בודקים אם התאמת נוזל ביולוגי וזרמי חיץ לצמיגות יכולה לשפר את הבידוד.

single-step-isolation-extracellular-vesicles-from-large-volume

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

מקור: ווטסון, די.סי., et.al. בידוד וטיהור ניתנים להרחבה של שלפוחיות חוץ-תאיות מ-Escherichia coli וחיידקים אחרים. J. Vis. Exp. (2021)סרטון זה מדגים את הבידוד והריכוז של שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) שמקורן בקרום החיצוני של חיידקים מהונדסים גנטית. התהליך כולל גידול החיידקים לשחרור EVs, ואחריו צנטריפוגה עוקבת ושלבי סינון להסרת תאים ופסולת. לבסוף, אולטרה-סינון משמש לריכוז הרכבים החשמליים לניתוח במורד הזרם.

בידוד והעשרה של שלפוחיות חוץ-תאיות שמקורן בקרום החיצוני מחיידקים

מקור: ווטסון, די.סי., ואחרים. בידוד וטיהור ניתנים להרחבה של שלפוחיות חוץ-תאיות מ-Escherichia coli וחיידקים אחרים. J. Vis. Exp. (2021)סרטון זה מדגים את השימוש בכרומטוגרפיה של אי הכללת גודל עם חרוזי שרף נקבוביים כדי לבודד שלפוחיות חיידקים חוץ-תאיות (EVs) מתסנין תרבית חיידקים. EVs גדולים יותר נפלטים מוקדם על ידי עקיפת נקבוביות השרף, בעוד שחלבונים קטנים יותר נכנסים לנקבוביות ונפלטים מאוחר יותר.

בידוד שלפוחיות חיידקיות חוץ-תאיות באמצעות כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל 

פרוטוקול זה מפרט שיטה לבודד שלפוחית ​​תאית (EVS), חלקיקים קרומיים קטנים שוחררו מהתאים, מ קטן כמו 10 דגימות סרום μl. גישה זו עוקפת את הצורך בultracentrifugation, דורשת רק כמה דקות של זמן assay, ומאפשרת בידוד של כלי רכב חשמלי מדגימות של כרכים מוגבלים.

מכשירים מבוססי נייר לבידוד ואפיון של תאית שלפוחית

פרוטוקול זה מתאר ארכיטקטורת מערכת לביצוע הפרדות חלקיקים אוטומטיות בנפח קטן (0.15-1.5 מ"ל) באמצעות מכשיר מיקרופלואידי, ודן בשיטות לייעול הביצועים והתפעול של מכשיר אקוסטופלואידי.

פלטפורמת microfluidic לעיבוד מדגם Precision הקטן-נפח ושימוש בו לגודל חלקיקים הביולוגיים נפרדים עם Microdevice אקוסטי

כאן, אנו מתארים שני שלפוחית חוץ-תאית בידוד םילוקוטורפ אולטראפילטרציה צנטריפוגה, ultracentrifugation עם צפיפות צנטריפוגה הדרגתיות, לבודד שלפוחית חוץ-תאית מדגימות נוזלים שטיפה bronchoalveolar מאתר. השלפוחיות המוגלתיות חוץ-תאית נגזר נוזל שטיפת מאתר bronchoalveolar על ידי שתי השיטות לכמת, מאופיין.

בידוד של שלפוחית חוץ-תאי של נוזל שטיפה Bronchoalveolar מאתר באמצעות טכניקת צנטריפוגה אולטראפילטרציה

כאן אנו מציגים פרוטוקול החלים בקלות כדי להעריך את יציבות האחסון של שלפוחיות ומסחטות, קבוצה של חלקיקים המתרחשים באופן טבעי המיוצר על ידי תאים. שלפוחיות הם טעונים עם glucuronidase כאנזים מודל מאוחסן בתנאים שונים. לאחר האחסון, הפרמטרים הפיזיקליים שלהם והפעילות של האנזים שעברו האנקפסולציה מוערכים.

הערכת יציבות האחסון של שלפוחיות ומסחטות

פרוטוקול זה מבודד ושלפוחיות שלפוחית (EVs) הרחק מריטונים עם יעילות גבוהה ותשואה על ידי שילוב משקעים EV, צפיפות הדרגתי מעבר הצבע, ולכידת חלקיקים כדי לאפשר זרימת עבודה יעילה והפחתה של התחלת דרישות נפח, וכתוצאה מכך ההכנות לשימוש בכל מחקר EV.

טיהור של תשואה גבוהה לחילוץ ההכנות הרחק וירוס

חיידקים מפרישים שלפוחיות חוץ-תאיות בגודל ננומטר (EVs) הנושאות מולקולות ביולוגיות ביו-אקטיביות. מחקר EV מתמקד בהבנת הביוגנזה שלהם, תפקידם באינטראקציות ובמחלות בין מיקרובים למיקרובים ולמיקרובים מארחים, כמו גם ביישומים הטיפוליים הפוטנציאליים שלהם. זרימת עבודה לבידוד מדרגי של כלי רכב חשמליים מחיידקים שונים מוצגת כדי להקל על סטנדרטיזציה של מחקר EV.

בידוד וטיהור מדרגיים של שלפוחיות חוץ-תאיות מ-Escherichia coli וחיידקים אחרים

הפרוטוקול הנוכחי מספק תיאורים מדוקדקים לבידוד, ריכוז ואפיון של שלפוחיות חוץ-תאיות מתרביות ציאנובקטריאליות. כמו כן נדונו גישות לטיהור בועיות מתרבויות בקני מידה שונים, פשרות בין מתודולוגיות ושיקולים לעבודה עם דוגמאות שטח.

בידוד ואפיון של שלפוחיות חוץ-תאיות ציאנובקטריאליות

פרוטוקול זה מדגים כיצד לבודד שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות של תאי גזע מזנכימליים שמקורם בחבל הטבור האנושי (hUC-MSC-sEVs) באמצעות הגדרה פשוטה בקנה מידה של מעבדה. התפלגות הגודל, ריכוז החלבונים, סמני sEVs והמורפולוגיה של hUC-MSC-sEV מבודדים מאופיינים בניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים, בדיקת חלבון BCA, כתם מערבי ומיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת, בהתאמה.

שיטת סינון פשוטה לבידוד בועיות חוץ-תאיות קטנות מתאי גזע מזנכימליים אנושיים

פרוטוקול זה מספק שיטת בידוד מהירה וספציפית לגודל עבור בועיות חוץ-תאיות קטנות על ידי מיטוב גודל פיית ריסוס האוויר, לחץ נוזל הנדן, לחץ זרימת הדגימה, מתח, רווח ופרמטרי סף הפעלה.

אופטימיזציה של פרמטרים למיון ציטומטרי של זרימה לבידוד וטיהור של בועיות חוץ-תאיות קטנות בתפוקה גבוהה

למד בידוד בועיות חוץ-תאיות מדגימות בנפח גדול באמצעות התקן מיקרופלואידי A4F מפוצל. שיטה זו מאפשרת זרימה רציפה ואוטומציה לשימושים ביורפואיים קליניים.

בידוד חד-שלבי של בועיות חוץ-תאיות מדגימות בנפח גדול באמצעות התקן מיקרופלואידי A4F מפוצל

גלה סרטונים נוספים