Name: אימות ראשוני של קואורדינטות הזרקה סטריאוטקסיות באמצעות קריוסקציה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-19T12:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 48 s
Description: למד שיטה לאימות מהיר של קואורדינטות הזרקה סטריאוטקסיות בעכברים באמצעות צבעי זיהוי. הפרוטוקול מקצר משמעותית את זמן האימות לפני מעקב ויראלי במחקרי מוח ונוירואנטומיה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מענק מס '82101249 ל- XY Sun), קרן המחקר לפוסט-דוקטורט של סין (מענק מס '2022M722125 ל- XY Sun). תוכנית השייט של שנחאי (מענק מס' 21YF1425100 לש.ש. צ'ן). פרויקט מיוחד למחקר קליני של ועדת הבריאות העירונית של שנחאי (מענק מס '202340088 לג'יי ג'ואו). הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מענק מס '82101262 ל- X Zhang, מענק מס '82101287 ל- SH Chen).

כל הניסויים בבעלי חיים נערכו בהתאם להנחיות Animal Research Reporting In Vivo Experiments (ARRIVE) ולמדריך המכונים הלאומיים לבריאות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. המחקר הנוכחי אושר על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של בית החולים רנג'י, בית הספר לרפואה של אוניברסיטת ג'יאוטונג בשנחאי. במחקר הנוכחי נעשה שימוש בעכברים זכרים C57BL/6J בני שמונה שבועות. בעלי החיים הושגו באופן מסחרי (ראו טבלת חומרים) ושוכנו בכלובים סטנדרטיים (22°C ±-2°C, 12 שעות/12 שעות מחזור אור/חושך, מזון ומים עד לליביטום).
1. בחירת אזורי מטרה במוח
הערה: זהו הליך סטרילי. ודא שכל כלי הניתוח מעוקרים. יש לרסס את הכפפות באלכוהול לפני מגע עם כלי ניתוח. הימנע מלגעת בקצה המכשירים או באזור הניתוח עם כפפות. ודא שהעכבר מורדם כראוי לפני תחילת ההליך על ידי בדיקת אובדן רפלקסים נכונים וללא תגובה לגירוי עורי. לפני הקידוח וההזרקה, עקוב מקרוב אחר קצב הנשימה (60-220 נשימות לדקה, ממוצע 100-150 נשימות לדקה) ומשרעת הנשימה (צריכה להיות עקבית ולא רדודה או עמוקה מדי). יש לציין כל שינוי משמעותי בקצב הנשימה או באמפליטודה.
<ol><li>מרדימים את העכבר עם הזרקה intraperitoneal של 1.25% tribromoethanol (250 מ"ג / ק"ג) באמצעות מחט 29 גרם. יש לגלח את השיער על הגולגולת ברגע שהרפלקס הנכון נעלם. אבטח את העכבר במסגרת הסטריאוטקסית (ראה טבלת חומרים) על ידי קיבוע החותכות העליונות עם מהדק אף וייצוב הראש באמצעות שני מוטות אוזניים.</li>
	<li>יש למרוח משחה אופתלמית למניעת יובש בעיניים. יש לחטא את הקרקפת על ידי ספוג שלוש פעמים עם אנרדיאן (תמיסת חיטוי; ראו טבלת חומרים). הזריקו 0.2 מ"ל של לידוקאין 1% תת עורית באמצעות מחט אינסולין 29 גרם כדי לספק שיכוך כאבים מקומי.</li>
	<li>בצע חתך של 0.5 ס"מ באמצעות מספריים בעין כדי לחשוף את הגולגולת. השתמש בצמר גפן טבול עם 3% H2O2 כדי לקרצף את הגולגולת החשופה כדי להסיר את periosteum. הניחו לגולגולת להתייבש.</li>
	<li>הצמידו את המקדחה למכשיר הסטריאוטקסי. כוונן את ידיות הזרועות הסטריאוטקסיות כך שימקמו את קצה המקדחה בדיוק בברגמה בעזרת זכוכית מגדלת ורשום את ערך ציר z באמצעות צג LCD דיגיטלי.<ol><li>כוונן את הידיות ומקם את קצה המקדחה בלמדא ורשום את הערך של ציר z. כוונן את מהדק האף ואת מוטות האוזניים כדי לקרב שני ערכי z, וחזור על השלבים לעיל עד שההפרש בין שני ערכי z קטן מ- 0.1 מ"מ. הערה: צירי x, y ו-z בצג LCD דיגיטלי תואמים לצירים בינוניים (ML), אנטרופוסטריים (AP) וגב-ונטרליים (DV), בהתאמה. הברגמה והלמבדה יכולות להיחשב כנמצאות באותו מישור אופקי כאשר ההפרש בין שני ערכי z קטן מ-0.1 מ"מ.</li>
	</ol></li>
	<li>ודא את רמת שמאל-ימין של המוח. התאימו את מוטות האוזניים המחוברים למסגרת הסטריאוטקסית באותו קנה מידה. קח את הגרעין tegmental laterodorsal, החלק הגחוני (LDTgV), למשל; הקואורדינטות הסטריאוטקסיות שלו הן -5.2 עבור x, +0.8 עבור y, -4.0 עבור z, על פי Paxinos ואטלס מוח העכבר של פרנקלין16.<ol><li>כוונן את מוט האוזן כדי לבצע את המקדחה ב- (-5.2, +0.8) כדי למדוד את ערך z בכיוון הגב-גחוני והזז את המקדחה ל- (-5.2, -0.8) כדי למדוד את ערך z. הערה: שמאל-ימין נחשב ברמה שווה כאשר ההפרש בין שני ערכי z קטן מ- 0.2 מ"מ. יש להחדיר את מוטות האוזניים למקום הנכון מכיוון שהבשר השמיעתי החיצוני סימטרי. אם ההפרש בין שני ערכי z הוא יותר מ-0.5 מ"מ, ייתכן שמוט האוזן יוכנס למקום הלא נכון.</li>
	</ol></li>
	<li>מקם שוב את המקדחה לברגמה והגדר שלוש קואורדינטות בצג הדיגיטלי LCD לאפס. מקם את המקדחה מעל אזור העניין באמצעות קואורדינטות ייחוס. התחל את התרגיל.<ol><li>מנמיכים בהדרגה את המקדחה באמצעות הזרוע האנכית עד שהיא חודרת את הגולגולת. יש לפנות פסולת ודם באמצעות צמר גפן. הערה: היזהר שלא לפגוע ברקמת המוח.</li>
	</ol></li>
</ol>2. הכנת תמיסת צבע ומיקרו-הזרקה למוח
<ol><li>יש ליטול 25 μL של מאגר טעינה SDS-PAGE המכיל ברומופנול כחול (ראה טבלת חומרים) לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה של 200 μL. הוסף 50 μL של ddH2O לצינור כדי להכין את תמיסת הצבע.</li>
	<li>כסו את חלון הגולגולת בפד צמר גפן לח במי מלח. להבטיח פטנט microsyringe על ידי שאיפה וגירוש מלוחים שוב ושוב. טען 0.3 מיקרוליטר של צבע לתוך מזרק מיקרו. חבר את המזרק ואת המיקרו-מזרק הסטריאוטקסי הממונע לזרוע הסטריאוטקסית.</li>
	<li>מקם את קצה המזרק בברגמה והגדר את הקואורדינטות לאפס בצג LCD דיגיטלי. להתאים את המחט לאזור העניין על פי קואורדינטות התייחסות. הגדר את מהירות ההזרקה ל -0.1 μL / min והפעל את המיקרו-מזרק הממונע, המספק 0.3 μL של צבע כחול לאזור המטרה. השאירו את המזרק במקומו לפחות 10 דקות לפני שתמשכו את המזרק באיטיות. הערה: ניתן להשתמש בצבעים שונים באותם עכברים כדי להבחין בין אזורים קרובים. בדוק צבעים אחרים עבור ריכוזים מתאימים בהתבסס על התכונות הפיזיות שלהם. מומלץ להשתמש בפורמולה הכחולה ברומופנול ולשטוף היטב את המזרק לפני ואחרי השימוש כדי למנוע סתימות. התאמת נפחי ההזרקה בהתבסס על דיפוזיית צבע.</li>
</ol>3. קצירת רקמת מוח והקפאה
<ol><li>שחרר את העכבר מהמסגרת הסטריאוטקסית. להרדים את העכבר עם הזרקה intraperitoneal של 50 מ"ג / ק"ג נתרן pentobarbital באמצעות מחט 29 גרם. אבטח את העכבר על לוח קצף באמצעות סרט הדבקה.</li>
	<li>פתח את שני צידי בית החזה כדי לגרום לחנק מהיר. בצע חתך של 1-2 מ"מ בתוספתן פרוזדורים ימני. הכנס מחט עירוי לחדר השמאלי. להחדיר 20 מ"ל של מלוחים מקוררים מראש ו 20 מ"ל של תמיסת 4% paraformaldehyde קר.</li>
	<li>ערפו את ראשו של העכבר בעזרת מספריים לניתוח רקמות (בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי המוסד). הסר את העור על ידי ביצוע חתך לאורך קו האמצע מהצוואר אל האף ולאחר מכן לחשוף את הגולגולת. נקה שאריות שריר על הגולגולת עם מלקחיים או מספריים.</li>
	<li>מקמו את קצה להב אחד של המספריים העדינים בין הפתח מגנום למוח, כאשר הקצה החד פונה אל העצם, בקצה הרוסטרלי של התפר האמצעי. המשך להחליק ולחתוך את הגולגולת לאורך התפר באמצע sagittal. השתמשו במלקחיים כדי להסיר את הגולגולת, וחשפו את המוח החשוף. הערה: יש לנקוט משנה זהירות כדי להימנע מגרימת נזק למוח במהלך הניתוח. לפני הסרת שבבי העצם, לקלף בזהירות את כל קרומי המוח שעשויים להיות מחוברים לגולגולת. אמצעי זהירות זה חיוני למניעת חיתוך לא מכוון של רקמת המוח במהלך התהליך.</li>
	<li>הפעל את עוצמת הקריוסטט הסיבובי של המיקרוטום (ראה טבלת חומרים) והגדר את טמפרטורת התא ל -20 מעלות צלזיוס. יוצקים מעט תרכובת OCT כדי לכסות את פני השטח של דיסק הדגימה באופן שווה. הכניסו אותו לתא ההקפאה ואפשרו ל-OCT להתמצק.</li>
	<li>חבר את הדיסק לראש הדגימה. קרב את הלהב לבלוק וחתוך את בלוק OCT כדי ליצור מישור שטוח המקביל לדיסק.</li>
	<li>חותכים את המוח בכיוון העטרה הרחק מאתר ההזרקה בתבנית פרוסת מוח על ידי להב גילוח. הניחו את רקמת המוח המכילה את אתר ההזרקה עם הצד החתוך כלפי מטה במישור השטוח OCT.<ol><li>שפכו OCT על המוח והכניסו את הדיסק לתא ההקפאה, מה שמאפשר לגוש הדגימה להתמצק. שפכו OCT שוב ושוב על המוח עד שהמוח מוטמע במלואו ב-OCT. הערה: הוסף את OCT מורכב שכבה אחר שכבה. לאחר שהשכבה הקודמת של OCT הוקפאה, שפכו את השכבה הבאה של תרכובת OCT על המוח.</li>
	</ol></li>
	<li>חתוך את גוש הדגימה עד שאזור היעד מתקרב. בצע מספר קטעים מרמת אתר ההזרקה. אספו את פרוסות המוח העטרה לתוך צלחת בת 6 בארות המכילה PBS בטמפרטורת החדר באמצעות מברשת כתיבה קטנה הנשמרת בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס. הערה: הגדר את עובי החיתוך לעובי גדול יותר כדי לחתוך את הבלוק, ולאחר מכן הגדר את עובי החיתוך ל- 40 מיקרומטר כאשר הלהב מתקרב לאתר ההזרקה. אם משתמשים בעוקבים אחר מעגלים עצביים, העכברים אינם מוקרבים מיד. הניחו את העכבר בכלוב התאוששות סטרילי לאחר הניתוח מעל שמיכת חימום לצורך התאוששות מהרדמה. החזירו את העכברים לכלוב המקורי או לכלוב חדש ברגע שיתעוררו.</li>
</ol>4. הדמיה
<ol><li>שטפו את ה-OCT עם PBS בטמפרטורת החדר. השתמשו במברשת כדי לאסוף אזורים במוח ולמקם אותם על שקופית. הניחו לחלקים להתייבש באוויר בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>התבונן באזור המוזרק באופן חזותי או השתמש במיקרוסקופ כאשר גרעיני המטרה זעירים. השווה את מיקום הצבע המוזרק לאזור המתאים באטלס המוח. הערה: התאם את הערכים של צירי x, y ו- z בהתאם לכיוון ולמרחק של סטיית נקודת ההזרקה. ייתכן שיהיה צורך לחזור על כל השלבים בפרוטוקול זה מספר פעמים כדי לקבוע את הקואורדינטות במדויק.</li>
</ol>

אופטימיזציה של דיוק מיקרו-הזרקה סטריאוטקסית בעכברים

<ol><li>Liu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-derived+neurotrophic+factor-mediated+projection-specific+regulation+of+depressive-like+and+nociceptive+behaviors+in+the+mesolimbic+reward+circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Brain-derived neurotrophic factor-mediated projection-specific regulation of depressive-like and nociceptive behaviors in the mesolimbic reward circuitry.</a> Pain. 159 (1), 175(2018).</li>
<li>Gan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Layer-specific+pain+relief+pathways+originating+from+primary+motor+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Layer-specific pain relief pathways originating from primary motor cortex.</a> Science. 378 (6626), 1336-1343 (2022).</li>
<li>Laing, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anterior+hypothalamic+parvalbumin+neurons+are+glutamatergic+and+promote+escape+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Anterior hypothalamic parvalbumin neurons are glutamatergic and promote escape behavior.</a> Curr Biol. 33 (15), 3215-3228 (2023).</li>
<li>Perens, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+3D+mouse+brain+atlas+framework+with+the+skull-derived+coordinate+system%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroinformatics%22%5BJournal%5D)">Multimodal 3D mouse brain atlas framework with the skull-derived coordinate system.</a> Neuroinformatics. 21 (2), 269-286 (2023).</li>
<li>Adhikari, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basomedial+amygdala+mediates+top-down+control+of+anxiety+and+fear%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Basomedial amygdala mediates top-down control of anxiety and fear.</a> Nature. 527 (7577), 179-185 (2015).</li>
<li>Tao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projections+from+infralimbic+cortex+to+paraventricular+thalamus+mediate+fear+extinction+retrieval%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Bull%22%5BJournal%5D)">Projections from infralimbic cortex to paraventricular thalamus mediate fear extinction retrieval.</a> Neurosci Bull. 37 (2), 229-241 (2021).</li>
<li>Haggerty, D. L., Grecco, G. G., Reeves, K. C., Atwood, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+viral+vectors+in+neuroscience+research%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated viral vectors in neuroscience research.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 17, 69-82 (2020).</li>
<li>Ansarifar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+volume+and+expression+time+in+an+aav-delivered+channelrhodopsin%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Brain%22%5BJournal%5D)">Impact of volume and expression time in an aav-delivered channelrhodopsin.</a> Mol Brain. 16 (1), 77(2023).</li>
<li>Gonzalez, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-guided+AAV+capsid+evolution+strategies+for+enhanced+CNS+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Structure-guided AAV capsid evolution strategies for enhanced CNS gene delivery.</a> Nat Protoc. 18 (11), 3413-3459 (2023).</li>
<li>Sun, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+parallel+medial+prefrontal+cortex-amygdala+pathways+mediate+memory+deficits+via+glutamatergic+projection+in+surgery+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Two parallel medial prefrontal cortex-amygdala pathways mediate memory deficits via glutamatergic projection in surgery mice.</a> Cell Rep. 42 (7), 112719(2023).</li>
<li>Koren, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insular+cortex+neurons+encode+and+retrieve+specific+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Insular cortex neurons encode and retrieve specific immune responses.</a> Cell. 184 (25), 6211(2021).</li>
<li>Poller, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+motor+and+fear+circuits+regulate+leukocytes+during+acute+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Brain motor and fear circuits regulate leukocytes during acute stress.</a> Nature. 607 (7919), 578-584 (2022).</li>
<li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+visual+circuit+related+to+habenula+underlies+the+antidepressive+effects+of+light+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A visual circuit related to habenula underlies the antidepressive effects of light therapy.</a> Neuron. 102 (1), 128-142 (2019).</li>
<li>Hu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+visual+circuit+related+to+the+periaqueductal+gray+area+for+the+antinociceptive+effects+of+bright+light+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A visual circuit related to the periaqueductal gray area for the antinociceptive effects of bright light treatment.</a> Neuron. 110 (10), 1712-1727 (2022).</li>
<li>Du, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+stepwise+tracing+of+polysynaptic+neuronal+circuits+with+replication-deficient+pseudorabies+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep+Methods%22%5BJournal%5D)">Directed stepwise tracing of polysynaptic neuronal circuits with replication-deficient pseudorabies virus.</a> Cell Rep Methods. 3 (6), 100506(2023).</li>
<li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+mouse+brain+in+stereotaxic+coordinates.+2nd+ed%22">The mouse brain in stereotaxic coordinates. 2nd ed</a>. , Academic Press. (2001).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים מתחרים.

מאמר זה תיאר אסטרטגיה יציבה לאימות הדיוק של זריקות מוח סטריאוטקסיות 5,6 מהר יותר ופשוט לפני מעקב נגיפי, אך ההיבט חסר התחליף של ביטוי גנים מדווח באזור המוח הוא חיוני לתיוג אזור המוח. הצבע הכחול בו השתמשנו איפשר הדמיה מיידית של אתר ההזרקה.
מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול זה תורמים לשיפור הדיוק של אתר ההזרקה. ראשית, הבטחת רמת שמאל-ימין של המוח במכשיר הסטריאוטקסי משלב 1.5; שלב זה דורש מהמפעילים להכיר את האנטומיה של הגולגולת, ולוודא שמוטות האוזניים ממוקמים במיקום הנכון. המאזניים על מוטות האוזניים והמסגרת הסטריאוטקסית משמשים גם הם כהתייחסויות. שנית, מציאת נקודת האפס המדויקת, הברגמה, בשלב 1.6 ושלב 2.3. לעיתים, פער משמעותי בקואורדינטות שנמצאו בשלבים 1.6 ו-2.3 נובע מהבדל ניכר במיקום נקודת האפס. זה יכול לגרום לכך שמחט המיקרו-מזרק לא תוכל לחדור את חלון הגולגולת. במקרים כאלה, יש צורך למקם מחדש את נקודת האפס ואם יש צורך, יש ליצור חלון גולגולת חדש. למרות זאת, עדיין חיוני להקים מחדש את נקודת האפס ולמצוא את הקואורדינטות מחדש בשלב 2.3; לא ניתן להכניס ישירות את המיקרו-מזרק מחלון הגולגולת שנעשה בעבר.
בהשוואה לחיתוך מוח לא קפוא בתבנית פרוסת מוח של עכבר, אסטרטגיה זו מספקת תוצאה מדויקת יותר מכיוון שגוש הדגימה המוצק מונע מהלהב לסחוט את המוח ולגרום לעקירת הצבע מנקודות ההזרקה. יתר על כן, חלקי מוח שנחתכו על ידי תבנית פרוסת מוח הם עבים יחסית ואינם אפשריים למיקום גרעיני מוח קטנים. עם זאת, בהשוואה לתהליך ההקפאה הסטנדרטי של רקמת המוח 11,12,13,14,15, קיצרנו את משך העיבוד בלפחות 72 שעות על ידי דילוג על שלבי ההתייבשות, מה שהביא לכך שחלקי המוח היו שבירים יותר וקשים יותר להרים על מגלשת זכוכית, מה שמייצג חולשה גדולה של פרוטוקול זה.
בעת יצירת חלונות הגולגולת להזרקת צבע, הצמדת מקדח השיניים בחוזקה לזרוע הסטריאוטקסית, במקום להחזיק אותו ביד, מקלה על השליטה בעומק הקידוח באמצעות ידית הכוונון העדינה, ובכך מצמצמת את האפשרות לפגיעה ברקמת המוח.
לסיכום, מחקר זה סיפק שיטה מבטיחה לאימות ראשוני של הקואורדינטות הסטריאוטקסיות המדויקות לפני המעקב הנגיפי, מה שהופך את תהליך התיוג והמעקב אחר תאי העצב שלאחר מכן לאמין יותר.

כמעט כל הכלים הנוירומודולטיביים המודרניים, כולל רישום סידן in vivo, כלים אופטוגנטיים וכימוגנטיים, דורשים שימוש בקואורדינטות סטריאוטקסיות כדי להתמקד באזור המוח המעניין 1,2,3, ויוצרים את הבסיס למניפולציה עצבית. קואורדינטות סטריאוטקסיות עבור אזורי מוח של עכברים מוגדרות ביחס לברגמה ולמבדה, ציוני הדרך הגרמיים על הגולגולת, ויוצרים את מה שמכונה מערכת קואורדינטות סטריאוטקסית שמקורה בגולגולת. ברגמה או למדא יכולות לשמש כנקודת האפס של הקואורדינטות התלת-ממדיות. שלושת הצירים הם אנטרופוסטריורי (AP), בינוני (ML) ודורסו-ונטרלי (DV), המייצגים את צירי y, x ו-z בתצוגה דיגיטלית של מכשירים סטריאוטקסיים. עבור אזורי מוח ידועים, ניתן לקבל את פרמטרי הקואורדינטות הסטריאוטקסיות של אזור מסויםמאטלסים 4 של מוח עכבר (למשל, מוח העכבר של פקסינוס ופרנקלין בקואורדינטות סטריאוטקסיות) ו/או מהספרות שפורסמה 5,6. עם זאת, יש צורך בתיקוף נוסף בשל שינויים בציוד סטריאוטקסי ובגיל/אוכלוסיות העכברים המשמשים חוקרים שונים.
מבנה הוא הבסיס לתפקוד. מעגלים עצביים מהווים את הבסיס לתפקודי מוח רבים, כגון פעילויות קוגניטיביות, רגש, זיכרון, תפקודים חושיים ומוטוריים1. תיוג המבנה ומניפולציה של הפעילות של מעגלים עצביים חיוניים להבנת תפקודו של מעגל עצבי מסוים. במהלך העשורים האחרונים, עוקבים עצביים התפתחו במשך דורות רבים; מחקרים מוקדמים אימצו את נבט החיטה אגלוטינין (WGA) ופאזולוס וולגריס אגלוטינין (PHA) כעוקבים אנטרוגרדיים, ואת פלואורוגולד (FG), תת-יחידה B של רעלן כולרה (CTB), קרבוציאנין כעוקבים מדרדרים. עם זאת, שלא כמו נותבים נגיפיים, עוקבים עצביים מסורתיים אלה אינם יכולים לשלב גנים אקסוגניים בפונדקאי, וגם אין להם סלקטיביות מסוג התא. כיום, האסטרטגיה הוויראלית הפכה להצעה חשובה במהלך מחקר בסיסי במדעי המוח. למטרות מחקר שונות, ניתן לבחור כלים ויראליים שונים 7,8. ישנם וירוסים שאינם טרנססינפטיים, וירוסים טרנס-מולטיסינפטיים (מדרדרים ואנטרוגרדים), ונגיפים טרנס-מונוסינפטיים (מדרדרים ואנטרוגרדים). כל קטגוריה מכילה מספר סוגים עם מאפיינים מתאימים.
תהליך הניהול והביטוי של הנגיפים הוא עתיר זמן ומשאבים, ולעתים קרובות לוקח שבועות ואף יותר. בין וקטורים נגיפיים שונים, וירוס הקשור באדנו זוהה כאמצעי מבטיח להעברת גנים, ומספק חלון רחב הנע בין 3 ל 8 שבועות לאחר ההזרקה להליך הניסוי 7,8. ככל ש- AAV מתפתח, ניתוח יכול להתבצע 2-3 שבועות לאחר מתן 9,10. עוקבים אחרים של מעגלים עצביים, כגון וירוס פסאודורבי (PRV) ונגיף הכלבת (RV), דורשים גם הם תקופת מעקב של לפחות 2-7 ימים 11,12,13,14,15. לפיכך, אימות ראשוני של אתר ההזרקה לפני צפייה באותות פלואורסצנטיים הוא גם זמן וגם חסכוני.
כדי לאפשר אימות פשוט ומהיר של הזרקות סטריאוטקסיות, במחקר זה, צבע ניתן לפני וקטורים נגיפיים, והקפאה מאפשרת לחוקרים לצפות באתר ההזרקה ולעקוב אחריו תוך 30 דקות לאחר ההזרקה.

<table><tbody><tr><td>1.0 ומיקרו; L, מזרק נוירוס, דגם 7001 KH, 32 גרם, פוינט סטייל 3</td><td>המילטון</td><td>65458-01</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; L קצות פיפטה</td><td>biosharp</td><td>BS-200-T</td><td></td></tr><tr><td>20 מ"ל מזרק</td><td>חביב קבוצה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3% H2O2 פתרון</td><td>Lircon Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>6 בארות צלחת</td><td>Shengyou Biotech</td><td>20006</td><td></td></tr><tr><td>Anerdian</td><td>Likang היי-טק</td><td>31001002</td><td></td></tr><tr><td>אנטי גלגול צלחת</td><td>Leica</td><td>14047742497</td><td></td></tr><tr><td>BD אינסולין מזרק</td><td>בקטון, דיקינסון ושות'</td><td>328421</td><td></td></tr><tr><td>כיפוף מלקחיים לניתוח שיניים</td><td>Jinzhong</td><td>JD1050</td><td></td></tr><tr><td>Cellens תוכנת מימד</td><td>אולימפוס</td><td></td><td></td></tr><tr><td>צמר גפן</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>23-400-122</td><td></td></tr><tr><td>Dapi-Fluoromount-G</td><td>Southernbiotech</td><td>0100-20</td><td></td></tr><tr><td>מקדחה</td><td>Longxiang</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מברשות עדינות</td><td>HWAHONG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מספריים עדינים</td><td>Jinzhong</td><td>y00030</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופיה פלורסנט</td><td>אולימפוס</td><td>BX63</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוטום מקפיא</td><td>Leica</td><td>CM1950</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים המוסטטיים ישר עם שן</td><td>Jinzhong</td><td>J31010</td><td></td></tr><tr><td>מחט עירוי 0.7 מ"מ</td><td>קבוצה חביבה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>הזרקת לידוקאין הידרוכלוריד</td><td>חברת התרופות קציר 71230803</td><td></td><td></td></tr><tr><td>זכוכית מגדלת</td><td>M& G Chenguang נייר מכתבים</td><td></td><td></td></tr><tr><td>זכר C57/BL עכברים</td><td>מכון שנחאי לחקר הורות מתוכננת&ndash; BK מעבדה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>עכברים עובש פרוסת מוח קורונלית</td><td>RWD מדעי החיים</td><td>68713</td><td></td></tr><tr><td>צינור מיקרוצנטריפוגה</td><td>biosharp</td><td>BS-02-P</td><td></td></tr><tr><td>להבי מיקרוטום</td><td>Leica</td><td>819</td><td></td></tr><tr><td>משחת עיניים</td><td>חברת התרופות Cisen G23HDM9M4S5</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פרפורמלדהיד</td><td>Biosharp</td><td>BL539A</td><td></td></tr><tr><td>משאבות פריסטלטיות</td><td>מנגנון הרווארד</td><td>70-4507</td><td></td></tr><tr><td>פוספט חוצץ מלח</td><td>Servicebio</td><td>G4202</td><td></td></tr><tr><td>Piette 2-200 &mu; L</td><td>thermofisher</td><td>4642080</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE טעינת דגימה המכילה ברומופנול כחול</td><td>Beyotime</td><td>P0015A</td><td></td></tr><tr><td>להבי גילוח</td><td>BFYING</td><td>91560618</td><td></td></tr><tr><td>Slides</td><td>Citotest Scientific</td><td>188105</td><td></td></tr><tr><td>מכשיר סטריאוטקסי</td><td>RWD Life Science</td><td>68807</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים לניתוח שיניים ישרות</td><td>Jinzhong</td><td>JD1060</td><td></td></tr><tr><td>מחזיק מזרק</td><td>RWD Life Science</td><td>68206</td><td></td></tr><tr><td>מספריים לרקמות</td><td>Jinzhong</td><td>J21040</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T תרכובת</td><td>סאקורה</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>טריברומו-אתנול</td><td>Aibei ביוטכנולוגיה</td><td>M2910</td><td></td></tr></tbody></table>

אימות ראשוני של קואורדינטות הזרקה סטריאוטקסיות באמצעות קריוסקציה

Preliminary Validation of Stereotaxic Injection Coordinates via Cryosectioning

הזרקה סטריאוטקסית של אזור מסוים במוח מהווה טכניקה ניסיונית בסיסית במדעי המוח הבסיסיים. חוקרים בדרך כלל מבססים את בחירתם בפרמטרים של הזרקה סטריאוטקסית על אטלסים של מוח עכבר או חומרים שפורסמו שהשתמשו באוכלוסיות/גילאים שונים של עכברים ובציוד סטריאוטקסי שונה, מה שמחייב אימות נוסף של פרמטרי הקואורדינטות הסטריאוטקסיות. היעילות של דימות סידן, מניפולציות כימוגנטיות ואופטוגנטיות מסתמכת על ביטוי מדויק של גנים מדווחים באזור המעניין, הדורש לעתים קרובות מספר שבועות של מאמץ. לכן, זוהי משימה גוזלת זמן אם הקואורדינטות של אזור המוח היעד אינן מאומתות מראש. באמצעות שימוש בצבע מתאים במקום וירוס ויישום קריוסקציה, החוקרים יכולים לצפות באתר ההזרקה מיד לאחר מתן הצבע. זה מאפשר התאמות בזמן כדי לתאם פרמטרים במקרים שבהם קיימים פערים בין אתר ההזרקה בפועל לבין המיקום התיאורטי. התאמות כאלה משפרות באופן משמעותי את דיוק ביטוי הנגיפים באזור המטרה בניסויים הבאים.

מחקר זה זיהה בהצלחה את אתר ההזרקה תוך 30 דקות באמצעות השיטה שהודגמה. בתחילה, תמיסת טעינת דגימות SDS-PAGE המכילה ברומופנול כחול הוזרק לתוך LDTgV בעכברי C57/BL. איור 1A מראה ייצוג סכמטי של הזרקת תמיסת הצבע. התפלגות הצבע הכחול ב-LDTgV מודגמת באיור 1B.
ברומופנול כחול הוזרק גם לקליפת המוח הקדם-מצחית האמצעית (mPFC), לקליפת המוח האינפרא-לימבית של קליפת המוח הקדם-מצחית האמצעית ולאמיגדלה הבסומדיאלית (BMA) כדי להעריך את האוניברסליות של פרוטוקול זה. כפי שניתן לראות באיור 1C-E ובאיור 2A, הצבע הכחול התפזר בקליפת המוח הקדם-מצחית האמצעית (mPFC), בקליפת המוח האינפרא-לימבית של קליפת המוח הקדם-מצחית האמצעית וב-BMA.
יתר על כן, וירוס הקשור לאדנו הנושא חלבון mCherry פלואורסצנטי הוזרק לתוך LDTgV (הקואורדינטות אומתו באמצעות תמיסת הצבע). הביטוי של הנגיף לקח ארבעה שבועות. ההתפלגות של תאי עצב mCherry+ ב-LDTgV מתוארת באיור 2B.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66262/66262fig01.jpg"> איור 1: הזרקת תמיסת צבע. (A) תרשים סכמטי של הזרקת תמיסת הצבע. (B) התפלגות הצבע הכחול ב-LDTgV. (C) התפלגות הצבע הכחול בקליפת המוח הפרה-לימבית mPFC. (D) התפלגות הצבע הכחול בקליפת המוח האינפרא-לימבית mPFC. (E) התפלגות הצבע הכחול ב-BMA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66262/66262fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66262/66262fig02.jpg"> איור 2: התפלגות הצבע הכחול והתפלגות mCherry שנצפו במיקרוסקופ. (A) התפלגות הצבע הכחול בקליפת המוח הקדם-מצחית האמצעית (הגדלה פי 10, סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר). (B) תמונה מייצגת של התפלגות mCherry באזור LDTgV שנרכשה במיקרוסקופ פלואורסצנטי (הגדלה פי 10, סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66262/66262fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

הפרוטוקול הנוכחי מתאר אסטרטגיה מעשית לזרז את שלב האימות של קואורדינטות הזרקה סטריאוטקסיות לפני ביצוע מעקב נגיפי באמצעות צבעים ומקטעים קפואים.

Stereotaxic injection of a specific brain region constitutes a fundamental experimental technique in basic neuroscience. Researchers commonly base their ...

המחקר שלנו מתמקד בעיקר בחקירת מנגנון המעגלים העצביים העומד בבסיס ליקוי קוגניטיבי בעכברים. ואנו משתמשים לעתים קרובות בטכניקות סטריאוטקסיות במוח במחקרים אלה. מטרתנו היא לייעל ולהאיץ את תהליך האימות של אתרי הזרקה סטריאוטקסיים באמצעות צבעים, ולהבטיח שהוא יהפוך להליך פשוט ומהיר.אסטרטגיות שונות הפכו חיוניות במחקר מדעי המוח באמצעות הזרקה סטריאוטקסית של וירוס. זה ואחריו תצפית של סמנים פלואורסצנטיים בפרוסת רקמה כדי לאשר את אתרי ההזרקה, תהליך שלוקח כמה שבועות כדי להשלים. הפרוטוקול שלנו מציע יתרונות על פני טכניקות אחרות על ידי חיסכון של לפחות שלושה ימים של זמן התייבשות ושימוש בצבע חסכוני לזיהוי מהיר יותר של אתרי הזרקה.זה עשוי לחסוך שבועות בהשוואה ללא אימות ראשוני.

preliminary-validation-stereotaxic-injection-coordinates-via

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

ניתוח Stereotaxic על מכרסמים מאפשר ניהול ממוקד של תרופות או גירוי חשמלי והקלטות ב ער, התנהגות בעלי חיים. במצגת וידאו זה נדגים חידודים פרוצדורליים האחרונות להליך ארוכת זה כי שיעור ההישרדות משופרת בהצלחה ואובדן מופחת לאחר הניתוח המשקל.

מכרסמים כירורגיה Stereotaxic ועל צער בעלי חיים שיפורים תוצאה של ההתנהגות Neuroscience

אבלציה ממוקד באזור ספציפי במוח (ים) על ידי עירוי של excitotoxin באמצעות קואורדינטות stereotaxic מתואר. טכניקה זו יכולה גם להיות מותאם עבור עירוי של כימיקלים אחרים במוח חולדה.

ניתוח Stereotaxic על הנגע Excitotoxic של אזורי מוח ספציפיים עכברוש למבוגרים בלבד

מקור: Joshi, K., et al. גישה כירורגית סטריאוטקסית להזרקת מיקרו-גזע המוח הזנבי וחוט השדרה הצווארי העליון דרך ה-Cisterna Magna בעכברים. J. Vis. Exp. (2022)סרטון זה מדגים את הגישה הסטריאוטקסית של ציסטרנה מגנה לאספקה ממוקדת לגזע המוח ולחוט השדרה העליון. על ידי גישה למאגר המים המלא בנוזל השדרה, גישה זו מאפשרת הזרקות מדויקות לאזורים שקשה להגיע אליהם בשיטות סטריאוטקסיות סטנדרטיות.

גישת Stereotaxic Cisterna Magna לאספקה טיפולית במודל עכבר

מקור: Fricano-Kugler, C. J., et al. תכנון, אריזה ואספקה של CRISPR רטרו ולנטי-וירוסים עם טיטר גבוה באמצעות הזרקה סטריאוטקסית. J. Vis. Exp. (2016)סרטון זה מדגים הזרקה ויראלית סטריאוטקסית לעריכה מדויקת של גנים עצביים במוח העכבר. הפרוטוקול מבטיח העברת וירוסים מדויקת לבליטה המשוננת, ומאפשר תיוג פלואורסצנטי ונוקאאוט גנים בתיווך CRISPR לחקור מעגלים עצביים, תפקוד גנים ומנגנוני מחלה in vivo.

הזרקה ויראלית סטריאוטקסית לעריכה גנטית עצבית ממוקדת במוח העכבר

Stereotactic Electroencephalography (SEEG) הוא טכניקה ניתוחית המשמשת בניתוחי אפילפסיה לעזור למקם מוקדים של התקפים. זה גם מאפשר הזדמנות ייחודית לחקור את תפקוד מוח. כאן אנו מתארים כיצד SEEG יכול לשמש כדי לחקור תהליכים קוגניטיביים בבני אדם.

חוקרים את הפונקציה של עומק קליפת מוח ומבנים קורטיקליים שימוש stereotactic Electroencephalography: לקחים מCortex Anterior cingulate

כאן אנו מציגים מתודולוגיה לייצור שבץ מוחי מוקדי בחומר לבן של עכברים על ידי הזרקה מקומית של מעכב סינתאז תחמוצת החנקן (eNOS) בלתי הפיך (L-Nio). מוצגות שתי וריאציות סטריאוטקטיות, מעקב עצבי רטרוגרדי ותיוג ודיסקציה של רקמות טריות המרחיבות את היישומים הפוטנציאליים של טכניקה זו.

שבץ בחומר הלבן צדדי דגם Murine של קורטיקליים לחקר ניוון אקסונלית ולבן Matter לנוירוביולוגיה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול הקפאה של סעיף רקמת מוח מחיות מרובים כחלופה ייעול עיבוד המוח יחיד. זה מפחית את השתנות מכתימים במהלך אימונוהיסטוכימיה, מפחית את הזמן cryosectioning והדמיה.

Cryosectioning בו זמנית של המוח מכרסמים מרובים

פרוטוקול זה מתאר ערכה של שיטות לזיהוי הקישוריות הפונקציונלית הספציפית של כניסות לטווח ארוך מאזורי מוח רחוקים באמצעות הגירוי בתוך המוח בפרוסות מvivo לשעבר.

בזריקות Vivo גרם סטריאוטקאית לגירוי מגנטי של תשומות לטווח ארוך בפרוסות המוח של העכבר

המתואר כאן הוא הליך סטריאוטקטי שיכול למקד אזורים מאתגרים וקשים להשכה למוח (בשל מגבלות מרחביות) באמצעות גישה קורונטית זוויתית. פרוטוקול זה מותאם הן למודלים של עכברים והן למודלים של חולדות וניתן ליישם אותו על יישומים מוחיים מגוונים, כולל השתלת צינורית ומיקרו-נג'קציה של מבנים ויראליים.

גישה סטריאו-טיאו-טסטרואקטיבית מסתגלת לטכניקות רב-תכליתיות במדעי המוח

ניתוח סטריאוטקסי למיקוד אתרי מוח בעכברים כולל בדרך כלל גישה דרך עצמות הגולגולת ומונחה על ידי ציוני דרך בגולגולת. כאן אנו מתווים גישה סטריאוטקסית חלופית כדי להתמקד בגזע המוח הקאודלי ובחוט השדרה הצווארי העליון באמצעות ה-cisterna magna המסתמך על הדמיה ישירה של ציוני דרך של גזע המוח.

גישה כירורגית סטריאוטקסית למיקרו-איניג'קט גזע המוח הקאודלי וחוט השדרה הצווארי העליון באמצעות ציסטרנה מגנה בעכברים

למד שיטה לאימות מהיר של קואורדינטות הזרקה סטריאוטקסיות בעכברים באמצעות צבעי זיהוי. הפרוטוקול מקצר משמעותית את זמן האימות לפני מעקב ויראלי במחקרי מוח ונוירואנטומיה.

אימות ראשוני של קואורדינטות הזרקה סטריאוטקסיות באמצעות קריוסקציה

גלה סרטונים נוספים