ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (R03NS131908) ומשרד ההגנה באמצעות תוכנית המחקר לטרשת נפוצה תחת פרס מס 'W81XWH-22-1-0517. דעות, פרשנויות, מסקנות והמלצות הן של המחבר ואינן בהכרח מאושרות על ידי משרד ההגנה. מחקר זה נתמך גם על ידי קרנות סטארט-אפ של אוניברסיטת מזרח קרוליינה.

כל ההליכים המערבים עכברים בוצעו בהתאם להנחיות הניסוי שאושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת מזרח קרוליינה (IACUC). במחקר זה נעשה שימוש בנקבות עכברי Wildtype C57BL/6J בגילאי 8-10 שבועות. בעלי החיים התקבלו ממקור מסחרי (ראו טבלת חומרים). EAE הושרה בעקבות דוחות שפורסמו בעבר 12,13,14.
1. קולקציית סרום
<ol><li>הרדימו את עכבר הניסוי על ידי חנקCO2 או מנת יתר של איזופלורן בנקודת הזמן הנדרשת (בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי מוסדות) לאחר השראת EAE באמצעות חיסון MOG35-55. הערה: המספר הכולל של עכברים ונקודות זמן לאיסוף נסיוב יכול להשתנות בהתאם לניסוי הספציפי.</li>
	<li>לאחר היעדר סימנים חיוניים הוא אישר על ידי צביטת הבוהן או הזנב, מניחים את העכבר במצב שכיבה גבי על מגש דיסקציה ומדביקים את הגפיים במקומו עם סיכות או קלטת. כוון את גוף העכבר למקור אור LED (ראה טבלת חומרים) כדי להאיר את בית החזה של החיה.</li>
	<li>רססו את פרוות העכבר באתנול 70% ובצעו חתך בקו האמצע של 3-4 ס"מ לאורך הבטן מהאגן ועד לקסיפואיד באמצעות מספריים לכריתה, תוך הקפדה להימנע מכל איברים וכלי דם עיקריים (איור 1A-C). כדי להקל על ההליך, השתמש במלקחיים כדי לתפוס את העור על תהליך xiphoid.</li>
	<li>חתכו דרך הסרעפת לרוחב ואז חתכו את כלוב הצלעות קדמית בשני הקצוות הרוחביים באמצעות מספריים קפיציים, ועצרו לפני שתגיעו לעצם החזה בקו האמצע (איור 1D). קפלו את דש הצלעות שנוצר מעל ראש העכבר כדי לחשוף את הלב (איור 1E). הערה: יש להימנע מחיתוך עצם החזה מכיוון שהדבר יפגע בעורקי החזה הראשיים הסמוכים לעצם ויקטין את נפח הדם שניתן לאסוף.</li>
	<li>הכניסו מחט של 25 גרם שמחוברת למזרק של 1 מ"ל לחדר השמאלי ואספו את הדם על-ידי משיכה עדינה לאחור של הבוכנה (איור 1F). כדי להקל על ניקוב המחט, סד בעדינות את הלב נגד זוג מלקחיים. הערה: אם הדם אינו מופיע מיד לתוך המזרק, המחט צריכה להיות מסובבת לאט, זווית אחרת יש לבדוק. עם זאת, יש לעשות מאמצים למקם את המחט כראוי בניסיון הראשון כדי למנוע יצירת חורים מיותרים בלב שבהם הדם יכול לדלוף החוצה.</li>
	<li>מעבירים את הדם לצינור סטרילי של 1.5 מ"ל ומאפשרים לו להיקרש במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. הסר את הקריש על ידי צנטריפוגה ב 2000 × גרם למשך 20 דקות ב 4 ° C. אספו את הסופרנטנט, המייצג את מקטע הסרום, ואחסנו אליציטוטים חד-פעמיים בצינורות קריוגניים בטמפרטורה של -80°C לבדיקות עתידיות.</li>
</ol>2. בדיקת אליסה
<ol><li>יש להשהות מחדש את הפפטיד MOG35-55 שעבר ליופיליזציה (ראו טבלת חומרים) במים כדי לקבל מלאי של 10 מ"ג/מ"ל. לפני תחילת הניסוי, יש לדלל את הציר ל-10 מיקרוגרם/מ"ל בחיץ ציפוי (ראו טבלת חומרים) ופיפטה 100 מיקרוליטר/באר של התמיסה הסופית לצלחת בת 96 בארות. אטמו את הצלחת בסרט הדבקה כדי למנוע אידוי ודגרו על הצלחת למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C. הערה: יש לחשב לפחות 2 בארות עבור כל מדגם ולכלול גם 2 בארות נוספות עבור בקרה ריקה.</li>
	<li>במקביל, צפו את אותו מספר בארות ב-100 מיקרוליטר/באר של אלבומין בסרום בקר (BSA) המומס בחיץ ציפוי בריכוז של 10 מיקרוגרם/מ"ל. בארות נוספות אלה ישמשו כבקרות רקע. הערה: מומלץ לצפות עם BSA את בארות הבקרה מכיוון שלמאגרי הציפוי והחסימה יש הרכבים שונים. שים לב כי פפטידים אנצפליטוגניים אחרים (כגון PLP139-151 או MBP84-104) יכולים לשמש כאנטיגנים לא רלוונטיים כחלופה ל- BSA.</li>
	<li>ביום שאחרי, שטפו את הצלחת 3 פעמים עם 200 μL/well של מלח חיץ פוספט בתוספת 0.05% Tween 20 (PBS-T). לאחר מכן, יש להוסיף 100 μL/well של תמיסת חסימה העשויה מ-3% BSA ב-PBS (ללא Tween 20) ולדגור על הצלחת אטומה למשך שעה אחת ב-37°C בתנור הכלאה.</li>
	<li>שטפו את הצלחת 3 פעמים עם 200 μL/well של PBS-T. יש לדלל כל דגימת סרום ביחס 1:100 בתמיסת חסימה ולהוסיף 100 μL/well הן לבארות מצופות MOG35-55 והן לבארות מצופות BSA. הוסף את אותו נפח של פתרון חסימה לבארות המיועדות ריקות. דוגרים על הצלחת אטומה למשך שעתיים בטמפרטורת החדר, תוך רעידות קבועות (250 סל"ד).</li>
	<li>שטפו את הצלחת 3 פעמים עם 200 μL/well של PBS-T. לדלל את הנוגדן המשני המצומד HRP (1:2000, ראה טבלת חומרים) בתמיסה העשויה 0.2% BSA ב- PBS-T ולהוסיף 100 μL / באר לכל הבארות. יש לדגור על הצלחת אטומה למשך שעה בטמפרטורת החדר, תוך רעידות קבועות (250 סל"ד).</li>
	<li>שטפו את הצלחת 3 פעמים עם 200 μL/well של PBS-T. הוסף 100 μL / באר של מצע 3,3',5,5' tetramethylbenzidine (TMB) (ראה טבלת חומרים) לכל הבארות ודגר בחושך במשך 1-5 דקות, מעקב אחר התפתחות של צבע כחול.<ol><li>עצור את התגובה על ידי הוספת 100 μL/well של תמיסת עצירה (ראה טבלת חומרים) ומדידת הצפיפות האופטית (OD) בכל באר באמצעות קורא לוחות המוגדר באורך גל של 450 ננומטר. הערה: מצע TMB צריך להיות מאוזן בטמפרטורת החדר במשך 30-60 דקות לפני הוספתו לבארות.</li>
	</ol></li>
</ol>3. ניתוח נתונים
<ol><li>אכלס גיליון אלקטרוני של Excel בערכי OD שנקראו מהצלחת. ממוצע ערכי OD המתקבלים מבארות כפולות (הן MOG35-55 והן BSA מצופה) עבור כל דגימה.</li>
	<li>עבור כל דגימה, הפחת את הערך הממוצע של הבארות מצופות BSA מזה של בארות מצופות MOG35-55. ערכי הרקע המתוקנים שיתקבלו יהיו פרופורציונליים לריכוז נוגדנים נגד MOG35-55 בדגימות הסרום השונות. הערה: בארות ריקות אמורות לגרום לערכים מתוקנים סביב 0.</li>
	<li>החל מבחן סטטיסטי לא פרמטרי כגון מבחן Mann-Whitney U כדי להשוות את ערכי OD ממוצעים בין שני תנאי ניסוי. כלול לפחות 3 דגימות בלתי תלויות עבור כל מצב.</li>
</ol>

חקירת תגובה הומורלית בדמיאלינציה אוטואימונית

<ol><li>Reich, D. S., Lucchinetti, C. F., Calabresi, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Multiple sclerosis.</a> N Engl J Med. 378 (2), 169-180 (2018).</li>
<li>Baranzini, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cell+repertoire+diversity+and+clonal+expansion+in+multiple+sclerosis+brain+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">B cell repertoire diversity and clonal expansion in multiple sclerosis brain lesions.</a> J Immunol. 163 (9), 5133-5144 (1999).</li>
<li>Genain, C. P., Cannella, B., Hauser, S. L., Raine, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+autoantibodies+associated+with+myelin+damage+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Identification of autoantibodies associated with myelin damage in multiple sclerosis.</a> Nat Med. 5 (2), 170-175 (1999).</li>
<li>Ma, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+hypomethylation+programs+underpin+b+cell+activation+in+early+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Specific hypomethylation programs underpin b cell activation in early multiple sclerosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (51), e2111920118(2021).</li>
<li>Hauser, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocrelizumab+versus+interferon+beta-1a+in+relapsing+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Ocrelizumab versus interferon beta-1a in relapsing multiple sclerosis.</a> N Engl J Med. 376 (3), 221-234 (2017).</li>
<li>Montalban, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocrelizumab+versus+placebo+in+primary+progressive+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Ocrelizumab versus placebo in primary progressive multiple sclerosis.</a> N Engl J Med. 376 (3), 209-220 (2017).</li>
<li>Didonna, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+models+of+multiple+sclerosis%3A+Advantages+and+limitations+towards+better+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Preclinical models of multiple sclerosis: Advantages and limitations towards better therapies.</a> Curr Med Chem. 23 (14), 1442-1459 (2016).</li>
<li>Steinman, L., Zamvil, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+successfully+apply+animal+studies+in+experimental+allergic+encephalomyelitis+to+research+on+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">How to successfully apply animal studies in experimental allergic encephalomyelitis to research on multiple sclerosis.</a> Ann Neurol. 60 (1), 12-21 (2006).</li>
<li>Khare, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelin+oligodendrocyte+glycoprotein-specific+antibodies+from+multiple+sclerosis+patients+exacerbate+disease+in+a+humanized+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Autoimmun%22%5BJournal%5D)">Myelin oligodendrocyte glycoprotein-specific antibodies from multiple sclerosis patients exacerbate disease in a humanized mouse model.</a> J Autoimmun. 86, 104-115 (2018).</li>
<li>Marta, C. B., Oliver, A. R., Sweet, R. A., Pfeiffer, S. E., Ruddle, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenic+myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+antibodies+recognize+glycosylated+epitopes+and+perturb+oligodendrocyte+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Pathogenic myelin oligodendrocyte glycoprotein antibodies recognize glycosylated epitopes and perturb oligodendrocyte physiology.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (39), 13992-13997 (2005).</li>
<li>Flach, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantibody-boosted+t-cell+reactivation+in+the+target+organ+triggers+manifestation+of+autoimmune+cns+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Autoantibody-boosted t-cell reactivation in the target organ triggers manifestation of autoimmune cns disease.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (12), 3323-3328 (2016).</li>
<li>Didonna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ataxin-1+regulates+b+cell+function+and+the+severity+of+autoimmune+experimental+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Ataxin-1 regulates b cell function and the severity of autoimmune experimental encephalomyelitis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (38), 23742-23750 (2020).</li>
<li>Didonna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex-specific+tau+methylation+patterns+and+synaptic+transcriptional+alterations+are+associated+with+neural+vulnerability+during+chronic+neuroinflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Autoimmun%22%5BJournal%5D)">Sex-specific tau methylation patterns and synaptic transcriptional alterations are associated with neural vulnerability during chronic neuroinflammation.</a> J Autoimmun. 101, 56-69 (2019).</li>
<li>Ma, Q., Matsunaga, A., Ho, B., Oksenberg, J. R., Didonna, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligodendrocyte-specific+argonaute+profiling+identifies+micrornas+associated+with+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Oligodendrocyte-specific argonaute profiling identifies micrornas associated with experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> J Neuroinflammation. 17 (1), 297(2020).</li>
<li>Lanz, T. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonally+expanded+b+cells+in+multiple+sclerosis+bind+ebv+ebna1+and+glialcam%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Clonally expanded b cells in multiple sclerosis bind ebv ebna1 and glialcam.</a> Nature. 603 (7900), 321-327 (2022).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים מתחרים.

כאן, דווח על פרוטוקול פשוט ויעיל מבוסס ELISA כדי לכמת במדויק את התגובה ההומורלית במודל חייתי רלוונטי של פתולוגיה של טרשת נפוצה. שיטה זו שימשה לאחרונה לתיאור התפקיד החדש של חלבון אטקסין-1 בשליטה על רמות הנוגדנים העצמיים בסרום בפרדיגמת MOG35-55/C57BL6J EAE12. בהקשר זה, יש לקחת בחשבון מספר גורמים, על מנת להשיג תוצאות עקביות ובעלות משמעות ביולוגית בשיטה זו.
ראשית, חשוב לאסוף דגימות סרום באיכות גבוהה ולהימנע מהמוליזה. המוגלובין ורכיבים תוך-תאיים אחרים המשתחררים מתאי דם אדומי...

טרשת נפוצה (MS) היא מחלה אוטואימונית כרונית של מערכת העצבים המרכזית (CNS) המאופיינת בחדירה מוקדית של תאי מערכת החיסון לפרנכימה במוח, פירוק נדן המיאלין העוטף אקסונים, הפעלת גליה ואובדן עצבי1. בנוסף לתפקיד המבוסס היטב של תאי T פתוגניים, קווי ראיות רבים הדגישו את מעורבותם של תאי B בתיווך התגובה האוטואימונית נגד מערכת העצבים המרכזית. תאי B עוברים התרחבות שבטית במוח הטרשת הנפוצה ונוגדנים כנגד מרכיבי המיאלין התגלו בתוך נגעים מיוצרים 2,3. ההפעלה הסלקטיבית של תאי B היקפיים עם תחילת המחלה תועדה לאחרונה, דבר המצביע על תפקיד משוער לתא חיסוני זה גם בהתחלת מחלה4. ההצלחה של טיפולים מדללי תאי B כגון נוגדנים חד-שבטיים נגד CD20 מאששת עוד יותר את הקשר המכניסטי בין תפקוד חריג של תאי B לבין דמיאלינציה אוטואימונית 5,6. מנקודת מבט מולקולרית, תאי B יכולים לתרום למחלה באמצעות הצגת אנטיגן עצמי, הפרשת ציטוקינים פרו-דלקתיים וייצור נוגדנים אוטו-ריאקטיביים.
מודלים רבים של בעלי חיים פותחו כדי לשחזר תכונות ספציפיות של פנוטיפ הטרשת הנפוצה המורכב. ביניהם, אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית (EAE) היא פרדיגמת in vivo הנפוצה ביותר ומסתמכת על חיסון של חיות ניסוי עם פפטידים קצרים הנגזרים מחלבוני מיאלין כגון גליקופרוטאין אוליגודנדרוציטים במיאלין (MOG) וחלבון בסיסי מיאלין (MBP)7. בעלי חיים מחוסנים של EAE מפתחים פתולוגיה דה-מיאלינציה הדומה לטרשת נפוצה בהיבטים רבים, כולל תגובה הומורלית חזקה נגד הפפטיד אנצפליטוגני8. מסיבה זו, מחקרי EAE סייעו לנתח את תפקודם של תאי B ונוגדנים עצמיים בהקשר של מחלה. לדוגמה, הוכח כי נוגדנים ספציפיים ל-MOG שבודדו מחולי טרשת נפוצה יכולים להחמיר את המהלך הקליני במודלים9 של EAE. יש לציין כי שאריות הפרולין במיקום 42 ב-MOG האנושי הוכחו כקריטיות לקביעת פתוגניות הנוגדנים העצמיים10. לאחרונה, נוגדנים עצמיים ספציפיים ל-MOG נמצאו כמקדמים מחלות לא רק על ידי תיווך אובדן מיאלין, אלא גם על ידי הגברת ההפעלה מחדש של תאי T אוטו-ריאקטיביים בתוך מערכת העצבים המרכזית11. 
בהתחשב בחשיבות של תגובות נוגדנים באוטואימוניות CNS, מאמר זה מציג פרוטוקול מבוסס ELISA למדידה יעילה של רמות הנוגדנים האוטו-תגובתיים בסרום בעכברי C57BL/6J EAE שחוסנו בפפטיד MOG35-55. בחלק הראשון של הפרוטוקול תתואר השיטה לאיסוף סרום באמצעות ניקוב תוך לבבי. לאחר מכן, יפורטו הנהלים להקמת בדיקת ELISA ורכישת הנתונים. לבסוף, יידונו ניתוח נתונים ופרשנותם.

<table><tbody><tr><td>מזרקים 1 מ"ל</td><td>BD Biosciences</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>1.5 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה</td><td>פישר</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>25 גרם מחטים</td><td>BD Biosciences</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>מצע 3,3',5,5'-טטרמתילבנזידין (TMB)</td><td>Thermo Fisher</td><td>N301</td><td>חנות ב-4 מעלות; </td></tr><tr><td>אטמי דבק</td> C <td>Thermo Fisher</td><td>AB0558</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר (BSA)</td> <td>Sigma</td><td>A7906</td><td>חנות ב-4 מעלות; C</td></tr><tr><td>C57BL/6J עכברים נקבות</td><td>מעבדת ג'קסון</td><td>000664</td><td>בעלי חיים בגילאי 8-10 שבועות צריכים לשמש לניסויי EAE</td></tr><tr><td>צינורות קריוגניים</td><td>פישר</td><td>10-500-25</td><td></td></tr><tr><td>מגש דיסקציה</td> מספריים <td>פישר</td><td>S111022</td><td></td></tr><tr><td>דיסקטור</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>14082-09</td><td></td></tr><tr><td>מאגר ציפוי ELISA</td><td>BioLegend</td><td>421701</td><td>יש לאחסן בטמפרטורה של 4&00 מעלות; </td></tr><tr><td>C Excel תוכנה</td><td>מיקרוסופט</td><td></td><td>אנליזה גיליון אלקטרוני</td></tr><tr><td>מלקחיים</td><td>Fine Science Tools</td><td>11152-10</td><td></td></tr><tr><td>עז נגד עכבר IgG, מודעות אנושיות-HRP</td><td>SouthernBiotech</td><td>1030-05</td><td>חנות ב-4 & deg; מקור</td></tr><tr><td>אור LED</td> C <td>פישר</td><td>AMPSILED21</td><td></td></tr><tr><td>קורא מיקרופלייט</td><td>פישר</td><td>14-377-575&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ביולוגיה מולקולרית כיתה</td><td>מים קורנינג</td><td>46-000-Cl</td><td></td></tr><tr><td>עכבר MOG35-55 פפטיד</td><td>EZBiolab</td><td>cp7203</td><td>חנות ב -80 מעלות; C</td></tr><tr><td>פיפטה רב ערוצית</td><td>Axygen</td><td>AP-12-200-P</td><td></td></tr><tr><td>מספריים קפיציים Noyes</td><td>Fine Science</td><td>Tools 15011-12</td><td></td></tr><tr><td>Nunc MaxiSorp צלחות 96 בארות</td><td>BioLegend</td><td>423501</td><td></td></tr><tr><td>שייקר אורביטלי</td><td>פישר</td><td>88-861-023</td><td></td></tr><tr><td>תנור</td><td>VWR</td><td>445-0024</td><td></td></tr><tr><td>מלח מאגר פוספט (PBS)</td><td>Thermo פישר</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה שולחנית מקוררת</td><td>תרמו פישר</td><td>75002441</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת עצירה</td><td>תרמו פישר</td><td>N600</td><td></td></tr><tr><td>טווין 20</td><td>ביו-ראד</td><td>1706531</td><td></td></tr></tbody></table>

כימות נוגדנים אוטוריאקטיביים בעכברים על אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית

Quantification of Autoreactive Antibodies in Mice upon Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית (EAE) היא מודל מחלה המשחזר את ההפרעה האוטואימונית טרשת נפוצה (MS) ברמה היסטופתולוגית ומולקולרית. EAE מושרה על ידי חיסון חיות ניסוי באמצעות הזרקה תת עורית של פפטידי מיאלין קצרים יחד עם אדג'ובנטים ספציפיים כדי להגביר את התגובה החיסונית. בדומה למקבילו האנושי, עכברי EAE מפתחים נגעים דה-מיאלינטינג, חדירת תאי מערכת החיסון למערכת העצבים המרכזית (CNS), הפעלת גליה ופגיעה עצבית. גוף עקבי של ראיות תומך גם בתפקיד מכניסטי לתפקוד לקוי של תאי B באטיולוגיה של טרשת נפוצה ו- EAE. תאי B יכולים לשמש כתאים מציגי אנטיגן, כמו גם מקור עיקרי של ציטוקינים מעודדי דלקת ונוגדנים עצמיים. ב- EAE, נוגדנים נוצרים כנגד פפטידים של המיאלין ששימשו לגרימת המחלה. נוגדנים עצמיים כאלה הוכחו כמתווכים אובדן מיאלין או הפעלה מחדש של תאי T פתוגניים למערכת העצבים המרכזית. מאמר זה מתאר פרוטוקול יעיל מבוסס ELISA לכימות נוגדנים עצמיים בסרום של עכברי C57BL/6J שחוסנו בפפטיד מיאלין אוליגודנדרוציטים גליקופרוטאין 35-55 (MOG35-55). השיטה המוצעת משמשת כלי רב עוצמה לחקר הספציפיות והעוצמה של התגובה ההומורלית החריגה בהקשר של דמיאלינציה אוטואימונית.

כדי להדגים את החוסן של בדיקת ELISA הנוכחית, השיטה נבדקה על דגימות סרום שבודדו מעוקבה של עכברות C57BL/6J לאחר 20 יום לאחר החיסון (dpi) עם 100 מיקרוגרם של פפטיד MOG35-55 באדג'ובנט מלא של פרוינד (CFA) בעקבות פרוטוקול אינדוקציה מאומת של EAE 12,13,14. החיות קיבלו גם 400 ננוגרם של רעלן שעלת ביום 0 ו-2. דגימות סרום מבעלי חיים מחוסנים מדומים עם הכל אך ללא הפפטיד שימשו כבקרות שליליות. כל עכברי EAE פיתחו את סימני המחלה הראשונים בין 11-14 ...

אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית (EAE) היא מודל בעל חיים של טרשת נפוצה (MS), אשר חולק עם המחלה האנושית תגובה אוטואימונית הומורלית חזקה. כאן, אנו מדווחים על פרוטוקול ELISA פשוט וגמיש לכימות נוגדנים עצמיים בסרום של עכברים מחוסנים EAE.

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is a disease model that recapitulates the autoimmune disorder multiple sclerosis (MS) at histopathological ...

לכן המעבדה שלנו מתמקדת בהבנת הבסיס המולקולרי של טרשת נפוצה, מחלה חיסונית של מערכת העצבים המרכזית המאופיינת בדמיאלינציה, דלקת עצבית ופגיעה אקסונלית. כך שפרוטוקול זה מייצג אלטרנטיבה חסכונית וגמישה לערכות מסחריות. ניתן להתאים אותנו בקלות לבדיקת תגובות נוגדנים של תאי B כנגד פפטידים שונים באזור הכלכלי האירופי.המעבדה שלי מוקדשת להבנה נוספת של הקשר בין דלקת עצבית וניוון עצבי במחלות נוירולוגיות כרוניות כמו טרשת נפוצה.

quantification-autoreactive-antibodies-mice-upon-experimental

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

זנים מסוימים עכבר מסוגלים לעמוד בפני גיוס של Encephalomyelitis אוטואימונית ניסויית (EAE) עם חלבון המיאלין הבסיסי. המתואר כאן הוא פרוטוקול חיסון פשוט הופך את חוסר התגובה וגורם למחלת שיתוק בכמה כתמים אופייניים EAE עכבר עמידים.

התגברות על חוסר התגובה של ניסיוני אוטואימוניות Encephalomyelitis (EAE) זנים עמידים עכבר ידי העברת המאמצת אתגר אנטיגני

הסרטון מדגים השראת אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית במודל עכברי על ידי הזרקת שילוב של גליקופרוטאינים אוליגודנדרוציטים מיאלין ושחפת מיקובקטריום בלתי פעילה. המודל מאפשר לחוקרים לחקור מנגנוני מחלה ולבחון התערבויות טיפוליות.

אינדוקציה של אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית במודל עכבר

סרטון זה מדגים את השיטה של גרימת אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית (EAE) על ידי הזרקת אדג'ובנט לפפטידים שמקורם במיאלין כדי להפעיל תאי T אוטו-ריאקטיביים, הנודדים למוח. רעלן השעלת ניתן כדי להגביר את חדירות מחסום הדם-מוח, ומאפשר לתאי T אלה ולתאי חיסון אחרים להיכנס למוח. תאים חיסוניים אלה גורמים לדמיאלינציה, מה שמוביל לפגיעה בהולכה עצבית ובהתפתחות של EAE.

יצירת אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית במודל עכבר

בסרטון זה, מודל עכבר של טרשת נפוצה נקבע באמצעות אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית (EAE). העכבר מוזרק עם תחליב המכיל פפטיד עצבי ואדג'ובנט, המפעיל תגובה חיסונית המפעילה תאי T אוטוריאקטיביים. לאחר מכן מתבצעת הזרקה של רעלן שעלת (PTX) כדי להגביר את חדירות מחסום הדם-מוח, מה שמאפשר לתאי T האוטו-תגובתיים לחדור למוח. חדירה זו יוזמת מפל איתות שבסופו של דבר גורם לנזק למיאלין, המחקה את המצב הדה-מיאלינציה של טרשת נפוצה.

כתב יד זה מתאר את השיטות לאינדוקציה וניקוד של מודל דלקת המוח האוטואימונית הניסויי (EAE), יחד עם הערכת התפלגות תאי החיסון ורמות ציטוקינים mRNA בבלוטות הלימפה, הטחול, הדם וחוט השדרה באמצעות ציטומטריית זרימה ו-PCR כמותי, בהתאמה, בשלבי מחלה שונים.

אינדוקציה של ניסיוני אוטואימוניות Encephalomyelitis עכברים וההערכה של הפצת מחלות התלויה של תאים חיסוניים ברקמות שונות

רמת החלבון של נוזל השדרה הגבוה יכול להיות תוצאה של דיפוזיה של חלבון פלזמה על פני מחסום דם-מוח שונה או סינתזה התוך. פרוטוקול בדיקה מיטבי מוצג במאמר זה, המסייע להפלות את שני המקרים ומספק מדידות כמותית של חלבונים מסונתז באופן פנימי.

מדידה כמותית של מתוך מסונתז חלבונים בעכברים

כתב יד זה מציג פרוטוקול כדי לגרום אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית פעילה (EAE) בעכברים. שיטה לבידוד ואפיון של לימפוציטים הסתננו במערכת העצבים המרכזית (CNS) מוצגת גם כדי להראות כיצד לימפוציטים מעורבים בהתפתחות של מחלת החיסון האוטואימונית CNS.

זרימה ניתוח ציטומטרי של חדירה לימפוציטים במערכת העצבים המרכזית במהלך אנצפלומיאלטיס אוטואימונית ניסיונית

הפרוטוקול הנוכחי מתאר אינדוקציה של אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית במודל עכברי המשתמש בגליקופרוטאין מיאלין אוליגודנדרוציטים וניטור תהליך המחלה באמצעות מערכת ניקוד קלינית. תסמינים אוטואימוניים ניסיוניים הקשורים לאנצפלומיאליטיס מנותחים באמצעות ניתוח טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת של עצם הירך ובדיקת שדה פתוח כדי להעריך את תהליך המחלה באופן מקיף.

אינדוקציה ומדדי הערכה מגוונים של אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית

אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית (EAE) משמשת כמודל של בעלי חיים לטרשת נפוצה. מאמר זה מתאר גישה לניקוד דלקת בחוט השדרה, דמיאלינציה ופגיעה אקסונלית ב- EAE. בנוסף, מוצגת שיטה לכימות רמות האור של נוירופילמנט מסיס בסרום העכברים, המאפשרת הערכה של פגיעה אקסונלית בעכברים חיים.

ניקוד דלקת במערכת העצבים המרכזית, דמיאלינציה ופגיעה באקסון באנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית

אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית היא אחד המודלים הנפוצים ביותר של טרשת נפוצה. בפרוטוקול הנוכחי, עכברי C57BL/6J משני המינים מחוסנים בפפטיד גליקופרוטאין אוליגודנדרוציטים מיאלין, וכתוצאה מכך בעיקר פרזיס עולה של הזנב והגפיים. כאן אנו דנים בפרוטוקול של אינדוקציה והערכה של EAE.

מידול טרשת נפוצה בשני המינים: MOG35-induced ניסיוני אוטואימוני אנצפלומיאליטיס

למד פרוטוקול ELISA גמיש לכימות נוגדנים אוטוריאקטיביים בדם עכברים עם אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית. שיטה זו מציעה חלופה כלכלית לערכות מסחריות ומסייעת לחוקרים לחקור מנגנוני תגובת נוגדנים של תאי B במחלות נוירואימונולוגיות.

כימות נוגדנים אוטוריאקטיביים בעכברים על אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית

גלה סרטונים נוספים