הדמיה של חלבונים בשפע נמוך ושינויים לאחר תרגום בעוברי דרוזופילה חיים באמצעות הזרקת נוגדנים פלואורסצנטיים
19 בינואר 2024
פרוטוקול זה מתאר תיוג פלואורסצנטי מותאם אישית מבוסס נוגדנים והזרקה לעוברים מוקדמים של דרוזופילה כדי לאפשר הדמיה חיה של חלבונים בשפע נמוך או שינויים לאחר תרגום שמאתגרים לזיהוי באמצעות גישות GFP/mCherry-tag מסורתיות.
אנו שואפים להבין כיצד אותות מכניים וביוכימיים מתואמים בין מורפוגנזה של בעלי חיים, כולל זיהוי ותגובה לכוחות של תאים ומולקולות. מולקולות נוספות התגלו כרגישות למכנו, המתפקדות באופן שונה תחת רמות שונות של מתח. עם זאת, ההקשר הפיזיולוגי ותפקודם של אירועים רגישים אלה לכוח עדיין אינם ידועים במידה רבה.
בשל האופי הדינמי של אירועים רגישים לכוח, התחום שלנו מסתמך במידה רבה על דימות פלואורסצנטי במהירות גבוהה והקלטה בהילוך מהיר כדי ללכוד התנהגויות מולקולריות ותאיות. חלבונים רבים המתויגים באופן פלואורסצנטי אינם בהירים מספיק כדי שניתן יהיה לצלם אותם, והם דורשים רזולוציה מרחבית-טמפורלית ללא אקונומיקה משמעותית. מצד שני, שיטות אימונופלואורסצנטיות מסורתיות יכולות ללכוד תמונה של מתקן מולקולרי ותאי רק לאחר קיבוע.
שיטה זו סוללת את הדרך למעקב דינמי אחר לוקליזציה של קולטני חלבון רבים בעלי שפע נמוך של מסלולי איתות עיקריים, כגון Notch, Wnt ומסלולי BMP. בסופו של דבר, בנוסף למפל האיתות הליניארי המסורתי, אנו יכולים לאתר והיכן מתרחשים אירועי האיתות בסקאלות התת-תאיות.
סקירה כללית
מחקר זה מתמקד בהבנת האופן שבו אותות מכניים וביוכימיים מתאמים מורפוגנזה של בעלי חיים. הוא מדגיש את האתגרים בזיהוי חלבונים בריכוז נמוך ומודיפיקציות לאחר תרגום בדימות חי.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- ביוכימיה
- ביולוגיה של התא
רקע
- אותות מכניים וביוכימיים הם קריטיים למורפוגנזה.
- מולקולות רבות הן רגישות למכניקה ומגיבות באופן שונה למתיחה.
- ההקשר הפיזיולוגי של אירועים הרגישים לכוח אינו נחקר במידה רבה.
- דימות פלואורסצנציה במהירות גבוהה חיוני לחקר התנהגויות תאיות דינמיות.
מטרת המחקר
- לשיפור הגילוי של חלבונים בריכוז נמוך בעוברים חיים של Drosophila.
- לשיפור טכניקות הדימוג מעבר לשיטות המסורתיות.
- לבחינת התפקידים הפיזיולוגיים של מולקולות רגישות למכניקה (mechanosensitive).
שיטות שנעשה בהן שימוש
- סימון פלואורסצנטי מותאם אישית מבוסס נוגדנים.
- הזרקה לעוברים מוקדמים של Drosophila.
- טכניקות דימות חי (Live imaging) ללכידת תהליכים דינמיים.
- הקלטת Time-lapse לצפייה בהתנהגויות מולקולריות.
תוצאות עיקריות
- סימון ודימות מוצלחים של חלבונים בריכוז נמוך.
- הוכחת היעילות של פרוטוקול הדימות החדש.
- מתן תובנות לגבי התנהגותן של מולקולות רגישות למכניקה (mechanosensitive).
- הדגשת המגבלות של שיטות אימונופלורסצנציה מסורתיות.
מסקנות
- הפרוטוקול מאפשר ויזואליזציה טובה יותר של חלבונים מאתגרים.
- הוא פותח נתיבים חדשים לחקר תגובות תאיות לאותות מכניים.
- מחקרים עתידיים יכולים להתבסס על ממצאים אלו כדי להעמיק בחקר המורפוגנזה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמך המנהלים
גילוי של חלבונים בריכוז נמוך ושל מודיפיקציות פוסט-טרנסלציונליות במערכות חיות הוא אתגר מתמיד בשלבי הגילוי המוקדמים של תרופות, המגביל את התובנות המכניסטיות ואת תיקוף המטרה. פרוטוקול הסימון הפלואורסצנטי המתווך על ידי נוגדנים מאפשר ויזואליזציה בזמן אמת של דינמיקת חלבונים אנדוגניים ושל PTMs בעוברים חיים של Drosophila, ובכך מתגבר על מגבלות הרגישות והארטיפקטים של שיטות מסורתיות המבוססות על תיוג וקיבוע. יכולת זו מגבירה את הביטחון החזוי בשלבי תיקוף המטרה והפחתת הסיכונים המכניסטית, ובכך תומכת בקבלת החלטות מושכלת יותר לגבי תיק התרופות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר ויזואליזציה ישירה של חלבוני איתות בריכוז נמוך ושל PTMs בהקשרים רלוונטיים פיזיולוגית.
- תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי חשיפת דפוסים מרחביים וזמניים של לוקליזציה ומודיפיקציה של חלבונים.
- משפר את הביטחון החזוי לגבי מעורבות המטרה (target engagement) ובחינת מסלולים במערכות מודל חיות.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- מקל על פיתוח של בדיקות כמותיות בתאי חיים (live-cell assays) למיקומם של חלבונים ולדינמיקה של מודיפיקציות.
- מספק פלטפורמה לתיקוף ספציפיות של נוגדנים ויחס אות לרעש בתהליכי דימוי של תאים חיים.
- מאפשר זיהוי הדיר כשל אירועים מולקולריים דינמיים הקריטיים להכנה לבדיקות סריקה (screening) בהמשך התהליך.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה פלטי דימות בזמן אמת לסמנים ביולוגיים מכניסטיים הרלוונטיים למחלה כאשר היא מיושמת על מסלולי אותיות.
- תומך ברציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף הפרה-קליני על ידי היתמכנות של ניטור בזמן אמת של אירועים מולקולריים.
- מפחית את הסיכון התרגומי על ידי אספקת נתונים מדויקים פיזיולוגית על דינמיקת חלבונים ו-PTM.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת נתונים
פרוטוקול זה להזרקת נוגדנים ודימוי חי משלב בין שלבי הגילוי המוקדמים לזיהוי מובילים (lead identification), ומספק גשר בין תיקוף המטרה לבין פיתוח מודלים פרה-קליניים.
- ביולוגיה של הגילוי: מאפשרת בדיקת השערות לגבי תפקוד חלבונים ופעילות נתיבים בעובריים חיים.
- סריקה: מספקת תוצאות כמותיות וניתנות לשחזור של לוקליזציית חלבונים ו-PTM לצורך פיתוח בדיקות.
- אנליטיקה: תומכת במדידה מבוססת זמן של דינמיקה מולקולרית, מה שמקל על השוואת תנאים וניתוח מנגנוני.
- מחקר תרגומי: מציעה פוטנציאל להתאמה של סמנים ביולוגיים בנתיבי איתות הרלוונטיים למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: ניתנת להתאמה למטרות נוגדנים אחרות ותואמת למגוון דגמים או שורות תאים המאפשרים הזרקה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף מטרות.
- ערך תפעולי: מסנכרן דימוי חי של חלבונים במינון נמוך ושל PTMs ברגישות גבוהה.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות משופרת לגבי המשך או הפסקת הפיתוח (go/no-go) באמצעות אספקת נתונים מולקולריים רלוונטיים פיזיולוגית בזמן אמת.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם סיכון ובקידום מטרות עם תפקידים מכניסטים מתוקפים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בהזרקה מיקרוסקופית (microinjection), בדימוי חי (live imaging) ובצמידת נוגדנים (antibody conjugation).
- דורש גישה למיקרוסקופיית פלואורסצנציה ברזולוציה גבוהה ולכלים מדויקים לטיפול בעובריים.
- סטנדרטיזציה של פרוטוקולי סימון הנוגדנים וההזרקה היא קריטית לצורך שחזור התוצאות.
- התאמה למערכות מודל אחרות עשויה לדרוש אופטימיזציה של פרמטרי ההזרקה והדימוי.
- גילוי האות תלוי בספציפיות של הנוגדן וביעילות הסימון.
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:33
Fluorescent Labeling of Antibodies for Imaging Low Abundance Proteins in Drosophila
2:18
Preparation and Alignment of Drosophila Embryos for Injecting Fluorescently Labeled Antibodies
4:56
Injecting Fluorescently Labeled Antibodies in Live Drosophila Embryos and Imaging of Low Abundance Proteins
