Name: הדפסת חיידקים בתלת-ממד לחקר תנועתיות וצמיחה במדיה נקבובית תלת-ממדית מורכבת (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-19T14:10:00.000+00:00
Duration: 5 min 46 s
Description: למדו הדפסת תלת-ממד של מושבות חיידקים במטריצות הידרוגל גרנולריות לחקר תנועתיות וצמיחה. השיטה מאפשרת לחקור התנהגות חיידקים בסביבות נקבוביות מורכבות המחקות בתי גידול טבעיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

ר.ק.ב. מודה על תמיכתה של תוכנית עמיתי המחקר הנשיאותית לפוסט-דוקטורט. חומר זה מבוסס גם על עבודה הנתמכת על ידי מענק תוכנית מלגות מחקר לתארים מתקדמים של NSF DGE-2039656 (ל- A.M.H). א.ס.ד.-מ. ו-H.N.L. מודים על תמיכתה של Lidow Independent Work/Senior Thesis Fund באוניברסיטת פרינסטון. אנו מודים גם למעבדה של בוני באסלר על אספקת זנים של V. cholerae. SSD מודה על תמיכתם של מענקי NSF CBET-1941716, DMR-2011750 ו- EF-2124863, כמו גם קרן אריק וונדי שמידט לטכנולוגיה טרנספורמטיבית, קרן הבריאות של ניו ג'רזי, תוכנית המלגות הביו-רפואיות של פיו ותוכנית המורים-חוקרים של קמיל דרייפוס.

הדפסה ביולוגית של חיידקים במטריצות הידרוג'ל לחקר תנועתיות וגדילה

<ol><li>Persat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanical+world+of+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The mechanical world of bacteria.</a> Cell. 161 (5), 988-997 (2015).</li>
<li>Stoodley, P., Dodds, I., Beer, D. D., Scott, H. L., Boyle, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flowing+biofilms+as+a+transport+mechanism+for+biomass+through+porous+media+under+laminar+and+turbulent+conditions+in+a+laboratory+reactor+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biofouling%22%5BJournal%5D)">Flowing biofilms as a transport mechanism for biomass through porous media under laminar and turbulent conditions in a laboratory reactor system.</a> Biofouling. 21 (3-4), 161-168 (2005).</li>
<li>Ludemann, H., Arth, I., Liesack, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+changes+in+the+bacterial+community+structure+along+a+vertical+oxygen+gradient+in+flooded+paddy+soil+cores%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Spatial changes in the bacterial community structure along a vertical oxygen gradient in flooded paddy soil cores.</a> Applied and Environmental Microbiology. 66 (2), 754-762 (2000).</li>
<li>Sicard, J. F., Bihan, G. L., Vogeleer, P., Jacques, M., Harel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+intestinal+bacteria+with+components+of+the+intestinal+mucus%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Interactions of intestinal bacteria with components of the intestinal mucus.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 387(2017).</li>
<li>Grice, E. A., Segre, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+skin+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The skin microbiome.</a> Nature Reviews Microbiology. 9 (4), 244-253 (2011).</li>
<li>Balzan, S., Quadros, C. D. A., Cleva, R. D., Zilberstein, B., Cecconello, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+translocation%3A+Overview+of+mechanisms+and+clinical+impact%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Bacterial translocation: Overview of mechanisms and clinical impact.</a> Journal of Gastroenterology and Hepatology. 22 (4), 464-471 (2007).</li>
<li>Chaban, B., Hughes, H. V., Beeby, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+flagellum+in+bacterial+pathogens%3A+For+motility+and+a+whole+lot+more%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The flagellum in bacterial pathogens: For motility and a whole lot more.</a> Seminars in Cell & Developmental Biology. 46, 91-103 (2015).</li>
<li>Datta, S. S., Steinberg, A. P., Ismagilov, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymers+in+the+gut+compress+the+colonic+mucus+hydrogel%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Polymers in the gut compress the colonic mucus hydrogel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (26), 7041-7046 (2016).</li>
<li>Harman, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+heterogeneous+motility+of+the+Lyme+disease+spirochete+in+gelatin+mimics+dissemination+through+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">The heterogeneous motility of the Lyme disease spirochete in gelatin mimics dissemination through tissue.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (8), 3059-3064 (2012).</li>
<li>Ribet, D., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+bacterial+pathogens+colonize+their+hosts+and+invade+deeper+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+and+Infection%22%5BJournal%5D)">How bacterial pathogens colonize their hosts and invade deeper tissues.</a> Microbes and Infection. 17 (3), 173-183 (2015).</li>
<li>Siitonen, A., Nurminen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+motility+is+a+colonization+factor+in+experimental+urinary+tract+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Bacterial motility is a colonization factor in experimental urinary tract infection.</a> Infection and Immunity. 60 (9), 3918-3920 (1992).</li>
<li>Lux, R., Miller, J. N., Park, N. H., Shi, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motility+and+chemotaxis+in+tissue+penetration+of+oral+epithelial+cell+layers+by+Treponema+denticola%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Motility and chemotaxis in tissue penetration of oral epithelial cell layers by Treponema denticola.</a> Infection and Immunity. 69 (10), 6276-6283 (2001).</li>
<li>O’Neil, H. S., Marquis, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Listeria+monocytogenes+flagella+are+used+for+motility%2C+not+as+adhesins%2C+to+increase+host+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Listeria monocytogenes flagella are used for motility, not as adhesins, to increase host cell invasion.</a> Infection and Immunity. 74 (12), 6675-6681 (2006).</li>
<li>Gill, C. O., Penney, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Penetration+of+bacteria+into+meat%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Penetration of bacteria into meat.</a> Applied and Environmental Microbiology. 33 (6), 1284-1286 (1977).</li>
<li>Shirai, H., Datta, A. K., Oshita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Penetration+of+aerobic+bacteria+into+meat%3A+A+mechanistic+understanding%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Food+Engineering%22%5BJournal%5D)">Penetration of aerobic bacteria into meat: A mechanistic understanding.</a> Journal of Food Engineering. 196, 193-207 (2017).</li>
<li>Thornlow, D. N., Brackett, E. L., Gigas, J. M., Dessel, N. V., Forbes, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+enhancement+of+bacterial+motility+increases+tumor+penetration%3A+Motility+enhances+bacterial+tumor+penetration%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Persistent enhancement of bacterial motility increases tumor penetration: Motility enhances bacterial tumor penetration.</a> Biotechnology and Bioengineering. 112 (11), 2397-2405 (2015).</li>
<li>Toley, B. J., Forbes, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motility+is+critical+for+effective+distribution+and+accumulation+of+bacteria+in+tumor+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">Motility is critical for effective distribution and accumulation of bacteria in tumor tissue.</a> Integrative Biology. 4 (2), 165-176 (2011).</li>
<li>Dechesne, A., Wang, G., Gülez, G., Or, D., Smets, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydration-controlled+bacterial+motility+and+dispersal+on+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Hydration-controlled bacterial motility and dispersal on surfaces.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (32), 14369-14372 (2010).</li>
<li>de Souza, R., Ambrosini, A., Passaglia, L. M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+growth-promoting+bacteria+as+inoculants+in+agricultural+soils%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Plant growth-promoting bacteria as inoculants in agricultural soils.</a> Genetics and Molecular Biology. 38 (4), 401-419 (2015).</li>
<li>Turnbull, G. A., Morgan, J. A. W., Whipps, J. M., Saunders, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+bacterial+motility+in+the+survival+and+spread+of+Pseudomonas+fluorescens+in+soil+and+in+the+attachment+and+colonisation+of+wheat+roots%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Ecology%22%5BJournal%5D)">The role of bacterial motility in the survival and spread of Pseudomonas fluorescens in soil and in the attachment and colonisation of wheat roots.</a> FEMS Microbiology Ecology. 36 (1), 21-31 (2001).</li>
<li>Watt, M., Kirkegaard, J. A., Passioura, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhizosphere+biology+and+crop+productivity%E2%80%94a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+Research%22%5BJournal%5D)">Rhizosphere biology and crop productivity—a review.</a> Soil Research. 44 (4), 299-317 (2006).</li>
<li>Adadevoh, J. S. T., Ramsburg, C. A., Ford, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+Increases+the+Retention+of+Bacteria+in+Porous+Media+with+Residual+NAPL+Entrapment%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis Increases the Retention of Bacteria in Porous Media with Residual NAPL Entrapment.</a> Environmental Science & Technology. 52 (13), 7289-7295 (2018).</li>
<li>Adadevoh, J. S. T., Triolo, S., Ramsburg, C. A., Ford, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+Increases+the+Residence+Time+of+Bacteria+in+Granular+Media+Containing+Distributed+Contaminant+Sources%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis Increases the Residence Time of Bacteria in Granular Media Containing Distributed Contaminant Sources.</a> Environmental Science & Technology. 50 (1), 181-187 (2016).</li>
<li>Ford, R. M., Harvey, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+chemotaxis+in+the+transport+of+bacteria+through+saturated+porous+media%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Water+Resources%22%5BJournal%5D)">Role of chemotaxis in the transport of bacteria through saturated porous media.</a> Advances in Water Resources. 30 (6-7), 1608-1617 (2007).</li>
<li>Wang, M., Ford, R. M., Harvey, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupled+effect+of+chemotaxis+and+growth+on+microbial+distributions+in+organic-amended+aquifer+sediments%3A+Observations+from+laboratory+and+field+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Coupled effect of chemotaxis and growth on microbial distributions in organic-amended aquifer sediments: Observations from laboratory and field studies.</a> Environmental Science & Technology. 42 (10), 3556-3562 (2008).</li>
<li>Amchin, D. B., Ott, J. A., Bhattacharjee, T., Datta, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+confinement+on+the+spreading+of+bacterial+populations%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">Influence of confinement on the spreading of bacterial populations.</a> PLoS Computational Biology. 18 (5), e1010063(2022).</li>
<li>Moore-Ott, J. A., Chiu, S., Amchin, D. B., Bhattacharjee, T., Datta, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biophysical+threshold+for+biofilm+formation%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A biophysical threshold for biofilm formation.</a> eLife. 11, e76380(2022).</li>
<li>Tittsler, R. P., Sandholzer, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+semi-solid+agar+for+the+detection+of+bacterial+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">The use of semi-solid agar for the detection of bacterial motility.</a> Journal of Bacteriology. 31 (6), 575-580 (1936).</li>
<li>Bhattacharjee, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyelectrolyte+scaling+laws+for+microgel+yielding+near+jamming%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Polyelectrolyte scaling laws for microgel yielding near jamming.</a> Soft Matter. 14 (9), 1559-1570 (2018).</li>
<li>Bhattacharjee, T., Datta, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confinement+and+activity+regulate+bacterial+motion+in+porous+media%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Confinement and activity regulate bacterial motion in porous media.</a> Soft Matter. 15 (48), 9920-9930 (2019).</li>
<li>Bhattacharjee, T., Datta, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+hopping+and+trapping+in+porous+media%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Bacterial hopping and trapping in porous media.</a> Nature Communications. 10 (1), 2075(2019).</li>
<li>Bhattacharjee, T., Amchin, D. B., Ott, J. A., Kratz, F., Datta, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotactic+migration+of+bacteria+in+porous+media%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Chemotactic migration of bacteria in porous media.</a> Biophysical Journal. 120 (16), 3483-3497 (2021).</li>
<li>Bhattacharjee, T., Amchin, D. B., Alert, R., Ott, J. A., Datta, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotactic+smoothing+of+collective+migration%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Chemotactic smoothing of collective migration.</a> eLife. 11, e71226(2022).</li>
<li>Tashman, J. W., Shiwarski, D. J., Feinberg, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+performance+open-source+syringe+extruder+optimized+for+extrusion+and+retraction+during+FRESH+3D+bioprinting%5BTitle%5D)+AND+%22HardwareX%22%5BJournal%5D)">A high performance open-source syringe extruder optimized for extrusion and retraction during FRESH 3D bioprinting.</a> HardwareX. 9, e00170(2021).</li>
<li>Crocker, J. C., Grier, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+digital+video+microscopy+for+colloidal+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Colloid+and+Interface+Science%22%5BJournal%5D)">Methods of digital video microscopy for colloidal studies.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 179 (1), 298-310 (1996).</li>
<li>Chatterjee, T., Chatterjee, B. K., Chakrabarti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+of+growth+kinetics+of+Vibrio+cholerae+in+presence+of+gold+nanoparticles%3A+Effect+of+size+and+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Modelling of growth kinetics of Vibrio cholerae in presence of gold nanoparticles: Effect of size and morphology.</a> Scientific Reports. 7 (1), 9671(2017).</li>
<li>Martínez-Calvo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+instability+and+roughening+of+growing+3D+bacterial+colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Morphological instability and roughening of growing 3D bacterial colonies.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (43), e2208019119(2022).</li>
<li>Lehner, B. A. E., Schmieden, D. T., Meyer, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Straightforward+approach+for+3D+bacterial+printing%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">A Straightforward approach for 3D bacterial printing.</a> ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1124-1130 (2017).</li>
<li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+and+cell+ordering+in+confined+bacterial+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis and cell ordering in confined bacterial biofilms.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (31), e2107107118(2021).</li>
</ol>

הפלטפורמה הניסיונית המשמשת להדפסה תלת-ממדית ולהדמיה של קהילות חיידקים בפרסום זה היא הנושא של בקשת פטנט שהוגשה על ידי אוניברסיטת פרינסטון בשם Tapomoy Bhattacharjee ו- S.S.D. (PCT Application number PCT/US/2020/030213).

שלבים קריטיים בפרוטוקול חשוב לוודא כי בעת הכנת כל מטריצת הידרוג'ל, המטריצה נעשית בסביבה סטרילית. אם לא, זיהום יכול להתרחש, אשר מתבטא, למשל, microcolonies (ספרואידים קטנים) במטריצה לאחר מספר ימים. במהלך תהליך הערבוב, חשוב שכל חלקיקי ההידרוג'ל הגרגיריים היבשים יומסו. בנוסף, בעת התאמת ה- pH של כל מטריצת הידרוג'ל עם NaOH, הגרגירים יתחילו להתנפח, מה שמגדיל את צמיגות מטריצת ההידרוג'ל, מה שמוביל לערבוב קשה יותר. שימוש במיקסר המעמד יעזור להבטיח שה-NaOH מעורבב היטב במטריצת ההידרוג'ל. במהלך ההעמסה של כל מתלה חיידקי, כיסי אוויר יכולים להיווצר במחט. כדי להימנע מבעיה זו, ודא שקצה המחט יושב תמיד בתרחיף החיידקי בצינור הצנטריפוגה ולא בתחתית הצינור או ליד המשטח העליון. דרך נוספת להתגבר על בעיה זו היא לגדל כמויות גדולות של תאים ובכך יש נפחים גדולים יותר של תרחיף חיידקים להדפסה.
מגבלות כיום, במהלך ההדפסה, הצמיגות הנמוכה של תרחיף החיידקים מגבילה את הגיאומטריות שניתן להדפיס ולעתים קרובות מובילה להיווצרות ביופילם ולגידול על גבי משטח מטריצת ההידרוג'ל עקב תאי קורט. ישנן מספר שיטות אפשריות להתגבר על מגבלה זו, כולל הגדלת צמיגות המתלה החיידקי או מיטוב נוסף של הגדרות מדפסת התלת-ממד. כדי להגביר את צמיגות התרחיף החיידקי, ניתן לערבב את התרחיף החיידקי עם פולימר אחר - לדוגמה, אלגינט, ששימש בעבר להדפסה תלת-ממדית של חיידקים על משטחים שטוחים38. ניתן למטב עוד יותר את הגדרות המדפסת כדי לאפשר נסיגה של בוכנת המזרק במהלך משיכת המחט ממטריצת ההידרוג'ל הגרגירית, דבר שיהיה בעל פוטנציאל לעצור את שקיעת התאים במהלך הסרת המחט ממטריצת ההידרוג'ל.
משמעות השיטה ביחס לשיטות קיימות/חלופיות השיטה המתוארת כאן מאפשרת הדפסה של מושבות חיידקים למטריצות הידרוג'ל גרגיריות. מטריצות ההידרוג'ל הגרגיריות מאפשרות לחקור את ההשפעה של גורמים סביבתיים חיצוניים (למשל, גודל נקבוביות, עיוות מטריצה) על תנועתיות וגדילה של חיידקים. בנוסף, בעוד בעבודה זו, LB משמש כמדיום הגידול הנוזלי כדי לנפח את מטריצת הידרוג'ל, מטריצת הידרוג'ל יכול להיות נפוח עם מדיה צמיחה נוזלית אחרת, כולל מדיה עם אנטיביוטיקה. שיטות קודמות לחקר חיידקים בסביבות סגורות הוגבלו על ידי משך זמן הניסוי, גודל רשת הפולימר וקשיחות מטריצת ההידרוג'ל שמסביב37,38. פרוטוקולים כבר קיימים לייצור מטריצות הידרוג'ל גרגיריות מפולימרים שונים, כך שהפוטנציאל לחקר ההשפעות של תנאי סביבה שונים על תנועתיות וגדילה של חיידקים הוא עצום. שיטה זו מאפשרת לחקור חיידקים בסביבות בקרה שמחזירות בקלות רבה יותר את הסביבות שבהן חיידקים חיים בעולם האמיתי, כגון ריר פונדקאי או אדמה. מגבלה נוספת של שיטות רבות אחרות היא האטימות של המטריצה הסובבת; עם זאת, גישה זו באמצעות חומרים שקופים אופטית מספקת את היכולת לחקור, למשל, בקרה אופטוגנטית ודפוסים של חיידקים בתלת-ממד.
מעבר לחקר תנועתיות וצמיחה, שיטת ההדפסה התלת-ממדית המתוארת כאן מתגברת על מגבלותיהן של שיטות ביו-הדפסה רבות אחרות הדורשות שיקוע של ביו-דיו על מצע ולכן הן מוגבלות בגובה החומר החי המהונדס שהן יכולות לייצר. בעתיד, פרוטוקול הדפסה ביולוגית זה יכול להיות מורחב עוד יותר לייצור חומרים ביו-היברידיים על ידי ערבוב פולימרים עם תאים יוצרי ביופילם. מטריצות ההידרוג'ל הגרגיריות מספקות תמיכה בהדפסה תלת-ממדית של חומרים חיים מהונדסים עבים יותר בקנה מידה גדול יותר וגיאומטריות מורכבות יותר מאשר שיטות רבות אחרות להדפסה ביולוגית של חיידקים כיום. בעוד שעבודה זו השתמשה רק ב - V. cholerae ו - E. coli, מינים אחרים, כגון Pseudomonas aeruginosa, הודפסו בהצלחה גם הם בתלת-ממד37. מעבר להדפסה, ניתן להתאים את המדפסת לביצוע דגימה מבוקרת של חיידקים לאחר הגדילה כדי לראות אם חלו שינויים גנטיים, למשל.

חיידקים מאכלסים לעתים קרובות סביבות נקבוביות תלת-ממדיות מגוונות ומורכבות, החל מג'לים ריריים במעיים ובריאות, וכלה באדמה 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15, 16,17,18,19,20,21, 22,23,24,25. בסביבות אלה, תנועת חיידקים באמצעות תנועתיות או גדילה יכולה להיות מעוכבת על ידי מכשולים מסביב, כגון רשתות פולימרים או אריזות של גרגרי מינרלים מוצקים - המשפיעים על יכולתם של התאים להתפשט בסביבתם26, לגשת למקורות מזון, ליישב שטחים חדשים וליצור קהילות ביופילם מגינות27. עם זאת, מחקרי מעבדה מסורתיים משתמשים בדרך כלל בגיאומטריות פשוטות מאוד, תוך התמקדות בתאים בתרביות נוזליות או על משטחים שטוחים. בעוד שגישות אלה מניבות תובנות מפתח על מיקרוביולוגיה, הן אינן משחזרות באופן מלא את המורכבות של בתי גידול טבעיים, מה שמוביל להבדלים דרמטיים בקצב הצמיחה ובהתנהגות התנועתיות בהשוואה למדידות שבוצעו בסביבות בעולם האמיתי. לכן, יש צורך קריטי בשיטה להגדיר מושבות חיידקים ולחקור את תנועתיותן וצמיחתן בסביבות נקבוביות תלת-ממדיות הדומות יותר לרבים מבתי הגידול הטבעיים שלהן.
חיסון תאים לג'ל אגר ולאחר מכן הדמיה של התפשטותם המקרוסקופית בעין או באמצעות מצלמה מספק דרך פשוטה אחת להשיג זאת, כפי שהוצע לראשונה על ידי טיטסלר וסנדהולצר בשנת 193628. עם זאת, גישה זו סובלת ממספר אתגרים טכניים מרכזיים: (1) בעוד שגודל הנקבוביות יכול, באופן עקרוני, להשתנות על ידי שינוי ריכוז האגרוז, מבנה הנקבוביות של ג'לים כאלה מוגדר בצורה גרועה; (2) פיזור אור גורם לג'לים אלה להיות עכורים, מה שמקשה על הדמיה של תאים בקנה מידה אינדיבידואלי ברזולוציה גבוהה ובאמינות, במיוחד בדגימות גדולות; (3) כאשר ריכוז האגר גדול מדי, נדידת התאים מוגבלת למשטח השטוח העליון של הג'ל; (4) הריאולוגיה המורכבת של ג'לים כאלה מקשה על החדרת אינוקולה עם גיאומטריות מוגדרות היטב.
כדי להתמודד עם מגבלות אלה, בעבודה קודמת, פיתחה מעבדתו של דאטה גישה חלופית המשתמשת במטריצות הידרוג'ל גרגיריות - המורכבות מחלקיקי הידרוג'ל תקועים ותואמים ביולוגית הנפוחים בתרבית חיידקים נוזלית - כ"צלחות פטרי נקבוביות" לכליאת תאים בתלת-ממד. מטריצות אלה הן מוצקים רכים, בעלי יכולת ריפוי עצמי, מניבים עקה; לכן, שלא כמו עם ג'לים צולבים המשמשים בתהליכי הדפסה ביולוגית אחרים, מיקרו-זרבובית הזרקה יכולה לנוע בחופשיות בתוך המטריצה לאורך כל נתיב תלת-ממדי שנקבע על ידי סידור מחדש מקומי של חלקיקי ההידרוג'ל29. חלקיקים אלה מתצטופפים מחדש במהירות ומרפאים את עצמם סביב חיידקים מוזרקים, ותומכים בתאים במקומם ללא כל עיבוד מזיק נוסף. תהליך זה הוא, אם כן, סוג של הדפסה תלת-ממדית המאפשרת לסדר תאי חיידקים - במבנה תלת-ממדי רצוי, עם הרכב קהילתי מוגדר - בתוך מטריצה נקבובית בעלת תכונות פיסיקוכימיות. יתר על כן, מטריצות ההידרוג'ל שקופות לחלוטין, ומאפשרות להמחיש את התאים ישירות באמצעות הדמיה.
התועלת של גישה זו הודגמה בעבר בשתי דרכים. בקבוצה אחת של מחקרים, תאים מדוללים פוזרו ברחבי מטריצת הידרוג'ל, מה שאפשר מחקרים על תנועתיות של חיידקים בודדים30,31. בסדרת מחקרים אחרת, קהילות רב-תאיות הודפסו בתלת-ממד בג'לים בקנה מידה של סנטימטר באמצעות פיית הזרקה שהורכבה על שלב מיקרוסקופ ניתן לתכנות, שאפשרה מחקרים על התפשטות קולקטיבים חיידקיים בסביבתם32,33. בשני המקרים, מחקרים אלה חשפו הבדלים שלא היו ידועים בעבר במאפייני ההתפשטות של חיידקים המאכלסים סביבות נקבוביות בהשוואה לאלה בתרבית נוזלית / על משטחים שטוחים. עם זאת, בהתחשב בכך שהם הותקנו על שלב המיקרוסקופ, מחקרים קודמים אלה היו מוגבלים לנפחי מדגם קטנים (~ 1 מ"ל), ולכן, סקאלות זמן ניסוי קצרות. הם גם היו מוגבלים ביכולתם להגדיר גאומטריות אינוקולה ברזולוציה מרחבית גבוהה.
כאן מתואר הדור הבא של פלטפורמה ניסיונית זו המתייחסת לשתי המגבלות. באופן ספציפי, פרוטוקולים מסופקים שבאמצעותם ניתן להשתמש במדפסת תלת ממד שונה עם מכבש מזרק מחובר להדפסת תלת מימד ומושבות חיידקים תמונה בקנה מידה גדול. יתר על כן, נתונים מייצגים מצביעים על האופן שבו גישה זו יכולה להיות שימושית לחקר תנועתיות וצמיחה של חיידקים, תוך שימוש בביופילם לשעבר Vibrio cholerae ו פלנקטוני Escherichia coli כדוגמאות. גישה זו מאפשרת לקיים מושבות חיידקים לאורך זמן ולהמחיש אותן באמצעות טכניקות הדמיה שונות. לפיכך, ליכולתה של גישה זו לחקור קהילות חיידקים בבתי גידול נקבוביים תלת-ממדיים יש פוטנציאל מחקרי ויישומי עצום, המשפיעים על הטיפול והמחקר של מיקרובים במעיים, בעור, בריאה ובאדמה. יתר על כן, גישה זו יכולה לשמש בעתיד להדפסה תלת-ממדית של חומרים חיים מהונדסים מבוססי חיידקים לצורות מורכבות יותר העומדות בפני עצמן.

<table><tbody><tr><td>1 מ"ל קובטות</td><td>VWR</td><td>97000-586</td><td></td></tr><tr><td>1 מ"ל מזרק נעילת לואר</td><td>BH אספקה</td><td>BH1LL</td><td></td></tr><tr><td>10 מ' NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>72068</td><td></td></tr><tr><td>ננו-חלקיקי פוליסטירן פלואורסצנטיים קרבוקסציליים 100 ננומטר (FluoSpheres)&nbsp;</td><td>&nbsp; Invitrogen, (ThermoFischer Scientific)</td><td> F8803</td><td></td></tr><tr><td>15 מ"ל צינורות צנטריפוגה</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>14-955-237</td><td></td></tr><tr><td>20 G מחט קהה</td><td>McMaster Carr</td><td>75165A252</td><td></td></tr><tr><td>25 מ"ל צלוחיות תרבית רקמות</td><td>VWR</td><td>10861-566</td><td></td></tr><tr><td>מדפסת תלת מימד</td><td>Lulzbot</td><td>LulzBot Mini 2</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת הדפסת תלת מימד</td><td>Cura</td><td>Cura-Lulzbot</td><td></td></tr><tr><td>צינורות צנטריפוגה 50 מ"ל</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>14-955-239</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1296</td><td></td></tr><tr><td>חלקיקי הידרוג'ל גרגירי קרבומר</td><td>חומר סיכה&nbsp;</td><td>Carbopol 980NF</td><td>גרגירים יבשים של חומצה אקרילית צולבת / אלקיל אקרילט קופולימרים</td></tr><tr><td>צנטריפוגה (קיבולת צינור 2 מ"ל)</td> צנטריפוגה <td>VWR</td><td>2405-37</td><td></td></tr><tr><td>(קיבולת צינור 50 מ"ל)</td> <td>ThermoFischer Scientific</td><td>75007200</td><td>Sorvall (מותג) ST 8 (דגם)</td></tr> <tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי</td><td>Nikon</td><td>A1R+ לייזר הפוך סריקה מיקרוסקופ</td><td></td>קונפוקלי</tr><tr><td>תחתית זכוכית צלחת</td><td>פטרי Cellvis</td><td>D35-10-1-N</td><td></td></tr><tr><td>Lennox LB (מרק לובריה)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3022</td><td></td></tr><tr><td>M8 ופעמים; 1.25 מ"מ, אורך 150 מ"מ, מכסה שקע הברגה מלא</td><td>McMaster Carr</td><td>91290A478</td><td></td></tr><tr><td>M8 וזמנים; 1.25 מ"מ, אגוז משושה דק פליז</td><td>McMaster Carr</td><td>93187A300</td><td></td></tr><tr><td>משאבת מזרק בקוד פתוח</td><td>Replistruder 4</td><td></td> <td>בהתאמה אישית</td></tr><tr><td>צלחת פטרי https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2468067220300791 (עגולה 60 מ"מ)</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>ריאומטר גזירה</td><td>אנטון פאר</td><td>MCR 501</td><td></td></tr><tr><td>מנקה אולטרסאונד</td><td>VWR</td><td>97043-992</td><td></td></tr></tbody></table>

הדפסת חיידקים בתלת-ממד לחקר תנועתיות וצמיחה במדיה נקבובית תלת-ממדית מורכבת

3D Printing Bacteria to Study Motility and Growth in Complex 3D Porous Media

חיידקים נמצאים בכל מקום בסביבות נקבוביות תלת-ממדיות (תלת-ממדיות) מורכבות, כגון רקמות וג'לים ביולוגיים, קרקעות ומשקעים תת-קרקעיים. עם זאת, רוב העבודות הקודמות התמקדו במחקרים של תאים בנוזלים בתפזורת או על משטחים שטוחים, אשר אינם משקפים באופן מלא את המורכבות של בתי גידול חיידקיים טבעיים רבים. כאן, פער הידע הזה מטופל על ידי תיאור הפיתוח של שיטה להדפיס בתלת-ממד מושבות צפופות של חיידקים לתוך מטריצות הידרוג'ל גרגיריות תקועות. למטריצות אלה יש גודל נקבוביות מתכוונן ותכונות מכניות; הם כולאים פיזית את התאים, ובכך תומכים בהם בתלת-ממד. הם שקופים אופטית, ומאפשרים הדמיה ישירה של התפשטות חיידקים בסביבתם באמצעות הדמיה. כהוכחה לעיקרון זה, כאן, היכולת של פרוטוקול זה מודגמת על ידי הדפסה תלת ממדית והדמיה של Vibro cholerae שאינו נע ותנועתי, כמו גם Escherichia coli שאינו נע, במטריצות הידרוג'ל גרגיריות תקועות עם גדלים שונים של נקבוביות interstitial.

פרוטוקול זה מתאר הליך להדפסה תלת-ממדית (תלת-ממדית) של מושבות חיידקים כדי לחקור את תנועתיותן וצמיחתן במטריצות הידרוג'ל נקבוביות תלת-ממדיות מורכבות הדומות יותר לבתי הגידול הטבעיים שלהן מאשר תרביות נוזליות קונבנציונליות או צלחות פטרי.

Bacteria are ubiquitous in complex three-dimensional (3D) porous environments, such as biological tissues and gels, and subsurface soils and sediments. ...

חיידקים נמצאים בכל מקום בסביבות מורכבות, תלת-ממדיות ונקבוביות כגון רקמות וג'לים ביולוגיים וקרקעות ומשקעים תת-קרקעיים. כאן אנו מפתחים שיטה להדפסה תלת-ממדית של מושבות צפופות של חיידקים לתוך מטריצות הידרוג'ל גרגיריות תקועות כדי לחקור את הצמיחה והתנועתיות שלהם בסביבות מורכבות. מחקרים גילו הבדלים שלא היו ידועים בעבר במאפייני ההתפשטות של חיידקים המאכלסים סביבות נקבוביות בהשוואה לאלה שבתרביות נוזליות על משטחים שטוחים.פיתוח שימוש במטריצות הידרוג'ל גרגיריות המורכבות מחלקיקי הידרוג'ל ביו-תואמים תקועים הנפוחים בתרבית חיידקים נוזלית כצלחות פטרי נקבוביות לכליאת תאים בתלת ממד. מחקרים קודמים היו מוגבלים לנפחי מדגם קטנים של כמ"ל אחד, ולכן לסקאלות זמן ניסוייות קצרות, וגם היו מוגבלים ביכולתם להגדיר גיאומטריות אינוקולה ברזולוציה מרחבית גבוהה. קבענו שמאפייני התפשטות התאים של החיידקים תלויים בגודל הנקבוביות ובתנועתיות התא.

3d-printing-bacteria-to-study-motility-growth-complex-3d-porous

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

מקור: שיידוויילר, ד., ואחרים. שילוב מכשירים נוזליים עם מיקרוסקופיה וציטומטריית זרימה לחקר הובלה מיקרוביאלית במדיה נקבובית בקנה מידה מרחבי. J. Vis. Exp. (2020).הסרטון הזה מדגים את השימוש במכשיר מיקרופלואידי לכימות תנועתיות חיידקית באמצעות מטריצה נקבובית המורכבת מעמודים מסודרים באקראי. חיידקים מסומנים פלואורסצנטית מוכנסים למכשיר, מצולמים במיקרוסקופיה כשהם נעים דרך המטריצה הנקבובית אל ערוץ התצפית, ומנותחים ליצירת עקומת פריצת דרך (BTC).

הערכת תנועתיות חיידקית באמצעות מכשיר מיקרופלואידי

אנו מתארים שיטה לבניית התקנים לתרבות תלת-ממדית ולניסויים בתאים ובאורגנואידים רב-תאיים. התקן זה מאפשר ניתוח של תגובות הסלולר אותות מסיסים בסביבות תלת-ממד עם מעברי צבע כימותסטנט מוגדרים. אורגנואידים הם טובים יותר מאשר תאים בודדים בזיהוי של כניסות רעש חלש.

ניתוח תלת-מימד של תגובות מרובות-סלולר לקבוצת מעברי כימוסטנט

מאמר זה מתאר שיטה להפיכת מדפסת תלת-ממד מסחרית בעלות נמוכה למדפסת תלת-ממדית חיידקית, היכולה להקל על הדפסה של מאפייני בדוגמת מילוי. כל ההיבטים הנחוצים של הכנת הביופלקטר והביו-דיו מתוארים, כמו גם שיטות אימות להערכת היווצרות ביואילאמים.

המשך תלת-מימדי של ביוריאמים מהונדסים עם מעשה-זה-בעצמך ביורינטר

פרוטוקול לדור של נופים כימיים דינמיים על ידי פוטוליזה בתוך microfluidic והגדרות מיליפלואידיג מוצג. מתודולוגיה זו מתאימה לחקר תהליכים ביולוגיים מגוונים, כולל התנהגות נעים, ספיגת מזינים, או הסתגלות לכימיקלים של מיקרואורגניזמים, הן בתא יחיד ברמת האוכלוסייה.

יצירת מבוקרת, נופים כימיים דינמי ללמוד התנהגות מיקרוביאלית

עקומות פורצות דרך (BTCs) הן כלים יעילים לחקר הובלת חיידקים במדיה נקבובית. כאן אנו מציגים כלים המבוססים על התקנים נוזליים בשילוב עם מיקרוסקופיה וספירת ציטומטרית זרימה כדי להשיג BTCs.

שילוב התקנים נוזליים עם מיקרוסקופיה וציתום זרימה לחקר תחבורה מיקרוביאלית במדיה נקבובית על פני קשקשים מרחביים

צוואר הבקבוק במיקרוסקופ האלקטרונים 3D סלולארי הוא הבלטת תכונות (פילוח) במפות צפיפות 3D המורכבות ביותר. פיתחנו סדרה של קריטריונים, אשר מספקת הנחיות באשר אשר גישת פילוח (ידנית, חצי אוטומטי, או אוטומטי) היא מתאים ביותר עבור סוגי נתונים שונים, ובכך לספק נקודה מוצא לפילוח יעיל.

מvoxels לידע: מדריך מעשי לפילוח אלקטרונים מורכבים מיקרוסקופית 3D-Data

קולגן הוא רכיב ליבה של ECM, ומספק רמזים חיוניים מספר תהליכים תאיים החל הגירת בידול ושגשוגם. הניתן כאן הוא פרוטוקול להטבעת תאים בתוך הידרוג קולגן 3D, טכניקה מתקדמת יותר ליצירת מטריצות קולגן אקראי או מיושר באמצעות microchannels PDMS.

הכנת ג&#39;לי 3D קולגן microchannels לחקר אינטראקציות 3D<em&gt; In vivo</em

פרוטוקול זה מתאר כיצד להכין מטריצה ​​מעורבת 2D, המורכב של ג 'לטין קולגן אני, קולגן 3D אני תקע ללימוד invadosomes ליניארי. פרוטוקולים אלה מאפשרים את המחקר של היווצרות invadosome ליניארי, פעילות מטריקס השפלה, ויכולות הפלישה של תאים ראשוניים שורות תאים סרטניים.

2D ו 3D מטריצות לחקר Invadosome לינארי גיבוש ופעילות

תחליפי הסחוס ואת העור היו bioprinted באמצעות bioink של nanocellulose-קילוף פלסטיצידיות מבוסס. Bioinks היו cellularized לפני ההדפסה באמצעות יחידת ערבול פסיבי צעד בודד. המבנה היו הפגינו להיות cellularized בצורה אחידה, יש גבוהה הכדאיות של התערוכה סמנים חיובית של בידול.

Bioprinting של הסחוס, תחליפי רקמת העור ניצול פסיבים הרומן ערבוב טכניקה יחידה עבור Bioink Precellularization

פרוטוקול זה מתאר את הייצור של polycaprolactone (PCL) נימה עם microspheres חומצה (PLA) polylactic מוטבע אשר מכילים decellularized מטריצות (DM) עבור הדפסת תלת-ממד של רקמות מבניות הנדסת מבנים.

הרומן תהליך הדפסת תלת-ממד Decellularized מטריצות

למדו הדפסת תלת-ממד של מושבות חיידקים במטריצות הידרוגל גרנולריות לחקר תנועתיות וצמיחה. השיטה מאפשרת לחקור התנהגות חיידקים בסביבות נקבוביות מורכבות המחקות בתי גידול טבעיים.

הדפסת חיידקים בתלת-ממד לחקר תנועתיות וצמיחה במדיה נקבובית תלת-ממדית מורכבת

גלה סרטונים נוספים