Name: שימוש בהדמיה חיה של Ex Vivo כדי לחקור חלוקות תאים ותנועות במהלך חידוש שיניים של עכבר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-27T14:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: חקור הדמיה חיה ex vivo של תאים אפיתליים בשיני עכברים בוגרים באמצעות מיקרוסקופיית שני פוטונים. שיטה זו מאפשרת מעקב אחר תנועות תאים דינמיות ותרומה להבנת חידוש רקמות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים למעבדה המתקדמת למיקרוסקופיית אור/ספקטרוסקופיה של UCLA ולמרכז המצוינות של Leica Microsystems במכון הננו-מערכות של קליפורניה (RRID:SCR_022789) על אספקת מיקרוסקופ שני פוטונים. AS נתמך על ידי ISF 604-21 מהקרן הלאומית למדע. JH נתמך על ידי R03DE030205 R01DE030471 מה-NIH/NIDCR. AS ו-JH נתמכו גם על ידי 2021007 מענקים מהקרן הדו-לאומית למדע ארה"ב-ישראל (BSF).

כל העכברים הוחזקו במתקנים נטולי פתוגנים של בעלי חיים באוניברסיטת קליפורניה בלוס אנג'לס (UCLA) או באוניברסיטה העברית בירושלים (HUJI). כל הניסויים בעכברים בוצעו בהתאם לתקנות ולפרוטוקולים שאושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) (ARC-2019-013; UCLA) או (MD-23-17184-3; הוג'י). זרימת עבודה כללית של שלבי הניסוי מוצגת באיור 2A. עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים הקשורים לכל המכשירים, הריאגנטים והחומרים המשמשים בפרוטוקול זה.
1. הכנת פתרונות וג'לים
<ol><li>אמצעי דיסקציה: הכינו DMEM/F12 טרי עם 0.5% גלוקוז ושמרו אותו חם בטמפרטורה של 37°C עד לצורך בשלב 2.4. הערה: אנו משתמשים ב-DMEM/F12 ללא פנול אדום כדי להפחית את הפלואורסצנטיות העצמית במהלך הדמיה חיה.</li>
	<li>1x מדיום תרבית: הכינו מדיום טרי באמצעות 50% DMEM/F12, 50% סרום חולדות, 1x תחליף גלוטמין, 1x MEM חומצות אמינו לא חיוניות, 1% גלוקוז, 0.1 מ"ג/מ"ל חומצה L-אסקורבית, ו-0.5% פניצילין-סטרפטומיצין. שמור אותו חם ב 37 ° C עד הצורך בשלב 5.5. מדיום זה משמש לגידול צמחים חותכים במהלך הדמיה חיה. הערה: סרום החולדות צריך להיות באיכות גבוהה ומוכן במיוחד לגידול רקמות שלמות על ידי חוקרים או ממקור מסחרי. בפרט, הדם חייב להיות צנטריפוגה (במשך 5 דקות ב 1,200 × גרם בטמפרטורת החדר) לפני קרישה מתחיל להיווצר. לאחר צנטריפוגה, קריש הפיברין שנוצר צריך להיות סחוט ולהשליך33.</li>
	<li>ג'ל תרבית: מטרת הג'ל היא לשתק דגימות במהלך ההדמיה והוא מוכן טרי.<ol><li>הכינו 2% ג'ל ב-DMEM/F12 על ידי המסת אגרוז ב-200 מ"ג של אגרוז ב-10 מ"ל DMEM/F12 באמצעות מיקרוגל. יש לשמור את הג'ל 2% על 37°C.</li>
		<li>הפוך 2x תרבית בינונית (ללא DMEM/F12) על ידי ערבוב 50% סרום חולדה, 1x תחליף גלוטמין, 1x MEM חומצות אמינו לא חיוניות, 1% גלוקוז, 0.1 מ"ג / מ"ל חומצה L-אסקורבית, ו 0.5% פניצילין-סטרפטומיצין. חממו את מדיום התרבית פי 2 (ללא DMEM/F12) ל-37°C.</li>
		<li>הכינו ג'ל תרבית 1% על ידי ערבוב נפחים שווים של 2% ג'ל ו-2x מדיום תרבית (ללא DMEM/F12). שמור את ג'ל התרבית 1% על 37 ° C עד הצורך בשלב 5.1. הערה: יש לוודא שכל התמיסות חמות לפני הערבוב כדי למנוע ג'ל. מצאנו שג'ל 1% מתאים לגידול חותך עכבר בוגר. אחוז הג'ל צריך להיקבע אמפירית אם רקמות אחרות צריכות להיות בתרבית.</li>
	</ol></li>
</ol>2. חילוץ הלסת התחתונה של העכבר הבוגר
<ol><li>יש להרדים עכברים בגיל הרצוי באמצעות הליכים סטנדרטיים שאושרו על ידי IACUC. הערה: כאן אנו משתמשים בחנק CO2 ואחריו פריקת צוואר הרחם. התקנות להמתת חסד של בעלי חיים עשויות להשתנות באזורים שונים. על החוקרים לקבל את האישור המוסדי הדרוש לפני ביצוע ניסויים ולהבטיח עמידה בתקנות הטיפול המקומיות בבעלי חיים.</li>
	<li>יש לחטא את העכבר באמצעות אתנול 70%.</li>
	<li>ערפו את ראשו של העכבר וחלצו את הלסת השמאלית והימנית.<ol><li>הנח את העכבר על בטנו, ולאחר מכן השתמש בסכין גילוח תעשייתית בעלת קצה יחיד #9 כדי לחתוך באזור הצוואר ולהפריד את ראש העכבר משאר הגוף. הערה: אם יש לאסוף גם רקמות מאזור הלוע או הצוואר, אין לבצע עריפת ראש, וניתן להמשיך ישירות לשלב 2.3.2.</li>
		<li>הפוך את העכבר כך שהצד הגחוני שלו פונה כלפי מעלה והלסת התחתונה תהיה נגישה בקלות.</li>
		<li>אבטחו את ראשו של בעל החיים על ידי החזקתו בעדינות בין האגודל לאצבע המורה.</li>
		<li>השתמש בסכין הגילוח כדי לבצע חתך באמצע הקשת שחותך את עור הלסת התחתונה מהשפה התחתונה לכיוון הצוואר. הערה: להב כירורגי #15 יכול לשמש גם לביצוע החתך והדיסקציות הבאות (שלבים 2.3.6-2.3.9).</li>
		<li>בעת ביצוע החתך, יש לפזר את העור החתוך באמצעות האגודל והאצבע המורה כדי לחשוף את השרירים ועצם הלסת שמתחת.</li>
		<li>השתמש בסכין הגילוח כדי לקטוע את שרירי המסה בצד הבוקאלי של הלסת התחתונה, כך שהחלק החיצוני של הלסת השמאלית והימנית נקיים כעת מחיבורי שרירים.</li>
		<li>לנתק את השרירים mylohyoid לאורך הצד הפנימי של הלסת כדי להסיר את חיבורי השרירים שם.</li>
		<li>בצע חתך נוסף בסימפיזיס המנדיבולרי המחבר בין שני hemimandibles. לאחר החיתוך, הלסת התחתונה תופרד לחצי השמאלי והימני.</li>
		<li>תקעו את סכין הגילוח בין הקונדיל המנדיבולרי לבין המפרק המנדיבולרי הרקתי ונתחו בזהירות את ההמיס משאר הראש. הערה: מצאנו שזה מועיל למשוך בו זמנית בעדינות על החותכת בזמן החיתוך. יש להקפיד להימנע משבירת הלסת התחתונה ומפגיעה ברקמות הרכות שבתוכו.</li>
	</ol></li>
	<li>העבירו מיד לסת לסתית מנותחת לצלחת פטרי עם אמצעי הדיסקציה שחוממו מראש (שלב 1.1) והוציאו את רקמות השריר הנותרות באמצעות להב כירורגי #15. הערה: שמירת דגימות במדיה קרה מאטה את פעילות התא, וכתוצאה מכך שחזור מושהה או אפילו כושל של פעילויות תאים מסוימות, כגון התרבות או תנועת תאים, במהלך הדמיה חיה.</li>
</ol>3. בידוד של כל חותכות העכבר
הערה: בידוד נוסף של החותכת נעשה תחת מיקרוסקופ דיסקציה של שדה בהיר.
<ol><li>זהה חזותית את האזור הסגלגל של הלסת התחתונה המכסה את שקע החותכת ומאכלס את החלק האפי של החתך.</li>
	<li>מקם את הלסת כך שהמשטח הפנימי (הלשוני) פונה כלפי מעלה.</li>
	<li>תוך כדי החזקת הלסת התחתונה במקום עם זוג מלקחיים משוננים, צור חלון באזור הסגלגל על ידי גילוח עצם הקרום שמעל באמצעות להב כירורגי #15, בכיוון שהוא מהקונדיל לכיוון הטוחנות. זה חושף את הרקמה הרכה של החותכת האפיקלית על פני השטח הפנימי.</li>
	<li>הפוך את הלסת התחתונה כך שהמשטח החיצוני (הבוקאלי) פונה כלפי מעלה.</li>
	<li>צור חלון באזור הסגלגל בלסת התחתונה החיצונית כמתואר בשלב 3.3 והשתמש בקצה האזמל כדי לאסוף את שברי העצם שנותרו בקצה. ודא שהקצה האפי של השן גלוי משני הצדדים. הערה: הימנע מלחץ מוגזם בעת גילוח העצמות כדי למנוע נזק לרקמה הרכה שמתחתיה.</li>
	<li>חתכו באופן שיטתי את העצמות המקיפות את החותכת כדי לבודד את השן כולה.<ol><li>בצע חתך נקי במישור הסמוך מיד לחותכת אפיקלית כדי להסיר תחילה את התהליך הקונדילרי. הערה: היזהרו לא לחתוך לתוך החתך.</li>
		<li>בצע חתך שני רק אחורי לטוחנת 3, אך גבי לחותכת מבלי לפגוע בשן. פעולה זו מסירה את העצם הכוללת את התהליך הקורונואידי.</li>
		<li>חותכים באופן סדרתי מקצה התהליך הזוויתי לכיוון החותכת כדי להסיר בהדרגה את הלסת הגחונית בצורה מדורגת. הערה: אפיתל השיניים ורקמות החניכיים הקשורות אליו נדבקים לעתים קרובות לעצם ונקרעים בקלות אם חלק גדול מעצם הגחון נחתך בבת אחת. כדי להפריד את העצם מהרקמה הרכה החותכת, ניתן להחדיר את האזמל (או זוג מלקחיים חדים שאינם משוננים) בין שתי הרקמות בקצה האפי של החותכת ולהחליק בעדינות את המכשיר קדימה.</li>
		<li>חותכים את עצם הנאדית עם טוחנות וכל העצמות הנותרות שעדיין מחוברות לחתך.</li>
		<li>החותכת כולה מבודדת כעת. מעבירים את החותכת המנותחת במלואה לצלחת עם מדיית דיסקציה נקייה וחמה (שלב 1.1).</li>
	</ol></li>
	<li>חזור על שלבים 3.2-3.6 כדי לבודד חותכות נוספות לפי הצורך. הערה: החותכות המקסילריות/עליונות של העכבר שומרות גם על תאי גזע בוגרים וניתן להשתמש בהן לחקר התחדשות שיניים34. חוקרי שיניים מתמקדים בדרך כלל בחותכות התחתונות מכיוון שהן נגישות יותר וניתן לנתח אותן בקלות רבה יותר מאשר החותכות העליונות. ההבדלים בין תאי אב חותכים מנדיבולריים ומקסילריים נותרו לקבוע.</li>
</ol>4. הסרת רקמות חניכיים לחשיפת לולאת צוואר הרחם החותכת אפיתל
<ol><li>כאשר כל החותכת שוכבת על הצד הלשוני שלה ותוך כדי החזקת השן במקומה עם זוג מלקחיים משוננים, השתמש בזוג מלקחיים עדינים #5 כדי להתחיל לתחוב על רקמות החניכיים המכסות את החותכת האפיקלית ואת אזור הלולאה הצווארית.</li>
	<li>מקלפים בזהירות את רקמת החניכיים מהניצן האפיקאלי, כך שהצד הצדדי של הלולאה הצווארית (או אזורי עניין אחרים) הופך גלוי מתחת להיקף. הערה: יש להקפיד להימנע מפגיעה באפיתל הדנטלי או ניתוקו מהמזנכימה. אם לחותכת יש אותות פלואורסצנטיים באזור העניין, ומיקרוסקופ דיסקציה פלואורסצנטית זמין, ניתן להשתמש באותות פלואורסצנטיים כדי לסייע בהבחנה בין סוגי רקמות ולסייע בנתיחות. חשוב לבצע ביעילות את סעיפים 2-4 כדי שניתן יהיה להעביר דגימות במהירות לאמצעי התרבות ולתחזק אותן כראוי באמצעות תרבית אקספלנט (ראו להלן).</li>
</ol>5. שיבוץ רקמות לתרבית צמחים
<ol><li>מוסיפים 500 μL של ג'ל תרבית חם ולא מוצק לבאר בצלחת של 24 בארות ומעבירים במהירות את החותכות השלמות המנותחות לבאר. מערבלים את הצלחת מספר פעמים כדי לשטוף את החותכות.</li>
	<li>מוסיפים 400 μL של ג'ל תרבית חם ולא מוצק לצלחת תרבית ומעבירים את החותכות השטופות לצלחת. הערה: אנו משתמשים בצלחת תרבית זמינה מסחרית התואמת למערך הזילוח. ראה שלב 6.4 לקבלת אפשרויות חלופיות.</li>
	<li>כוונו את החותכת כך שתמקם את אזור הלולאה הצווארית (או אזורי עניין אחרים) במרכז הצלחת (איור 2A,B) והתאימו את ההטיה של החותכת האפיקלית למישור ההדמיה הרצוי. הערה: כיוון הרקמה צריך להיעשות במהירות לפני ג'לציה מלאה.</li>
	<li>לאחר הגדרת הג'ל, השתמשו בזוג מלקחיים עדינים כדי להסיר את הג'ל מעל האזור המעניין כך שהוא לא יהיה מכוסה בג'ל.</li>
	<li>הוסף נפח מספיק של מדיה תרבותית חמה על ידי pipeting איטי על קצה המנה רק לכסות את הדגימה (~ 150 μL).</li>
	<li>העבר את תרבית הצמחים לאינקובטור תרבית תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כדי לאפשר שיקוע רקמות והתאמה למצב התרבית למשך שעה אחת.</li>
</ol>6. מיקרוסקופ Timelapse של צמחים חותכים
הערה: בניסוי הזה השתמשנו במיקרוסקופ זקוף המצויד במטרה לטבול מים פי 25 עם צמצם מספרי של 1. באופן כללי, עדשת טבילה במים עם צמצם מספרי גבוה מתאימה ביותר להדמיית רקמות עמוקות.
<ol><li>הפעל את המיקרוסקופ ואת הלייזר של שני פוטונים.</li>
	<li>הצמידו את צלחת התרבית למתאם הבמה והרכיבו את טבעת מתאם הזלוף מעליה (איור 2C).</li>
	<li>חבר את מתאם הבמה לבקר טמפרטורה שהוגדר כדי לשמור על התרבית ב- 37 ° C.</li>
	<li>חבר את הכניסה ואת היציאה של טבעת המתאם למשאבת מיקרו-זילוח והתחל בזילוח של מדיום התרבית, כאשר מהירות הזילוח מוגדרת על 20 במשאבה. זה יוצר זרימה איטית (~5 מ"ל/שעה) של תווך התרבית מעל החלק העליון של הדגימות (איור 2C). הערה: עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים על המערכת לשמירה על הרקמה בסביבה מבוקרת יציבה. ניתן להשתמש גם במערכות אחרות. ניתן להשתמש גם בשילוב של פלטת חימום בטמפרטורה של 37°C וצלחת תרבית זילוח ביתית (איור משלים S1) עם פתח כניסה ושקע המחוברים למשאבות מזרק.</li>
	<li>הניחו טבעת מחסום בקרה אטמוספרי (ACBR) על גבי טבעת המתאם, והנמיכו את המטרה דרך ה-ACBR כדי ליצור מגע עם מדיום התרבית (איור 2D).</li>
	<li>כוונן את אורך גל הלייזר ל- 920 ננומטר כדי להמחיש הן את האותות GFP והן את האותות הפלואורסצנטיים האדומים (למשל, tdTomato).</li>
	<li>אתר דגימות דרך עיניות ולאחר מכן על תוכנת המיקרוסקופ.</li>
	<li>הגדר ערימות Z, הדמיה מרובת מיקומים ומרווחי זמן באמצעות התוכנה. כדי לעקוב אחר פרוטוקול זה, השתמש בגודל z-step של 4 מיקרומטר ובמרווח זמן של 5 דקות למשך 14 שעות. הערה: מצאנו שמרווח זמן של יותר מ-5 דקות לעתים קרובות אינו מספיק כדי ללכוד תנועות וחלוקות חלקות של תאים.</li>
	<li>התחל את ההדמיה של קיטועי הזמן. הערה: מיקום הדגימה עשוי להשתנות במהלך השעה הראשונה וייתכן שיידרשו התאמות נוספות.</li>
	<li>שמור קבצים לעיבוד וניתוח נתונים במורד הזרם.</li>
</ol>

מעקב חי אחר תאי שיניים באמצעות מיקרוסקופ דו-פוטוני

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

הדמיית רקמות חיות היא טכניקה חשובה המאפשרת לנו לחקור את התהליכים וההתנהגויות הדינמיים של תאים כאשר הם נשמרים בסביבת הנישה שלהם41. באופן אידיאלי, הדמיה חיה מבוצעת in vivo עם רזולוציה מרחבית-זמנית גבוהה. עם זאת, הדמיה in vivo עבור איברים יונקים יכול להיות מאתגר בשל חוסר נגישות רקמות, אטימות אופטית, וקושי לשתק את החיה או את האיבר לתקופה ממושכת42. צמחי רקמות עוקפים חלק מהאתגרים הללו ואומצו בהצלחה במספר מחקרים למעקב אחר התנהגויות תאים, כגון במהלך מורפוגנזה של ה...

במהלך שני העשורים האחרונים, החותכת לעכבר התפתחה כפלטפורמה רבת ערך לחקר עקרונות ויסות תאי גזע בוגרים והתחדשות שיניים 1,2. החותכת לעכבר גדלה ברציפות ומתחדשת לאורך כל חיי החיה. הוא עושה זאת על ידי שמירה על תאי גזע אפיתל ומזנכימליים, אשר יכולים לחדש את עצמם ולהתמיין לסוגי תאים שונים של השן 1,2. בעוד שתאי גזע אפיתליאליים דנטליים מולידים אמלובלסטים, המפרישים את מטריצת האמייל, תאי גזע מזנכימליים דנטליים מולידים אודונטובלסטים, צמנטובלסטים ופיברובלסטים, היוצרים דנטין, צמנטום ורצועה חניכית, בהתאמה 3,4,5,6. אספקה קבועה זו של תאים חדשים שומרת על הומאוסטזיס רקמות ומאפשרת החלפה של תאים ישנים שאבדו עקב שחיקה או פציעות 7,8. הבהרת המנגנונים התאיים והמולקולריים המווסתים את התחזוקה וההתמיינות של תאי גזע דנטליים היא אפוא מרכזית להבנת התחדשות השיניים, תחום בעל עניין הולך וגובר.
מבחינה אנטומית, חלק גדול מהחותכת של העכבר הבוגר עטוף בעצם הלסת. בזמן שהקצה החתך של השן חשוף, הקצה האפי של החותכת נכנס לתוך שקע ומחובר היטב לעצם שמסביב דרך רצועות חניכיים ורקמות חיבור (איור 1A,B). הקצה האפי של החותך הוא גם אזור הצמיחה של השן ושומר על תאי גזע ואב דנטליים הן בשכבת האפיתל והן במוך השן 9,10,11,12,13. באופן ספציפי, תאי גזע אפיתליאליים דנטליים נשמרים בקצה הבולבוסי של האפיתל, הידוע בשם ניצן אפיקלי, המכונה גם לולאה צווארית שפתיים (איור 1C). בדומה לאפיתל המעי ולאפידרמיס, חידוש האפיתל בחותכת נתמך בעיקר על ידי מחזור פעיל של תאי גזע וצאצאיהם המתווכים המתרבים מאוד, הנקראים תאים מגבירי מעבר 14,15,16,17, שניהם שוכנים בחלק הפנימי של לולאת צוואר הרחם. עם זאת, עדיין לא ברור אם אפיתל החותך מכיל ומשתמש בתאי גזע שקטים במהלך ההתחדשות. לעומת זאת, במוך השן זוהו תאי גזע מזנכימליים דנטליים פעילים ושקטים כאחד, ותאי הגזע השקטים מתפקדים כאוכלוסיית מילואים המופעלת במהלך תיקון פציעה13,18.
רבות מהתגליות על הביולוגיה של ההתחדשות וההתחדשות של החותכות בעכבר נבעו מחקירות היסטולוגיות, שבהן הדגימות מתקבלות בצמתים זמניים נפרדים, מקובעות, מעובדות ואז נחתכות לפרוסות דקות מיקרון לאורך מישור מסוים. באמצעות ניתוח מפורט של קטעים היסטולוגיים ממודלים שונים של עכברים המאפשרים מעקב אחר שושלות או הפרעות גנטיות, מדענים זיהו את שושלות התאים של אוכלוסיות אבות שונות, כמו גם את המסלולים הגנטיים והאיתות השולטים בהומאוסטזיס חותך ותיקון פציעות 19,20,21. עם זאת, התמונות הדו-ממדיות (דו-ממדיות) הסטטיות של תאים לא חיוניים במקטעים אינן יכולות ללכוד את הספקטרום המלא של התנהגויות תאיות וארגונים מרחביים ברקמה חיה, כגון שינויים בצורת התא, תנועות וקינטיקה תאית. זיהוי ומדידה של שינויים תאיים מהירים אלה, המתרחשים בקנה מידה של ציר זמן שאינו ניתן לפתרון באמצעות חתך רקמות, דורשים אסטרטגיה שונה. יתר על כן, רכישת מידע כזה היא גם קריטית להבנת האופן שבו תאים דנטליים מתקשרים זה עם זה, מגיבים לגירויי איתות שונים ומתארגנים בעצמם כדי לשמור על מבנים ותפקודים של רקמות.
הופעתו של דימות רקמות עמוק ארבע-ממדי (4D) באמצעות מיקרוסקופ דו-פוטוני22, טכנולוגיה המשלבת שלושה ממדים מרחביים עם רזולוציה טמפורלית, מתגברת על המגבלות המובנות של ניתוח היסטולוגי בכך שהיא מאפשרת בדיקה מרחבית-זמנית של צמחי רקמה בתרבית, אורגנואידים או אפילו רקמות באתרן 23,24,25,26 . לדוגמה, הדמיה חיה 4D של אפיתל השן המתפתח חשפה את הדפוסים המרחביים-זמניים של חלוקות תאים ונדידה המתאמים צמיחת רקמות, היווצרות מרכזי איתות ומורפוגנזה אפיתל דנטלי 27,28,29,30,31,32. בחותך עכבר בוגר, הותאמה לאחרונה הדמיה 4D לחקר התנהגויות תאיות במהלך תיקון פגיעה באפיתל דנטלי. הדמיה חיה גילתה כי תאים בין-בינוניים בשכבה העל-בסיסית יכולים להיות מומרים ישירות לאמלובלסטים בשכבת הבסיס כדי לחדש את האפיתל הפגוע, מה שמאתגר את הפרדיגמה המסורתית של תיקון פגיעה אפיתל15.
כאן אנו מתארים את הדיסקציה, ההתרבות וההדמיה של חותך העכבר הבוגר, תוך התמקדות בתאי אפיתל בלולאה הצווארית העבתית (איור 1). טכניקה זו משמרת את חיוניות תאי השיניים למשך יותר מ-12 שעות ומאפשרת מעקב חי אחר תאים המסומנים באופן פלואורסצנטי ברזולוציה של תא יחיד. גישה זו מאפשרת לחקור את תנועת התא ונדידתו, כמו גם שינויים דינמיים בצורת התא ובכיוון החלוקה בתנאי תרבית רגילים, או בתגובות להפרעות גנטיות, פיזיקליות וכימיות.

<table><tbody><tr><td>24 באר, צלחת תרבית רקמות תחתונה שטוחה</td><td>פלסטיק אולימפוס</td><td>25-107</td><td></td></tr><tr><td>25x HC IRAPO motCORR מטרת טבילה במים</td><td>Leica</td><td>11507704</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אסקורבית (ויטמין C)</td> <td>Acros Organics</td><td>352685000</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-גלוקוז bioxtra&nbsp;</td><td>מערכת סיגמא אולדריץ'</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>דלתא T&nbsp;</td><td>Bioptechs</td><td>0420-4</td><td>כולל בקרת טמפרטורה, כלי תרבית והגדרת זלוף</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ דיסקציה- LEICA S9E</td><td>Leica</td><td>LED300 SLI</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermo Scientific</td><td>11039047</td><td>מדיה בזאלית ללא פנול</td></tr><tr><td>אדום להב כירורגי נוצה (#15)</td><td>נוצה</td><td>72044-15</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים עדינים</td><td>FST</td><td>11252-23</td><td></td></tr><tr><td>גלוטמקס&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>35050-061</td><td>תחליף גלוטמין</td></tr><tr><td>Leica SP8-DIVE מצויד במטרת טבילה במים 25X HC IRAPO motCORR&nbsp;</td><td>Leica</td><td>n/a</td><td></td></tr> חומצות אמינו לא חיוניות <tr><td>NuSieve</td><td>50080</td><td></td><td>בהתכה נמוכה</td></tr><tr><td>(100x)</td><td>Thermo Scientific</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין&ndash; סטרפטומיצין</td><td>תרמו סיינטיפיק</td><td>15140122</td><td>10,000 יח'/מ"ל&nbsp;</td></tr><tr><td>צלחת פטרי</td><td>Gen Clone</td><td>32-107G</td><td>90 מ"מ&nbsp;</td></tr><tr><td>סרום</td><td>עכברושים עמק AS3061SC ביו-רפואי</td><td></td><td>מעובד להדמיה חיה</td></tr><tr><td>סכין גילוח #9</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>ידית אזמל</td><td>FST</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>מספריים</td><td>FST</td><td>37133</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים משוננים</td><td>FST</td><td>11000-13</td><td></td></tr><tr><td>מספריים קפיציים</td><td>FST</td><td>91500-09</td><td></td></tr></tbody></table>

שימוש בהדמיה חיה של ex vivo כדי לחקור חלוקות תאים ותנועות במהלך חידוש שיניים של עכבר

Using Ex Vivo Live Imaging to Investigate Cell Divisions and Movements During Mouse Dental Renewal

החותכת לעכבר הגדלה ללא הרף מתגלה כמערכת מודל בעלת יכולת טיפול גבוהה כדי לחקור את הרגולציה של תאי גזע אפיתל ומזנכימליים בוגרים והתחדשות שיניים. אוכלוסיות אבות אלה מחולקות, נעות ומתמיינות באופן פעיל כדי לשמור על הומאוסטזיס רקמות ולחדש תאים אבודים באופן מגיב. עם זאת, ניתוחים מסורתיים באמצעות קטעי רקמות קבועים לא יכלו ללכוד את התהליכים הדינמיים של תנועות תאים ואינטראקציות, מה שהגביל את יכולתנו לחקור את התקנות שלהם. מאמר זה מתאר פרוטוקול לשמירה על חותכות עכבר שלמות במערכת תרבית אקספלנט ותאי אפיתל דנטליים במסלול חי באמצעות מיקרוסקופ קיטוע זמן מולטיפוטון. טכניקה זו מוסיפה לארגז הכלים הקיים שלנו למחקר דנטלי ומאפשרת לחוקרים לרכוש מידע מרחבי-זמני על התנהגויות תאים וארגונים ברקמה חיה. אנו צופים כי מתודולוגיה זו תסייע לחוקרים להמשיך ולחקור מנגנונים השולטים בתהליכים התאיים הדינמיים המתרחשים הן במהלך חידוש השיניים והן במהלך התחדשותן.

האזור האפי של חותכת העכבר הבוגר עטוף בתוך הלסת התחתונה (איור 1) ולכן אינו נגיש ישירות להדמיה ולמעקב חי אחר תאי האב השוכנים באזור הגדילה. לכן, פיתחנו שיטה לחלץ את כל החותכת מעצם הלסת ולתחזק אותה במערכת תרבית אקספלנט עבור מיקרוסקופ בהילוך מהיר של שני פוטונים (איור 2). כאן אנו מתארים תוצאות מייצגות הלוכדות את התהליך הדינמי של התפשטות תאים ותנועה באזור הלולאה הצווארית של אפיתל השיניים.
כדי להדגים את ההליכים הניסיוניים, השתמשנו בשני מודלים...

הדמיה חיה Ex vivo היא טכניקה רבת עוצמה לחקר התהליכים הדינמיים של תנועות תאים ואינטראקציות ברקמות חיות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול המיישם מיקרוסקופ של שני פוטונים למעקב חי אחר תאי אפיתל דנטליים בחותכות עכבר בוגרות שלמות בתרבית.

שימוש בהדמיה חיה של Ex Vivo כדי לחקור חלוקות תאים ותנועות במהלך חידוש שיניים של עכבר

The continuously growing mouse incisor is emerging as a highly tractable model system to investigate the regulation of adult epithelial and mesenchymal ...

כדי לשמור על הארגון התאי הנכון במהלך חידוש האיברים, רקמה המתקרבת לתאים נעה ומחלקת כיוונים ודפוסים ספציפיים. לכן חשוב להבין את הכללים והתקנות של אירועים סלולריים דינמיים אלה. החותכת לעכבר היא מודל מתפתח לחקר תאי גזע בוגרים, וכלים גנטיים רבים זמינים במערכת לחקר תפקודי גנים, ולסימון תאים למעקב אחר שושלת.רוב המחקרים עד כה משתמשים בדגימות שיניים בוגרות שנאספו וקיבעו את נקודות הזמן הספציפיות שלהן, וזה מונע מאיתנו לבחון את התנהגות תאי החיים. בפרוטוקול זה אנו מתארים שיטה למעקב אחר אורחות חיים אצל חותך עכבר בוגר, וטכניקה זו תאפשר מחקרים עתידיים שמטרתם להבין כיצד התנהגויות תאים דינמיות תורמות לחידוש ותיקון רקמות שיניים.

using-ex-vivo-live-imaging-to-investigate-cell-divisions-movements

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

כאן אנו מפתחים את הכלים הדרושים...

Ex vivo הדמיה חיה של חלוקות תא יחיד בNeuroepithelium מאוס

מיטוזה העצבית היא פרמטר קריטי הנוירוגנזה. חלק גדול מההבנה של מיטוזה העצבית שלנו מבוסס על ניתוח של רקמה קבועה. הדמיה בשידור חי בפרוסות מוח עובריים היא טכניקה צדדי כדי להעריך מיטוזה עם רזולוציה של זמן ומרחב גבוה בסביבה מבוקרת.

הדמיה חיה של מיטוזה בCortex עכבר עוברי פיתוח

כאן, אנו מציגים פרוטוקול הדמיה חיה של היתוך חיך העכבר העכבר באמצעות מיקרוסקופיה confocal. פרוטוקול זה ניתן להשתמש בשילוב עם מגוון רחב של שורות העכבר כתב פלואורסצנטי, עם מעכבי נתיב עבור תובנה מכניסטית. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם עבור הדמיה חיה במערכות התפתחותיות אחרות.

הדמיה חיה של עכבר משניים פיוז &#39;ן

הדמיה אימונופלואורסצנטית מוגבלת על ידי היכולת לצפות בתהליכים ביולוגיים מורכבים ותלויי זמן בתמונת מצב אחת בלבד בזמן. מחקר זה מתאר גישת הדמיה חיה שנערכה על פרוסות בלוטות תת-לסתיות של עכברים שנחתכו בחיתוך מדויק. גישה זו מאפשרת תצפית בזמן אמת על אינטראקציות תא-תא במהלך הומאוסטזיס ותהליכי התחדשות ותיקון.

חקירת אינטראקציות תאים-תאים בבלוטת הרוק באמצעות Ex Vivo Live Cell Imaging

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לתרבית קשתות הלוע כדי לחקור את הביולוגיה של תאי אב לב ושריר והמיקרו-סביבה שלהם.

אקס תרבות Vivo של בלוע קשתות לחקר תאי אב לב ושרירים והנישה שלהם

תרבית הטיפות הזקופות ex vivo היא אלטרנטיבה לטכניקות הניסוי הנוכחיות in vitro ו-in vivo. פרוטוקול זה קל לביצוע ודורש כמויות קטנות יותר של ריאגנטים, תוך מתן אפשרות לתפעל ולחקור כלי דם עובריים, מורפוגנזה ואורגנוגנזה.

שימוש<em&gt; Ex Vivo</em&gt; תרבויות הזקופה טיפה של איברים העובר שלמים לחקר תהליכים התפתחותיים בעכבר organogenesis

מטרת פרוטוקול זה היא לתאר loss- ולהשיג-של שיטת הפונקציה כי הוא ישים לזהות neogenin כמו קולטן בשלב ספציפי שמוביל trophectoderm ותא פנימי בידול המונים עוברי עכברים preimplantation.

Loss- ו-של-פונקצית רווח גישה לחקר תא מוקדם קובעי גורל preimplantation עכבר עובר

בשילוב של השתלת תאים, תיוג שלד ציטו וגישות אובדן/רווח תפקוד, פרוטוקול זה מתאר כיצד ניתן להשתמש בצלחת הקדם-כורדלית הפוטנציאלית של דג הזברה הנודד כדי לנתח את תפקודו של גן מועמד בנדידת תאים in vivo.

ניתוח<em&gt; In vivo</em&gt; נדידת תאים באמצעות השתלות תא והדמיה זמן לשגות עוברי דג הזברה

שיטה ליצור ולחיות תמונות שונים מוח העצמות נישות בעכברים מוצג. בהתבסס על נישה תומכת שנוצרו על ידי תאים mesenchymal האדם, תוספת של תאים אנדותל האדם גורם להיווצרות של כלי אדם, ואילו תוספת של rhBMP-2 גורם להיווצרות של רקמת העצם של המוח האנושי.

הנדסת ביו-הנדסה של Microenvironments מוח העצם של עכבר ויזואליזציה שלהם על ידי הדמיה חיה

כתב יד זה מתאר במבחנה ביצית טיפוח שיטה המאפשרת הדמיה לחיות תאים של תודרנית מופרות, העוברים. בשיטה זו הוא מנוצל כדי להמחיש את הדינמיקה תאיים במהלך זיגוטה קיטוב מפרט הגורל תא בפיתוח עוברי.

במבחנה ביצית טיפוח עבור Live-תא הדמיה של הזיגוטה קיטוב והמתבנת העובר ב תודרנית לבנה

חקור הדמיה חיה ex vivo של תאים אפיתליים בשיני עכברים בוגרים באמצעות מיקרוסקופיית שני פוטונים. שיטה זו מאפשרת מעקב אחר תנועות תאים דינמיות ותרומה להבנת חידוש רקמות.

שימוש בהדמיה חיה של Ex Vivo כדי לחקור חלוקות תאים ותנועות במהלך חידוש שיניים של עכבר

גלה סרטונים נוספים