Name: הערכת סינון בתפוקה גבוהה של ייצור מיני חמצן תגובתי (ROS) באמצעות צבע פלואורסצנטי Dihydroethidium (DHE) (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-19T14:20:00.000+00:00
Duration: 5 min 16 s
Description: למדו שיטה לכימות ROS בתפוקה גבוהה באמצעות צבע פלואורסצנטי DHE בתאי קרצינומה hepatocellular. פרוטוקול זה מאפשר מדידה מדויקת של רדיקלי סופראוקסיד בטוקסיקולוגיה וביולוגיה של תאים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

RK ו-RRG נתמכו על ידי מענק ממרכז UNM למתכות בביולוגיה ורפואה (CMBM) באמצעות מענק NIH NIGMS P20 GM130422. RRG נתמכה על ידי פרס פיילוט ממענק NM-INSPIRES P30 1P30ES032755. תמיכת ליבת ההדמיה במכשיר CX7 Cellomics סופקה באמצעות ליבות מרכז AIM שמומנו על ידי P20GM121176 המענקים של NIH. ברצוננו להודות לד"ר שרינה דסאי ולד"ר לי צ'ן על עזרתם רבת הערך בנושאים טכניים הקשורים לשימוש בפלטפורמת ההדמיה CX7 Cellomics.

1. תרבית תאים
<ol><li>זרעו את תאי הבדיקה (HepG2, HUH7 ותאי קרצינומה הפטוצלולרית JHH4) לצלחת בת 96 בארות בצפיפות זריעה של 10,000 תאים לבאר בנפח זריעה סופי של 200 מיקרוליטר לבאר.<ol><li>לפני תרבית תאי HepG2, צפו את 96 בארות הצלחת בקולגן מסוג IV (50 מיקרוגרם/מ"ל) למשך שעתיים בטמפרטורת החדר (RT). כדי למנוע התמצקות של הקולגן המלאי, הניחו את תמיסת הציר בקרח ולאחר מכן, התחילו בתהליך הדילול לריכוז הרצוי.</li>
		<li>לאחר תקופת דגירה של שעתיים, שאפו את עודפי הקולגן ושטפו את הבארות שלוש פעמים עם PBS 1x.</li>
	</ol></li>
	<li>טפחו את התאים במדיום הנשר המעובד של דולבקו (DMEM) למשך הלילה בריכוז של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 באינקובטור לח.</li>
	<li>למחרת, או עם ההגעה למפגש של 80%-90%, המוקדם מביניהם, טפלו בתאים עם H2O2 (לא מטופל, 250 מיקרומטר, 500 מיקרומטר, 750 מיקרומטר ו-1000 מיקרומטר) ומנדיון (לא מטופל, 25 מיקרומטר, 50 מיקרומטר, 75 מיקרומטר, 100 מיקרומטר), בהתאמה למשך 30 דקות כדי לגרום לעקה החמצונית המייצגת.</li>
	<li>לחלופין, בחרו לבדוק את התאים עם חומר הבדיקה הרצוי המסוגל לגרום לעקה חמצונית בתוך התאים.</li>
</ol>2. הכנת מלאי ותמיסה מדוללת לצביעת DHE של תאים
<ol><li>הכינו תמיסת מלאי DHE (5 מ"ג/מ"ל או 15.9 מ"ל) על ידי המסת 5 מ"ג DHE ב-1 מ"ל DMSO.</li>
	<li>יש לדלל את תמיסת מלאי ה-DHE במים אוטוקלאביים מזוקקים פעמיים עד לריכוז הסופי של 100 מיקרומטר.</li>
	<li>כדי למנוע את תהליך ההקפאה וההפשרה של הצבע (שעלול לפגוע בתכונות הפלואורסצנטיות לאורך זמן), הכינו מספר אליציטוטים בצינורות צנטריפוגה של 1.5 מ"ל בריכוז של 100 מיקרומטר ואחסנו אותם בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>כדי להשיג ריכוז עבודה סופי של 10 מיקרומטר, השתמש באליציטוט של ריכוז DHE של 100 מיקרומטר ודלל אותו עם מדיה DMEM שחוממה מראש. הערה: יש להכין את פתרון העבודה טרי ביום הניסוי.</li>
	<li>מערבולת את תמיסת הצבע הפלואורסצנטי העובדת למשך 5-10 שניות כדי להבטיח ערבוב נכון של הצבע.</li>
</ol>3. תהליך צביעת DHE
<ol><li>הסר את המדיה המכילה תרופות או חומרי בדיקה מכל באר ושטוף אותה בעדינות פעם אחת עם PBS או DMEM 1x. הערה: בעת ביצוע שלבי ההוספה או השטיפה בניסוי, חשוב להימנע ממגע ישיר בין התאים לבין הפיפטר. ניתן להשיג זאת על ידי פיפטציה עדינה של PBS לאורך צידי הבארות כדי למזער כל נזק מכני פוטנציאלי לתאים. הקפדה על כך שהפיפטור לא ייגע ישירות בתאים תסייע לשמור על שלמות התא ועל יכולת הקיום שלו למשך הניסוי.</li>
	<li>הוסף 100 μL של מדיה DMEM המכיל 10 μM DHE (פתרון עבודה) לתוך כל באר לדגור ב 37 ° C במשך 30 דקות.</li>
	<li>לאחר תקופת דגירה של 30 דקות, הסירו את המדיה המכילה DHE ושטפו כל באר בעדינות שלוש פעמים עם מלח חוצץ פוספט 1x (PBS). זה יכול להתבצע עם pipettor רב ערוצי כדי להבטיח תפנית מהירה.</li>
	<li>הוסף 200 μL של 1x PBS לכל באר עם צבע צביעה גרעיני Hoechst 33342 למשך 10 דקות ב- RT.</li>
	<li>הסר את תמיסת הצביעה הגרעינית Hoechst 33342 מהבאר והוסף 200 μL של 1x PBS לכל באר. הערה: כדי להשיג תאים קבועים, פעל לפי אותו פרוטוקול כמו עבור התאים החיים, עם שלב אחד נוסף של הוספת 4% PFA למשך 5 דקות לאחר הטיפול וצביעת DHE. הסר את תמיסת ה- PFA ושטוף תאים עם PBS 1x. לאחר מכן, לדגור את התאים עם צבע מכתים גרעיני במשך 10 דקות.</li>
	<li>העבר את הצלחת לפלטפורמת סינון התוכן הגבוה, למיקרוסקופ פלואורסצנטי או לקורא לוחות לרכישת תמונה במהירות האפשרית.</li>
</ol>4. רכישת תמונה ומדידת עוצמה
<ol><li>טעינת צלחת<ol><li>פתח את תוכנת Cellomics CX7 High-Content Screening (HCS) לרכישת נתונים.</li>
		<li>כייל בקפידה את פלטפורמת ההדמיה בהתאם למפרטי היצרן מראש עם לוח 96 בארות ספציפי לבחירה לשימוש כדי למנוע תמונות מעורפלות או מטושטשות בנתונים. הערה: לוחות מרובי בארות מספקים שונים עשויים להיות בעלי תכונות חומר שונות ויכולים להשפיע על איכות התמונות הסופיות המתקבלות.</li>
		<li>לאחר הכיול, שמור את פרמטרי המערכת הספציפיים למותג הצלחת במסד הנתונים של המכשירים והשתמש בהם שוב לרכישות נתונים עתידיות.</li>
		<li>מניחים בזהירות את הצלחת עם הדגימות המוכנות על השלב המחומם של מערכת ההדמיה HCS. ודא שהלוח ממוקם היטב ובכיוון הנכון להדמיה על מחזיק המיקרו-לוחית (כלומר, אתר את התווית המסומנת A1 על במת הקורא, ולאחר מכן סובב את לוח המיקרו כך שהמיקום של באר A1 יתאים לפינה עם המדבקה).</li>
		<li>לחץ בעדינות כלפי מטה על לוח המיקרו כדי להבטיח שהוא מונח שטוח על הבמה. פילוס לא אחיד של הצלחת במערכת HCS יכול להוביל לשגיאות ברכישת תמונה.</li>
		<li>לאחר שהלוחית נמצאת במקומה, לחץ והחזק את מקש Ctrl ולאחר מכן לחץ על Ctrl-OK בתיבת הדו-שיח טעינה/ביטול טעינה של צלחת בתוכנה.</li>
	</ol></li>
	<li>בחירת פרמטרי הדמיה<ol><li>במערכת ההדמיה HCS, פתח את מצב הפעלת המטרה בממשק היישומים הביולוגיים של Cellomics וצור פרוטוקול חדש באמצעות פרוטוקול ההתקנה הדו-ערוצי התואם ל- (א) צביעה גרעינית ו- (ב) איסוף נתוני בדיקה פלואורסצנטית DHE. בפרוטוקול הנוכחי, המסננים 386_BGSRS_BGSRS, 480_BGS_RS ו-386_BGS_RS שימשו עבור (א) צביעה גרעינית Hoechst 33342, (ב) ייצור ROS כולל ו-(ג) גילוי רדיקלים סופראוקסידים, בהתאמה. הבחירה במסננים אלה נבעה מהחפיפה הספציפית לתכונות הפליטה של כל צבע (DAPI ו-DHE) המשמשות כחלק מפרוטוקול זה. הערה: מוסכמת מתן השמות של מסננים, למשל, 386-23_BGRFRN_BGRFRN, מתייחסת לעירור של הדגימה עם אור 386 ננומטר עם רוחב פס של 23 ננומטר, ואחריו מסנן דיכרואי שמעביר כחול (B), ירוק (G), אדום (R), אדום רחוק (FR) ואור אינפרא אדום קרוב (N) בטווחי אורכי גל ספציפיים וה 386_BGS_RS מתייחס למסנן פליטה שמעביר אור באורכי גל של פליטת BGS ו-RS אחרי הדיכרואיק.</li>
		<li>ציין את המטרות לתהליך רכישת התמונה בממשק פרוטוקול התוכנה, כגון הגדלה של 10x או 20x, לפי הצורך.</li>
		<li>בחר את ההגדלה האובייקטיבית המתאימה בהתאם לרמת פרטי ההדמיה הרצויה והרזולוציות הדרושות לניסוי. עם זאת, הרזולוציה של כל מטרה קבועה. פירוט ברזולוציה גבוהה יותר יחייב שינוי המטרה בפלטפורמה. בפרוטוקול הנוכחי נעשה שימוש במטרה של 20x, 0.45 NA, שהיא חלק מפלטפורמת סינון התוכן הגבוה המשמשת בפרוטוקול זה. הערה: המטרה של 20x מייצגת פשרה טובה בין פירוט רזולוציית ההדמיה לבין מהירות הרכישה הדרושה ללכידת שינויי ROS לאורך זמן. ניתן לבחור יעדי הגדלה גבוהים יותר (למשל, פי 40), עם זאת, הדבר יוביל לזמני רכישה ארוכים יותר.</li>
		<li>ציין את הגדרות החשיפה של מצלמת רכישת התמונה, כגון זמן החשיפה, שילוב המצלמה ומרווח מחסנית z, בהתאם לדרישות הספציפיות של הפרוטוקול. הערה: זמן החשיפה (לעתים קרובות באלפיות השנייה) משתנה בהתאם לעוצמת האות ולרגישות של הפלואורופורים הספציפיים שבהם נעשה שימוש. זה עשוי גם להיות שונה מעט מניסוי לניסוי בהתבסס על ריכוז הצבע ואיכות הצביעה. בפרוטוקול הנוכחי, הפרמטרים של הרכישה קבועים כדלקמן - יעד % - 35%, מצב רכישת תמונה - 1104 x 1104 (עם 2x2 binning), ויעד 20x, 0.45 NA. פרמטרים אלה עשויים להיקבע בהתאם לתנאי הניסוי הספציפיים.</li>
	</ol></li>
	<li>פרמטרים של תצורת הדמיה הערה: לאחר הגדרת פרמטרי ההדמיה, ניתן להתחיל בתהליך איסוף התמונות באמצעות ממשק התוכנה.<ol><li>פרמטרים של אוסף תמונות<ol><li>זהה את אובייקט המעקב העיקרי המעניין (גרעין התאים) באמצעות אלגוריתמים שונים הזמינים במכשיר (אופטיקה - איזודאטה, קבוע ומשולש). הערה: שיטת isodata לזיהוי וסימון של האובייקט הראשי משמשת בפרוטוקול זה.</li>
			<li>פלח את האובייקט (אם קיים) לפי צורה או פרמטר עוצמה.</li>
			<li>אמת את האובייקט הראשי בהתבסס על פרמטרי הגודל, הצורה והעוצמה הרצויים הייחודיים לכל סוג תא.</li>
			<li>לאחר מכן, הגדר את 'אזור העניין' (ROI) סביב אובייקט ראשי זה. הערה: החזר ההשקעה הוא פרמטר מרכזי של איסוף נתונים המגדיר את המיקום שבו עוצמת הצבע הפלואורסצנטי מזוהה כעקבית וניתנת לחזרה על פני סוגי תאים. החזר ההשקעה מגדיר את הפרמטרים העיקריים (כגון עוצמת הצבע), הנמדדים עבור כל אובייקט מעקב ראשוני (כלומר, תא) בערוצים שונים של המכשיר. החזר ההשקעה יכול להיות מוגדר בצורה של מעגל או טבעת סביב הגרעין של כל תא. תוכנת HCS מקבלת באופן אוטומטי את עוצמת סמן הצבע הפלואורסצנטי DHE בערוץ 2 בגבול החזר ההשקעה עבור כל תא שמקוטע ומנותח באופן אוטומטי.</li>
			<li>הגדר מעגל של 20 מיקרומטר סביב האובייקט העיקרי (גרעין). המרחק של 20 מיקרומטר נבחר במחקר זה בהתבסס על הגדלים המשוערים של קווי התאים השונים המשמשים בפרוטוקול זה (HepG2, JHH-4 ו-HUH-7). החזר ההשקעה על טבעת 20 מיקרומטר סביב התאים השיג את עוצמת הפלואורסצנטיות באופן עקבי וניתן לחזור עליו. הערה הפרמטר המרכזי בבחירת החזר השקעה הוא היכולת לכסות כראוי את שטח התא; גודל החזר ההשקעה המעגלי תלוי בגודל התא. תאים גדולים יותר עשויים לדרוש החזר השקעה גדול יותר ולהיפך עבור החזר השקעה קטן יותר. פרמטרים אלה חייבים להיקבע מראש עבור כל סוג תא וצבע פלואורסצנטי מעניין.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>אפיון אוכלוסייה ובחירת תכונות לאחסון<ol><li>לאחר הגדרת פרמטרי הרכישה השונים בפרוטוקול הדמיה HCS, הגדר את מערכת HCS למצב רכישת נתונים.</li>
		<li>פרמטרי רכישת התמונה עבור פרוטוקול זה נקבעו כדלקמן: מגבלת סריקה של 1000 תאים / באר, עם דרישה מינימלית של 10 אובייקטים (תאים) לכל שדה. הערה: מספר השדות שהוערך עבור כל באר נקבע בהתבסס על ספירת התאים הסופית שהגיעה למספר 1000. מערכת HCS ממשיכה לחפש במקומות שונים בתוך הבאר עד שהיא משיגה את אוכלוסיית היעד של 1000 תאים/באר. מהירות הרכישה תלויה אפוא במפגש ובמספרי התאים הכוללים הקיימים בכל באר של לוח 96 הקידוחים. בפרוטוקול הנוכחי, העוצמה הכוללת והממוצעת של ערוץ 2 (המייצגת את רדיקלי הסופראוקסיד ואת סך ייצור ה-ROS) נאספו מכל באר לצורך ניתוחים נוספים במורד הזרם.</li>
	</ol></li>
	<li>לכידה, עיבוד וניתוח של תמונות<ol><li>לאחר התאמה וסיום של פרמטרי רכישת התמונה, התחל את תהליך הסריקה עבור כל לוח בן 96 בארות. הערה: מערכת ההדמיה Cellomics CX7 מאפשרת סינון תוכן גבוה וניתוח אוטומטי של דגימות במגוון פרמטרים, כולל ייצור ROS בתוך תאים באופן בתפוקה גבוהה. בנוסף לייצור ROS, מערכת HCS מסוגלת לספק מידע רב ערך נוסף על פרמטרים שונים כגון מורפולוגיה של התא, לוקליזציה תת-תאית ותכונות תאיות רבות אחרות המעניינות. לאחר אופטימיזציה לרכישה, פלטפורמת ההדמיה HCS מאפשרת אפיון מקיף, איכותי וכמותי של פרמטרים התא בצורה חזקה.</li>
		<li>לאחר השלמת תהליך הסריקה, הפעל את תוכנת View Analysis וייצא את פרמטרי הנתונים הכמותיים השונים בפורמט .csv לניתוח נוסף.</li>
		<li>באמצעות תוכנת צד שלישי, העתק והדבק את הערכים הכמותיים השונים המעניינים לצורך ניתוחים נוספים במורד הזרם. הערה: בפרוטוקול הנוכחי, תוכנת GraphPad Prism שימשה לניתוח ערכי עוצמת DHE בתגובה לעקה חמצונית מושרית עקב חשיפות H2O2 ומנאדיון.</li>
	</ol></li>
	<li>ניתוח נתונים וסטטיסטיקה<ol><li>חשב את העוצמה הממוצעת של ערוץ 2 (המייצג את ערכי ROS הכוללים ורדיקלים סופראוקסידים). הערה: כל הניסויים לחישוב ערכי העוצמה חזרו על עצמם שלוש פעמים עם 6 עותקים משוכפלים לכל מצב בכל רמת מינון.</li>
		<li>בצע בדיקת ANOVA או t חד-כיוונית כדי למדוד את ההבדלים בערכי העוצמה בין תנאי הבדיקה השונים.</li>
	</ol></li>
</ol>

כימות ROS חדשני באמצעות דיהידרואתידיום בתאי סרטן הכבד

<ol><li>Juan, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemistry+of+reactive+oxygen+species+%28ros%29+revisited%3A+Outlining+their+role+in+biological+macromolecules+%28DNA%2C+Lipids+and+Proteins%29+and+induced+pathologies%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">The chemistry of reactive oxygen species (ros) revisited: Outlining their role in biological macromolecules (DNA, Lipids and Proteins) and induced pathologies.</a> Int J Mol Sci. 22 (9), 4642(2021).</li>
<li>Magnani, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+mechanisms+of+ROS+generation+by+NADPH+oxidases%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Structure and mechanisms of ROS generation by NADPH oxidases.</a> Curr Opin Struct Biol. 59, 91-97 (2019).</li>
<li>Collin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+basis+of+reactive+oxygen+species+reactivity+and+involvement+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Chemical basis of reactive oxygen species reactivity and involvement in neurodegenerative diseases.</a> Int J Mol Sci. 20 (10), 2407(2019).</li>
<li>Uttara, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+and+neurodegenerative+diseases%3A+a+review+of+upstream+and+downstream+antioxidant+therapeutic+options%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Neuropharmacol%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress and neurodegenerative diseases: a review of upstream and downstream antioxidant therapeutic options.</a> Curr Neuropharmacol. 7 (1), 65-74 (2009).</li>
<li>Dikalov, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+paramagnetic+resonance+measurements+of+reactive+oxygen+species+by+cyclic+hydroxylamine+spin+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Electron paramagnetic resonance measurements of reactive oxygen species by cyclic hydroxylamine spin probes.</a> Antioxid Redox Signal. 28 (15), 1433-1443 (2018).</li>
<li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+reactive+oxygen+species+%28ROS%29+and+mitochondrial+ROS+in+AMPK+knockout+mice+blood+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Measurement of reactive oxygen species (ROS) and mitochondrial ROS in AMPK knockout mice blood vessels.</a> Methods Mol Biol. 1732, 507-517 (2018).</li>
<li>Griendling, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+reactive+oxygen+species%2C+reactive+nitrogen+species%2C+and+redox-dependent+signaling+in+the+cardiovascular+system%3A+a+scientific+statement+from+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Measurement of reactive oxygen species, reactive nitrogen species, and redox-dependent signaling in the cardiovascular system: a scientific statement from the American Heart Association.</a> Circ Res. 119 (5), e39-e75 (2016).</li>
<li>Kalyanaraman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+reactive+oxygen+and+nitrogen+species+with+fluorescent+probes%3A+challenges+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Measuring reactive oxygen and nitrogen species with fluorescent probes: challenges and limitations.</a> Free Radic Biol Med. 52 (1), 1-6 (2012).</li>
<li>Gomes, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+probes+used+for+detection+of+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem+Biophys+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species.</a> J Biochem Biophys Methods. 65 (2-3), 45-80 (2005).</li>
<li>Halliwell, B., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHalliwell%2C+B+%22Free+radicals+in+biology+and+medicine%22">Free radicals in biology and medicine</a>. , Oxford University Press, Oxford Academic. USA. (2015).</li>
<li>Cho, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-based+detection+and+quantification+of+features+of+cellular+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-based detection and quantification of features of cellular senescence.</a> Methods Cell Biol. 103, 149-188 (2011).</li>
<li>Dikalov, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+detection+of+mitochondrial+and+cellular+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species.</a> Antioxid Redox Signal. 20 (2), 372-382 (2014).</li>
<li>Kalyanaraman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+developments+in+detection+of+superoxide+radical+anion+and+hydrogen+peroxide%3A+Opportunities%2C+challenges%2C+and+implications+in+redox+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Recent developments in detection of superoxide radical anion and hydrogen peroxide: Opportunities, challenges, and implications in redox signaling.</a> Arch Biochem Biophys. 617, 38-47 (2017).</li>
<li>Robinson, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+fluorescent+imaging+of+superoxide+in+vivo+using+ethidium-based+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Selective fluorescent imaging of superoxide in vivo using ethidium-based probes.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 103 (41), 15038-15043 (2006).</li>
<li>Zielonka, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+2-hydroxyethidium+in+cellular+systems%3A+a+unique+marker+product+of+superoxide+and+hydroethidine%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Detection of 2-hydroxyethidium in cellular systems: a unique marker product of superoxide and hydroethidine.</a> Nat Protoc. 3 (1), 8-21 (2008).</li>
<li>Nazarewicz, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+specific+measurements+of+superoxide+using+fluorescence+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">Rapid and specific measurements of superoxide using fluorescence spectroscopy.</a> J Biomol Screen. 18 (4), 498-503 (2013).</li>
<li>Murphy, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+measuring+reactive+oxygen+species+and+oxidative+damage+in+cells+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Metab%22%5BJournal%5D)">Guidelines for measuring reactive oxygen species and oxidative damage in cells and in vivo.</a> Nat Metab. 4 (6), 651-662 (2022).</li>
<li>Ameziane-El-Hassani, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+reactive+oxygen+species+in+cells+undergoing+oncogene-induced+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene-Induced+Senescence%3A+Methods+Protoc%22%5BJournal%5D)">Detection of reactive oxygen species in cells undergoing oncogene-induced senescence.</a> Oncogene-Induced Senescence: Methods Protoc. 1534, 139-145 (2017).</li>
<li>Abraham,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+content+screening+applied+to+large-scale+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">High content screening applied to large-scale cell biology.</a> Trends Biotechnol. 22 (1), 15-22 (2004).</li>
<li>Criddle, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Menadione-induced+reactive+oxygen+species+generation+via+redox+cycling+promotes+apoptosis+of+murine+pancreatic+acinar+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Menadione-induced reactive oxygen species generation via redox cycling promotes apoptosis of murine pancreatic acinar cells.</a> J Biol Chem. 281 (52), 40485-40492 (2006).</li>
<li>Goffart, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+type+and+source+of+reactive+oxygen+species+influences+the+outcome+of+oxidative+stress+in+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">The type and source of reactive oxygen species influences the outcome of oxidative stress in cultured cells.</a> Cells. 10 (5), 1075(2021).</li>
<li>Kurutas, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+antioxidants+which+play+the+role+in+cellular+response+against+oxidative%2Fnitrosative+stress%3A+current+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nutr+J%22%5BJournal%5D)">The importance of antioxidants which play the role in cellular response against oxidative/nitrosative stress: current state.</a> Nutr J. 15 (1), 71(2015).</li>
<li>Shad, K. F., Das, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introductory+Chapter%3A+Role+of+Fenton+and+Haber-Weiss+Reaction+in+Epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsy-Seizures+without+Triggers.+IntechOpen%22%5BJournal%5D)">Introductory Chapter: Role of Fenton and Haber-Weiss Reaction in Epilepsy.</a> Epilepsy-Seizures without Triggers. IntechOpen. , (2023).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים מתחרים.

במחקר זה, פרוטוקול להערכת ייצור מיני חמצן תגובתי תוך-תאי (ROS) המונע על-ידי סופראוקסיד באמצעות צבע פלואורסצנטי דיהידרואתידיום (DHE) נקבע על מערכת סינון בעלת תוכן גבוה. רוב הפרוטוקולים הנוכחיים הזמינים בספרות משתמשים ב- DCFH-DA כבדיקת הדמיה פלואורסצנטית לכימות מיני ROS. עם זאת, מחקרים רבים הראו כי DCFH-DA אינו בדיקה אידיאלית למדידת ROS תוך תאי. סיבות שונות שהונחו לאי התאמתו של DCFH-DA כבדיקה כוללות - (i) DCFH-DA אינו מציג תגובה ישירה עם H2O2, מה שהופך אותו לצבע לא מתאים להערכת רמת H2O2 תוך תאית. (ii) מספר מינים מחמצנים של אלקטרון אחד, כגון OH., NO2., ו-ONOO-, מחמצנים DCFH ל-DCF. (iii) מתכות מעבר, ציטוכרום C ו- Heme peroxidase יכולות לקדם חמצון DCFH בנוכחות חמצן ו- H2O2. (iv) והכי חשוב, DCFH-DA מייצר את מוצר הביניים DCFH.- / DCF., אשר, בנוכחות חמצן, גורם לייצור של סופראוקסיד נוסף. דיסמוטציה עם O2.- יוצרת H2O2 נוסף, אשר עלול לגרום לעלייה מלאכותית של עוצמת הפלואורסצנטיות ורמות ROS גבוהות בטעות. מחברים רבים הגדירו את השימוש ב-DCFH-DA כבדיקה פלואורסצנטית לא אמינה לזיהוי של H2O2 תוך-תאי ומיני ROS אחרים 8,9,10,11,12,13,14.
בניגוד ל-DCFH-DA, DHE מגיב באופן ספציפי עם רדיקל הסופראוקסיד, מה שמוביל ליצירת מוצר פלואורסצנטי, 2-הידרוקסיאתידיום (2-OH E+). מיני ROS שאינם סופראוקסיד יכולים גם להגיב עם DHE כדי ליצור מוצר פלואורסצנטי שני, אתידיום (E+). בעוד שהספקטרום הפלואורסצנטי של 2-OH-E+ ו-E+ דומה יחסית, שתי מולקולות אלה מייצגות את התוצרים הסופיים של האינטראקציות הספציפיות בין מיני ה-ROS התוך-תאיים לבין DHE ואחראיות לעוצמת הפלואורסצנטיות הכוללת שנצפתה בתוך התאים עקב עקה חמצונית. מחקרים מסוימים הצביעו על עירור סלקטיבי באורכי גל קצרים יותר בטווח UV קצר יותר (<400 ננומטר) עשוי להיות ספציפי יותר לעירור אתידיום 2-OH (בניגוד ל- E+) ולכן, ייצור רדיקלים סופראוקסידים 7,12,14. זה הוערך על ידי מרגש את התאים עם אור LED 386 ננומטר בלבד. יחסית לעירור אורך גל של 480 ננומטר, נצפתה עוצמת פליטה מופחתת באורך גל של 560 ננומטר (ראו איור משלים 1 ואיור משלים 2). עם זאת, אי אפשר להיות בטוחים שזה נובע אך ורק מפלואורסצנטיות של 2-OH Ethidium בלבד ומייצג חסרון פוטנציאלי של הגישה הנוכחית. מחקרים אחרים הראו כי עירור UV (למשל, 386 ננומטר) יכול גם לגרום לפליטת אתידיום פלואורסצנטי בו זמנית, אם כי ברמות נמוכות יותר בהשוואה לאתידיום 7,15 2-OH. בכל מקרה, הפרוטוקול שלנו מבסס את DHE כתחליף צבע טוב יותר למדידת ההבדלים הכמותיים של רוב ייצור ה-ROS התוך-תאי באמצעות מערכת הדמיה וסינון בעלת תוכן גבוה. 
היעדר מניעי ביניים של יצירת ROS (כמו אלה הנראים ב- DCFH-DA) משוער כיתרון משמעותי בשימוש ב- DHE להערכת ייצור ROS תוך תאי. עם זאת, מנגנון זה של פלואורסצנטיות DHE עדיין לא מבוסס היטב. במקרים בהם יש צורך בכימות מדויק של רמות ROS, מומלץ להשתמש בשיטות אורתוגונליות נוספות של אימות כמותי כגון HPLC ו / או שיטות ספקטרומטריית מסה כרומטוגרפית נוזלית (LC-MS) כדי להעריך במדויק את רמות 2-OH-E+ בתוך התאים 8,9,13. עם זאת, יש להיות מודעים לכך ששיטות HPLC ו- LC-MS כרוכות בהכרח בצבירה ומסיסות של התאים לצורך הערכה. לפיכך, המידע המרחבי-זמני המקודד בשיטת הדמיה מבוססת פלואורסצנטיות כמו בפרוטוקול הנוכחי יאבד ב- HPLC וב- LC-MS ומייצג יתרון משמעותי של שיטות הערכת ROS מבוססות הדמיה. יתרון נוסף של הפלואורסצנטיות המוסטת לאדום של DHE הוא שהאור באורך גל ארוך יותר (באדום) פחות רעיל לתאים בגלל האנרגיה הנמוכה יותר הנישאת על ידי אור אדום.
האופי התלוי במינון של פלואורסצנטיות DHE למדידת השינויים היחסיים ב-ROS תוך-תאי נבדק באמצעות מנדיון ומי חמצן כגורמי עקה חמצונית. מנדיון ומי חמצן נבחרו כחומרי הבדיקה בשל המנגנונים המשתנים של ROS ויצירת עקה חמצונית20,21. בעוד ייצור ROS עקב חשיפה למנדיון הוא עקיף (באמצעות תפקוד לקוי של המיטוכונדריה), H2O2 מייצר עקה חמצונית באופן ישיר יותר. עלייה בריכוזים של מנדיון הובילה לייצור פלואורסצנטי מוגבר של DHE באופן ליניארי, ניתן לחזור על עצמו ותלוי במינון. בדומה למנאדיון, H2O2 הוא גורם ידוע של ROS המסוגל לייצר רדיקלים הידרוקסילים (OH.) באמצעות כימיה של פנטון באופן ישיר22. תגובה ליניארית ותלויית מינון נצפתה באופן דומה בפלואורסצנטיות DHE עקב חשיפה ל- H2O2. בשל הסלקטיביות של DHE עבור רדיקל סופראוקסיד במיוחד, הוא אינו מגיב ישירות עם H2O2. במקום זאת, רדיקלי הסופראוקסיד התוך-תאיים המיוצרים בתחילה מגיבים עם H2O2 ליצירת מיני ROS משניים, כגון רדיקלים הידרוקסיים באמצעות תגובות הבר-וייס ופנטון, אשר מזוהים לאחר מכן על ידי פלואורסצנטיות DHE23. ספקטרום הפליטה הפלואורסצנטית של DHE בתגובה לשני חומרים מחמצנים שונים על ידי מדידת רוב ייצור ה-ROS התוך-תאי נקבע בפרוטוקול הנוכחי 8,13. תוצאות אלה מבססות את התועלת של צבע DHE פלואורסצנטי כחלופה טובה יותר לזיהוי וכימות של רמות ROS תוך תאיות באמצעות גישות סינון בעלות תפוקה גבוהה.
הסלקטיביות, הרגישות והתכונות האופטיות המעולות של DHE הופכות אותו לחלופה רבת ערך לחקר ייצור ROS ונזקי חמצון באופן בתפוקה גבוהה, כפי שנקבע בפרוטוקול הנוכחי. מחקרים עתידיים במעבדה שלנו יחקרו את התפקיד של DHE כסמן ROS בתגובתיות צולבת בין ROS ומנגנוני איתות תאיים בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים שונים בסביבה של תפוקה גבוהה.

מיני חמצן תגובתי (ROS) הם קבוצה של רדיקלים כימיים טבעיים, תגובתיים מאוד ובלתי יציבים באופן זמני הנוצרים כחלק מחילוף החומרים התאי הרגיל בתאים. ROS ממלא תפקיד מפתח וחיוני באפנון תהליכים פיזיולוגיים וביוכימיים נורמליים המתרחשים בתאים 1,2. המקור העיקרי לייצור ROS בתאים הוא ממסלול שרשרת הובלת האלקטרונים המיטוכונדריאלית (ETC) כחלק מהמחזור הביו-אנרגטי הרגיל. מקורות משמעותיים נוספים לייצור ROS כוללים תגובות אנזימטיות כגון NADPH אוקסידאזות תאיות בתאים. חילוף החומרים של מולקולות מזון (למשל, גלוקוז) מתרחש דרך מסלול הזרחן החמצוני במטריצה המיטוכונדריאלית. רמה בסיסית של ייצור ROS חיונית לוויסות תהליכי איתות פיזיולוגיים תקינים. מולקולות חלבון מפתח רבות שהן חלק ממסלולי האיתות המטבולי של גלוקוז (למשל, Akt ו-PTEN) ידועות כמגיבות לרמות ROS תוך-תאיות. נוסף על כך, ROS מיוצר על-ידי אנזימים תוך-תאיים שונים, כגון קסנטין אוקסידאז, תחמוצת החנקן סינתאז ומרכיבים פרוקסיזומליים, כחלק מהמסלולים האנזימטיים התאיים 1,2. בניגוד למקורות הטבעיים של ROS, גורמים סביבתיים מסוימים, כגון קסנוביוטים, גורמים זיהומיים, אור UV, זיהום, עישון סיגריות וקרינה, מובילים גם לייצור יתר של ROS, שהם גורם מפתח לעקה חמצונית תוך-תאית 1,3. עקה חמצונית תאית מוגברת עלולה לגרום נזק לביומומולקולות טבעיות בתוך התא, כגון שומנים, חלבונים ודנ"א, ולגרום למחלות שונות כגון סרטן, סוכרת, מחלות לב וכלי דם, דלקת כרונית והפרעות נוירודגנרטיביות 1,3,4. לכן, מדידות מדויקות של ROS חיוניות להבנת המנגנונים התאיים המעורבים בפתופיזיולוגיה של מחלות הנובעות מעקה חמצונית.
בשל לוחות הזמנים הקצרים של ייצור ROS וסילוקם בתוך תאים, מדידות כמותיות של רדיקלי ROS שונים נותרו אתגר. שיטות כגון תהודה פאראמגנטית אלקטרונית (EPR)5, כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה (HPLC) והדמיה מבוססת בדיקה פלואורסצנטית משמשות למדידת ROS6 התאיים השונים. בעוד ששיטות כגון EPR ו- HPLC מניבות הערכות מדויקות מבחינה כמותית, שיטות אלה כרוכות בהרס המורפולוגיה המרחבית התאית והן בדרך כלל בצורה של מדידות גלובליות ובתפזורת של דגימה. לעומת זאת, שיטות מבוססות הדמיה כגון שיטות מבוססות בדיקה פלואורסצנטית שומרות על המורפולוגיה התאית וההקשר המרחבי של דור ה-ROS. עם זאת, הספציפיות של בדיקות פלואורסצנטיות שונות עבור סוגים שונים של רדיקלים ROS לא התבססה היטב 7,8. מספר בדיקות פלואורסצנטיות כגון dihydroethidium (DHE), dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA), dihydrorhodamine (DHR), dimethyl anthracene (DMA), 2,7 dichlorodihydroflurescein (DCFH), 1,3-Diphenylisobenzofuran (DPBF) ו- MitoSox זמינים לזיהוי ROS באופן מסחרי. בעשורים האחרונים, DHE, MitoSox ו-DCFH-DA הם הצבעים הפלואורסצנטיים הנפוצים למדידת ROS בתאים וברקמות 8,9. DCFH-DA הוא צבע נפוץ לזיהוי H2O2 תוך תאי ועקה חמצונית. למרות הפופולריות של DCFH-DA, מחקרים קודמים רבים הראו כי לא ניתן להשתמש בו באופן אמין כדי למדוד רמות תוך-תאיות H2O2 ורמות ROS אחרות 8,9,10,11,12,13,14.
לעומת זאת, הבדיקה הפלואורסצנטית דיהידרואתידיום (DHE) מראה תגובה ספציפית לרדיקל הסופראוקסיד התוך-תאי (O2-). בעוד רדיקל סופראוקסיד הוא אחד ממיני ROS רבים שנצפו בתאים, הוא רדיקל חשוב המעורב בהפחתת מתכות מעבר, המרה לפרוקסיניטרט והיווצרות הידרופרוקסידים, בין השפעות תוך-תאיות אחרות. DHE נקלט במהירות על ידי התאים ויש לו פליטה פלואורסצנטית בתחום אורכי הגל האדומים15. בתגובה עם רדיקל סופראוקסיד באופן ספציפי, DHE יוצר תוצר פלואורסצנטי אדום, 2-הידרוקסי אתידיום (2-OH-E+). לפיכך, DHE עשוי להיחשב כבדיקה ספציפית לגילוי סופראוקסיד. עם זאת, DHE יכול גם לעבור חמצון לא ספציפי עם ONOO- או OH., H2O2, וציטוכרום C כדי ליצור מוצר פלואורסצנטי שני, אתידיום E+, אשר יכול להפריע לרמות 2-OH-E+ הנמדדות. עם זאת, מוצרי 2-OH E+ ו-E+ אלה, בשילוב, מייצגים חלק עיקרי מכלל מיני ה-ROS התאיים שנצפו בתוך התא כאשר הם מוכתמים ב-DHE. E+ מתחבר לדנ"א, ומשפר מאוד את הפלואורסצנטיות שלו 8,9,10,11,13,14,15,16. מאחר שהספקטרום הפלואורסצנטי של אתידיום ואתידיום 2-הידרוקסי שונה רק במקצת, ניתן לזהות ולמדוד את רוב רמות ה-ROS הנראות בתא משני לייצור סופראוקסיד באמצעות תוצרי פלואורסצנטיות של DHE. מיני ROS אלה מזוהים באמצעות עירור אורך גל של 480 ננומטר ופליטת אורך גל של 610 ננומטר 15,16,17.
בנוסף לבחירת בדיקה ספציפית לזיהוי ROS פלואורסצנטי, חשוב לבחור שיטת זיהוי רגישה למדידת ROS תוך תאי. הערכה מדויקת של רמות ROS תוך-תאיות היא אפוא המפתח לזיהוי מצבי איזון חמצון-חיזור מופרעים המתרחשים בתאים חולים או בתאים שנחשפו לגורמי עקה סביבתיים שונים כגון קרינה, תרכובות טוקסיקולוגיות וחומרים גנוטוקסיים18. מאחר ש-ROS היא תופעה נפוצה בתאים שאחראית על ויסות מגוון פעילויות איתות תאי, שיטות חזקות לזיהוי ROS הן חיוניות. כדי לאפשר הערכה כזו של תפוקה גבוהה של ייצור ROS בתוך תאים, פרוטוקול זה משתמש בפלטפורמת סינון תוכן גבוה (HCS) כדי למדוד את מיני ROS. הפרוטוקול הנוכחי מאפשר ניתוח בתפוקה גבוהה של ייצור ROS תוך תאי, שהוא בעל חשיבות קריטית במחקרי טוקסיקולוגיה רבים19. פרוטוקול זה נועד לספק פתרון קל ורב-תכליתי לזיהוי ומדידה של ROS תוך-תאי בתאי קרצינומה הפטוצלולרית דבקים. הריאגנטים הכימיים של H2, O, 2 ומנדיון משמשים כממריצי ROS רבי עוצמה כדי למדוד את הרמות היחסיות של ייצור ROS בסביבה מבוקרת ותפוקה גבוהה. פרוטוקול זה עשוי להיות מכוונן כדי למדוד את ייצור ROS בתאים דבקים ולא דבקים בתנאים מתאימים, לפי הצורך.

<table><tbody><tr><td>צינורות צנטריפוגה 1.5 מ"ל&nbsp;</td><td>VWR&nbsp;</td><td>20170-038&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>96- צלחת באר&nbsp;</td><td>קורנינג קוסטאר&nbsp;</td><td>07-200-90&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>סלומיקס Cx7</td><td>ThermoFisher&nbsp;</td><td></td><td></td>HCSDCX7LEDPRO</tr><tr><td>קולגן&nbsp;</td><td>ביומטריקס מתקדם&nbsp; &nbsp;</td><td>5056&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DHE (דיהידרואתידיום)&nbsp;</td><td>תרמו-פישר&nbsp;</td><td>D1168&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DMEM&nbsp;</td><td>סיגמא&nbsp; &nbsp;</td><td>6046&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FBS&nbsp;</td><td>VWR&nbsp;</td><td>97068-085&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad פריזמה</td><td>GraphPad</td><td>גרסה 6.0</td><td></td></tr><tr><td>קו תאים HepG2</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hoechst&nbsp;</td><td>תרמו-פישר&nbsp;</td><td>33342&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>קו תאים HUH7</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מי חמצן&nbsp;</td><td>סיגמא&nbsp;</td><td>88597&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>קו תאים JHH4</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Menadione&nbsp;</td><td>סיגמא&nbsp;</td><td>M5625&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

הערכת סינון בתפוקה גבוהה של ייצור מיני חמצן תגובתי (ros) באמצעות צבע פלואורסצנטי dihydroethidium (dhe)

High Throughput Screening Assessment of Reactive Oxygen Species (ROS) Generation using Dihydroethidium (DHE) Fluorescence Dye

מיני חמצן תגובתי (ROS) ממלאים תפקיד מפתח בוויסות חילוף החומרים התאי בתהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים. ייצור ROS פיזיולוגי ממלא תפקיד מרכזי באפנון המרחבי והזמני של תפקודים תאיים נורמליים כגון התפשטות, איתות, אפופטוזיס והזדקנות. לעומת זאת, ייצור יתר כרוני של ROS אחראי למגוון רחב של מחלות, כגון סרטן, מחלות לב וכלי דם וסוכרת, בין היתר. לכן, כימות רמות ROS באופן מדויק וניתן לשחזור חיוני להבנת הפונקציונליות התאית הרגילה. שיטות מבוססות הדמיה פלואורסצנטית לאפיון מיני ROS תוך-תאיים היא גישה נפוצה. רבים מפרוטוקולי ההדמיה ROS בספרות משתמשים בצבע 2'-7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA). עם זאת, צבע זה סובל ממגבלות משמעותיות בשימוש וביכולת הפרשנות שלו. הפרוטוקול הנוכחי מדגים את השימוש בגשושית פלואורסצנטית דיהידרואתידיום (DHE) כשיטה חלופית לכימות הייצור הכולל של ROS בסביבה של תפוקה גבוהה. פלטפורמת ההדמיה בעלת התפוקה הגבוהה, CX7 Cellomics, שימשה למדידה וכימות של ייצור ROS. מחקר זה נערך בשלושה קווי תאים של סרטן הכבד - HepG2, JHH4 ו- HUH-7. פרוטוקול זה מספק תיאור מעמיק של ההליכים השונים המעורבים בהערכת ROS בתוך התאים, כולל - הכנת תמיסת DHE, דגירה של תאים עם תמיסת DHE, ומדידת עוצמת DHE הדרושה לאפיון ייצור ROS. פרוטוקול זה מדגים כי צבע פלואורסצנטי DHE הוא בחירה חזקה וניתנת לשחזור לאפיון ייצור ROS תוך תאי באופן בתפוקה גבוהה. גישות תפוקה גבוהה למדידת ייצור ROS עשויות להיות מועילות במגוון מחקרים, כגון טוקסיקולוגיה, סינון תרופות וביולוגיה של סרטן.

Dihydroethidium (DHE) הוא צבע פלואורסצנטי מגיב סופראוקסיד המספק מידע ספציפי לגבי מצבי ROS תוך תאיים. צבע DHE פולט באופן מהותי פלואורסצנטיות כחולה בציטופלסמה. אולם באינטראקציה עם רדיקלים סופראוקסידים, הוא הופך ל-2-הידרוקסיאתידיום, אשר פולט פלואורסצנטיות באורכי גל אדומים (&gt;550 ננומטר) (איור 1). צבע DHE מועבר בקלות לתוך התאים והגרעין. ניתן להמחיש את הפלואורסצנטיות הנפלטת באמצעות מערך מיקרוסקופ פלואורסצנטי הזמין בדרך כלל במעבדות רבות. במחקר הנוכחי, התועלת של צבע DHE על קווי תאי קרצינומה הפטוצלולרית מרובים - HUH7, JHH4 ותאי HepG2 כבדיקה של יצירת זני ROS נבדקה על פלטפורמת סינון בעלת תוכן גבוה. התאים טופלו בשני חומרים מחוללי ROS - (א) מי חמצן ו-(ב) מנדיון במשך 30 דקות באופן תלוי מינון (ראו איור 2 ואיור 3 לפרטים על המינון) כדי לגרום לעקה חמצונית בתאים, ולאחר מכן תיוג צבע DHE בצלחת של 96 בארות. גם H2O2 וגם מנדיון הגבירו את עוצמת הפלואורסצנטיות באופן דרמטי בכל שלושת קווי התאים באופן תלוי מינון. באמצעות אלגוריתמים של פילוח תמונה וכימות בתוך פלטפורמת הסינון בעלת התפוקה הגבוהה, עוצמת הפלואורסצנטיות DHE הנגרמת על ידי ROS כומתה ב-1000 תאים לכל באר על פני שישה עותקים משוכפלים. נמדדו שלושה עותקים משוכפלים בלתי תלויים, והתוצאות נצברו ונותחו. הכתם הגרעיני Hoechst 33342 ממלא תפקיד חשוב בזיהוי המישור שבו נמצאים התאים הדבקים בכל באר. נוסף על כך, ניתן לזהות פלואורסצנטיות 2-OH-E+ ו-E+ הן בגרעין והן בציטופלסמה של התאים שנבדקו, בהתאמה, בפלטפורמת הסינון בעלת התפוקה הגבוהה (ראו איור 4).
חשיפה ל- H2O2 הביאה לתוספת מובהקת סטטיסטית של פלואורסצנטיות הנגרמת על ידי ROS בכל קווי התאים שנותחו באופן תלוי מינון (ראו איור 2; פאנל תחתון). עם זאת, תגובה תלוית מינון כזו לא נצפתה במקרה של חשיפות למנדין. עם מנאדיון, קו התאים JHH4 הראה תוספת תלוית מינון בעוצמה פלואורסצנטית, בעוד שבשורות התאים HepG2 ו-HUH7 נצפה הבדל משמעותי בעוצמת הפלואורסצנטיות רק בריכוזי המנדיון הגבוהים יותר (ראו איור 3; פאנל תחתון). הבדלים אלה בתגובות דור ROS יכולים לנבוע מהמנגנונים הייחודיים של ייצור ROS של H2, O, 2 ומנדיון (menadione). בעוד H2O2 מעורר היווצרות ROS בתאים באופן ישיר יותר (למשל, באמצעות פעולה של אנזימים נוגדי חמצון כגון peroxidases ו catalases), משוער menadione לייצר זני ROS באופן עקיף באמצעות תפקוד מיטוכונדריאלי מושרה. בשל המנגנון העקיף של ייצור ROS, פלואורסצנטיות DHE עשויה לדרוש זמן רב יותר כדי להתבטא עם menadione. ממצאים אלה מצביעים על כך שפלואורסצנטיות DHE תלוית ROS רגישה למשך החשיפות לעקה חמצונית, ריכוז וסוגי תאים. אופטימיזציה של פרוטוקול הניסוי עבור כל סוג תא ייחודי היא אפוא חובה. חשוב מכך, פרוטוקול זה מדגים את היתכנות השימוש בצבע DHE כסוכן זיהוי ROS באופן בתפוקה גבוהה, אשר נמצא בשימוש בתחומים כגון טוקסיקולוגיה, ביולוגיה של סרטן וסינון תרופות.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66238/66238fig01.jpg"> איור 1: סכמה שמדגימה את מסלולי ההמרה החמצונית של מולקולת DHE פלואורסצנטית ל-2-הידרוקסיאתידיום (2-OH-E+) ואתידיום (E+), בהתאמה. ספקטרום הפליטה הפלואורסצנטי של 2-OH-E+ ו-E+ חופף בעירור של 480 ננומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66238/66238fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66238/66238fig02v2.jpg"> איור 2: טיפול במי חמצן מגביר את רמות ה-ROS התוך-תאיים באופן תלוי מינון. תאי קרצינומה הפטוצלולרית - (A) HUH7, (B) JHH4 ו- (C) HepG2 טופלו ב- H2O2 במינונים של 250 מיקרומטר, 500 מיקרומטר, 750 מיקרומטר ו- 1000 מיקרומטר לתקופה של 30 דקות. התאים הוכתמו בצבע DHE (10 μM) באמצעי תרבית למשך 30 דקות נוספות, ולאחר מכן צביעה גרעינית Hoechst 33342. בסך הכל נספרו 1000 תאים בכל באר. עלייה ליניארית תלוית מינון בפלואורסצנטיות DHE נצפית בכל שלושת קווי התאים (פאנל עליון). עליות מובהקות סטטיסטית בפלואורסצנטיות נראות בכל קווי התאים במינון של 500 מיקרומטר ומעלה (פאנל תחתון). כל מערך נתונים הוא ממוצע של שישה עותקים משוכפלים בלוח בן 96 בארות המתקבל משלושה ניסויים עצמאיים (n = 3). תנאי הטיפול הושוו לדגימות לא מטופלות באמצעות בדיקת ANOVA חד-כיוונית (**** - p &lt; 0.0001, *** - p &lt; 0.001; סרגל קנה מידה של תמונה - 50 מיקרומטר) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66238/66238fig02largev2.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66238/66238fig03v2.jpg"> איור 3: טיפול במנדיון מעלה את רמות ה-ROS התוך-תאי באופן תלוי מינון. תאי קרצינומה הפטוצלולרית - (A) HUH7, (B) JHH4 ו- (C) HepG2 טופלו במנדיון במינונים של 25 μM, 50 μM, 75 μM ו- 100 μM לתקופה של 30 דקות. התאים הוכתמו בצבע DHE (10 μM) באמצעי תרבית למשך 30 דקות נוספות, ולאחר מכן צביעה גרעינית Hoechst 33342. בסך הכל נספרו 1000 תאים בכל באר. עלייה ליניארית תלוית מינון בפלואורסצנטיות DHE נצפית בכל שלושת קווי התאים (פאנל עליון). עליות מובהקות סטטיסטית בפלואורסצנטיות נראות באופן עקבי עבור המינון המרבי (100 מיקרומטר; פאנל תחתון). נצפתה שונות עבור המינונים הנותרים של מנדיון על פני קווי תאים שונים (JHH4 &gt; HUH7 &gt; HepG2). כל מערך נתונים הוא ממוצע של שישה עותקים משוכפלים בלוח בן 96 בארות המתקבל משלושה ניסויים עצמאיים (n = 3). תנאי הטיפול הושוו לדגימות לא מטופלות באמצעות בדיקת ANOVA חד-כיוונית (**** - p &lt; 0.0001, *** - p &lt; 0.001; סרגל קנה מידה של תמונה - 50 מיקרומטר) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66238/66238fig03largev2.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66238/66238fig04.jpg"> איור 4: פלואורסצנטיות DHE של תא בודד - מבט מקרוב על השינויים הפלואורסצנטיים של DHE שנצפו לאחר טיפול עם (A) מי חמצן ו-(B) מנדיון למשך 30 דקות. שינויים ציטופלזמיים וגרעיניים של פלואורסצנטיות DHE נצפים בתאים השונים. גם מסכת הפילוח האוטומטית שיוצרת פלטפורמת סינון התוכן הגבוה נתפסת. סרגל קנה מידה של תמונה - 10 מיקרומטר. הגדלה - 20x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66238/66238fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
איור משלים 1: הדמיה פלואורסצנטית של DHE המונעת על-ידי סופראוקסיד בתגובה למי חמצן. תאי קרצינומה הפטוצלולרית - (A) HUH7, (B) JHH4 ו- (C) HepG2 טופלו ב- H2O2 במינונים של 250 מיקרומטר, 500 מיקרומטר, 750 מיקרומטר ו- 1000 מיקרומטר לתקופה של 30 דקות. התאים הוכתמו בצבע DHE (10 μM) בתרבית למשך 30 דקות נוספות. לאחר מכן, התאים הוארו ב-LED של 386 ננומטר, והדמיה פלואורסצנטית נאספה ב-&gt;560 ננומטר. שום הכתמת נגד גרעינית לא נעשתה כדי למנוע דיבור צולב ספקטרלי. עלייה תלוית מינון בפלואורסצנטיות DHE נצפית במינונים &gt; 500 מיקרומטר. פלואורסצנטיות DHE מוארת UV צפויה לנבוע מרוב ייצור רדיקלי סופראוקסיד. כל מערך נתונים הוא ממוצע של שישה עותקים משוכפלים בלוח בן 96 בארות המתקבל משני ניסויים עצמאיים (n = 2). תנאי הטיפול הושוו לדגימות לא מטופלות באמצעות ANOVA חד-כיווני (**** - p &lt; 0.0001, *** - p &lt; 0.001; סרגל קנה מידה של תמונה - 50 מיקרומטר) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66238/Supplementary%20Figure%201.pdf" target="_blank">אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.</a>
איור משלים 2: הדמיה פלואורסצנטית של DHE המונעת על-ידי סופראוקסיד בתגובה למנדיון - תאי קרצינומה הפטוצלולרית - (A) HUH7, (B) JHH4 ו- (C) HepG2 טופלו במנדיון במינונים של 25 μM, 50 μM, 75 μM ו- 100 μM לתקופה של 30 דקות. התאים הוכתמו בצבע DHE (10 μM) בתרבית למשך 30 דקות נוספות. בדומה למי חמצן, נצפתה עלייה תלוית מינון בפלואורסצנטיות DHE. כל מערך נתונים הוא ממוצע של שישה עותקים משוכפלים בלוח בן 96 בארות המתקבל משני ניסויים עצמאיים (n = 2). תנאי הטיפול הושוו לדגימות לא מטופלות באמצעות ANOVA חד-כיווני (**** - p &lt; 0.0001, *** - p &lt; 0.001; סרגל קנה מידה של תמונה - 50 מיקרומטר) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66238/Supplementary%20Figure%202.pdf" target="_blank">אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.</a>

פרוטוקול זה מתאר שיטה חדשנית לכימות מיני חמצן תגובתי תוך-תאי (ROS) באמצעות דיהידרואתידיום (DHE) כבדיקת צבע פלואורסצנטי באמצעות גישת סינון בתפוקה גבוהה. הפרוטוקול מתאר את השיטות להערכה כמותית של מיני חמצן תגובתי תוך-תאי (ROS) בשלושת קווי תאי הקרצינומה ההפטוצלולרית השונים.

הערכת סינון בתפוקה גבוהה של ייצור מיני חמצן תגובתי (ROS) באמצעות צבע פלואורסצנטי Dihydroethidium (DHE)

Reactive oxygen species (ROS) play a key role in the regulation of cellular metabolism in physiological and pathological processes. Physiological ROS ...

המעבדה שלנו חוקרת את ההשפעה של מזהמים סביבתיים, כמו מתכות כבדות, על תפקוד הכבד ומחלות הקשורות לייצור מיני חמצן תגובתי. פרוטוקול זה נועד למדוד כמותית את רמות ROS בתאים באמצעות בדיקה פלואורסצנטית dihydroethidium. פרוטוקול זה משתמש בפלטפורמת סינון תוכן גבוהה כדי למדוד כמותית את רמות מיני ROS תוך תאיים בשורות הפטוצלולריות.מדידה מדויקת של רמת ROS בין-תאית היא בעלת חשיבות קריטית במחקר טוקסיקולוגיה בתפוקה גבוהה, שהוא תחום עניין מרכזי במעבדה שלנו. פלואורסצנטיות DHE היא שיטה ספציפית מאוד למדידת רמות ROS כוללות, במיוחד התמקדות ברדיקל הסופראוקסיד, מה שמעניק לה יתרון משמעותי על פני גשושית פלואורסצנטית ROS נפוצה אחרת. בנוסף, פרוטוקול זה מציע את היכולת הייחודית למדוד את רמת ה-ROS הסלולרית הכוללת בפלטפורמה בעלת תפוקה גבוהה.הפרוטוקול שלנו הוא בחירה חזקה וניתנת לשחזור לאפיון ייצור ROS כולל תוך תאי. גישות בעלות תפוקה גבוהה למדידת רמות ROS מועילות במגוון מחקרים, כגון טוקסיקולוגיה, סינון תרופות וביולוגיה של סרטן, אשר יתמקדו בעתיד.

high-throughput-screening-assessment-reactive-oxygen-species-ros

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

שיטת ההקרנה לזהות סביבות הסלולר חמצוני היא למדוד את החמצון של CM-H2DCFDA. לאחר חמצון מן הלא למתחם ניאון ניאון בתוך, תא CM-H2DCFDA שינויים. שינוי זה של הקרינה נמדדת cytometry זרימה ומציין את מספר התאים בסביבה חמצוני.

הקרנת Assay עבור סטרס חמצוני בתוך הקו Cell חתולים Astrocyte, G355-5

כאן אנו מציעים שיטות פשוטות כדי לבחון ולהעריך את הנוכחות של מינים חמצן תגובתי בתאים.

הפקה וזיהוי של מינים חמצן תגובתי (ROS) סרטן

מתאמנים את סט של פרוטוקולים למדידה של מיני חמצן תגובתי (ROS) שניתן ליישם במודלים סלולריים אמבה ויונקים שונים למחקרים איכותיים וכמותיים.

איתור, חזותי וquantitating הדור של מינים חמצן תגובתי במערכת מודל אמבה

מאמר זה מציג עבודה תוכן גבוהה מיקרוסקופ לכימות בו זמנית של רמות ROS תאיים, כמו גם פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריה ומורפולוגיה - המכונים במשותף כמו morphofunction המיטוכונדריה - בתאים חסיד חיים באמצעות מולקולרית פלואורסצנטי חוברת מולקולות כתב 5- (ו - 6) -כלורומיליל -2 ', 7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate, אסתר אצטיל (CM-H 2 DCFDA) ו tetramethylrhodamine methylester (TMRM).

התאוששות נייד באמצעות פרופילים תוכן גבוהה מיקרוסקופית

כתב יד זה מתאר את השימוש fluorogenic מקודד גנטית כתבים ביישום של הדמיה לחיות תאים עבור הבחינה של xenobiotic-induced סטרס חמצוני. זו גישה נסיונית מציע רזולוציית ייתכן ללא תחרות, רגישות וספציפיות תוך הימנעות רבים את חסרונותיה של שיטות קונבנציונליות המשמש את הגילוי של רעילות סטרס חמצוני.

הדמיה גישות הערכות של רעילות לחץ חימצוני באמצעות חיישנים Fluorogenic מקודד גנטית

המיטוכונדריה מכילה מספר אנזימים תלויי-פלווין שיכול לייצר מינים חמצן תגובתי (ROS). ניטור ROS שחרור שאתרים בתוך המיטוכונדריה הוא מאתגר עקב תגובות לוואי לא רצויות. אנו מציגים שיטה קלה, זולה עבור הערכה ישירה של המחירים יליד לשחרור ROS באמצעות מטוהרים flavoenzymes ו- microplate fluorometry.

מדידה סימולטני של סופראוקסיד/מימן על-חמצני ו- NADH הייצור על ידי המכילות פלווין Dehydrogenases מיטוכונדריאלי

מחקר זה מדגים את השימוש cytometry זרימה כדי לזהות החמצן מגיב מינים (ROS) ייצור הנובע הפעלת FcγR. בשיטה זו ניתן להעריך שינויים מיקרוביאלית, חמצון-חיזור איתות הפונקציה של phagocytes בתגובה מכלולים חיסוניים, מיקרואורגניזמים opsonized או ישירות FcγR cross-linking.

מדידת Cytometric ROS הייצור ב מקרופאגים בתגובה FcγR cross-linking

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לזהות סה כ חמצן הסלולר מינים (ROS) באמצעות 2 ', 7 '-diכלור דיהידרוטסטוסטרון diאצטט (DCFH-DA). שיטה זו יכולה להמחיש לוקליזציה של רוס הסלולר בתאי חסיד עם מיקרוסקופ פלואורסצנטית ועוצמה ROS מכמת עם קורא צלחת הקרינה. פרוטוקול זה הוא פשוט, יעיל וחסכוני.

גילוי של מינים החמצן תגובתי כוללת בתאי חסיד על ידי 2 ', 7 '-Diכלור דיהידרוטסטוסטרון di, מכתים

כאן, אנו מציעים פרוטוקול שיטתי, נגיש, לשחזור כדי לזהות מינים חמצן תגובתי תאית (ROS) באמצעות 2′,7′-dichlorofluorescein diacetate בדיקה (DCFH-DA) בתאי גליה מולר (MGCs). שיטה זו מכמתת את סך רמות ה- ROS התאיות עם ציטומטר זרימה. פרוטוקול זה קל מאוד לשימוש, מתאים וניתן לשחזור.

כימות של מינים חמצן תגובתי באמצעות 2′,7′-Dichlorofluorescein Diacetate בדיקה וזרימה-Cytometry בתאי גליה מולר

וידאו זה מספק פרוטוקול מפורט לחקר פרופיל פרמקולוגי של TRPA1 ערוצי אנושי באמצעות FlexStation 3. פרוטוקול מכסה הפרטים של הכנת התאים, טוען לצבוע ותפעול של הקורא microplate, FlexStation 3.

תא מבוססי סידן Assay עבור בינוני עד הקרנת תפוקה גבוהה של פונקציות TRP באמצעות ערוץ FlexStation 3

למדו שיטה לכימות ROS בתפוקה גבוהה באמצעות צבע פלואורסצנטי DHE בתאי קרצינומה hepatocellular. פרוטוקול זה מאפשר מדידה מדויקת של רדיקלי סופראוקסיד בטוקסיקולוגיה וביולוגיה של תאים.

הערכת סינון בתפוקה גבוהה של ייצור מיני חמצן תגובתי (ROS) באמצעות צבע פלואורסצנטי Dihydroethidium (DHE)

גלה סרטונים נוספים