מידול ליגנדות למפות הנגזרות מקריומיקרוסקופ אלקטרונים
19 ביולי 2024
פרוטוקול זה מציג את הכלים הזמינים למידול ליגנדות של מולקולות קטנות במפות cryoEM של מקרומולקולות.
אנו מעוניינים להבין את התהליכים הפיזיולוגיים המתרחשים ברחבי התא, במיוחד בממשק הממברנה. אנו משתמשים ב- Cryo-EM כטכניקה עיקרית ועובדים על בעיות ביולוגיות מעניינות ומאתגרות שונות בחקר קומפלקסים מקרומולקולריים מרובים. קביעת המבנים של חלבוני ממברנה וקומפלקסים אחרים הייתה מאתגרת לפני כמה עשורים.
עם זאת, התקדמות טכנית ב- Cryo-EM, חומר ניקוי חדשני ומימטי שומנים ועם תרומות סללו את הדרך לקביעת מבנה מהירה של קומפלקסים אלה. כיום ניתן להשיג מבנים אלה ברזולוציה גבוהה ולהשתמש בהם באופן פוטנציאלי בגילוי תרופות. בחלקיק יחיד Cryo-EM, האתגרים כוללים רכישת דגימה יציבה והומוגנית, הטמעת הדגימה בכיוון אקראי בקרח דק, עיבוד מספר רב של תמונות עם יחס אות לרעש נמוך, וקביעה מדויקת של הכיוון הזוויתי והסיווג במהלך שחזור תלת ממדי.
זיהוי ומידול מולקולות קטנות במפות cryo-EM של קומפלקסים של חלבוני ליגנד הוא מאתגר בשל רעש מובנה בנתונים ורזולוציית מפה איזוטרופית ונמוכה, הטרוגניות הדגימה וגמישות ליגנד. פרוטוקול זה הוא מדריך שלב אחר שלב לזיהוי ומידול ליגנדות ומולקולות ממס ברזולוציה נמוכה עד בינונית Cryo-EM.
סקירה כללית
פרוטוקול זה מציג את הכלים הזמינים למידול ליגנדים של מולקולות קטנות במפות cryoEM של מקרו-מולקולות. המחקר מתמקד בהבנת תהליכים פיזיולוגיים בממשק הממברנה באמצעות cryoEM כדי לתת מענה לאתגרים ביולוגיים שונים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מיקרוסקופיה אלקטרונית קריוגנית (cryoEM)
- קומפלקסים מקרומולקולריים
- גילוי תרופות
רקע
- הבנת תהליכים פיזיולוגיים ברחבי התא.
- אתגרים בקביעת מבנים של חלבוני ממבנה.
- התקדמויות בטכניקות cryoEM.
- חשיבותן של מבנים ברזולוציה גבוהה לגילוי תרופות.
מטרת המחקר
- למידול ליגנדים של מולקולות קטנות במפות cryoEM.
- לשיפור ההבנה של מבנים של חלבונים ממברנליים.
- להקל על קביעה מהירה של מבנים של קומפלקסים לא יציבים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- טכניקת cryoEM של חלקיקים בודדים.
- הטמעת דגימות בקרח דק.
- עיבוד תמונות עם יחס אות לרעש נמוך.
- שחזור תלת-ממדי וסיווג של אוריינטציה זוויתית.
תוצאות עיקריות
- השגת מבנים ברזולוציה גבוהה של חלבוני ממברנה.
- מידול מוצלח של ליגנדים של מולקולות קטנות במפות cryoEM.
- התגברות על אתגרים ביציבות ובהומוגניות של הדגימה.
- קידום הפוטנציאל לגילוי תרופות באמצעות תובנות מבניות.
מסקנות
- CryoEM הוא כלי רב עוצמה לחקר קומפלקסים מקרו-מולקולריים.
- מידול ליגנדים משפר את ההבנה של אינטראקציות של תרופות.
- התקדמויות טכניות ממשיכות לשפר את המחקר בביולוגיה מבנית.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מידול ברזולוציה גבוהה של אינטראקציות בין חלבון לליגנד באמצעות מפות cryoEM הופך לקריטי יותר ויותר עבור שלבים מוקדמים של גילוי תרופות והסרת סיכונים מכניסטיים. היכולת לזהות ולדייק במדויק את קישור הליגנד במבנים מקרומולקולריים מורכבים תומכת בביטחון חיזוי באישור המטרה ומסייעת בקבלת החלטות לגבי תיעוד ותעדוף פורטפוליו. שילוב של תהליכי עבודה מתקדמים ב-cryoEM מאפשר לצוותי ביו-פרמה לטפל בחסר ודאות מבני ולהאיץ את זיהוי המולקולות המובילות (leads) המבוסס על מבנה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר ויזואליזציה ישירה של אתרי קישור של ליגנדים ושל רשתות אינטראקציה במקבצים מקרו-מולקולריים.
- תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי הבהרת הבסיס המבני של המעורבות עם המטרה.
- משפר את רמת הביטחון בחיזוי לצורך תיקוף פונקציונלי של המטרה ומיון בשלבים מאוחרים יותר.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מקל על הכנת מודלים מבניים מתוקשפים עבור זרימות עבודה של סריקה חישובית וניסויית.
- מאפשר זיהוי הדיר בשיטות הניתנות לשחזור של צפיפויות ליגנד והערכה כמותית של מודים של קישור.
- תומך בסטנדרטיזציה של בדיקות על ידי אספקת מבני ייחוס למצבים קשורי-ליגנד ומצבי apo.
מחקר תרגומי ופקליני
- מתאים תובנות מבניות למערכות רלוונטיות למחלה באמצעות מידול של קומפלקסים בעלי חשיבות פיזיולוגית.
- מספק רצף משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני באמצעות תמיכה באופטימיזציה מונחית-מבנה.
- מפחית את הסיכון התרגומי על ידי אישור מעורבות הליגנד במבנים ביולוגיים רלוונטיים.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
תהליך עבודה זה למידול ליגנדים המבוסס על cryoEM מגשר בין שלבי הגילוי המוקדמים, זיהוי תרכובות מובילות (lead identification) ומחקר פרה-קליני, על ידי אספקת נתונים מבניים ברמת ביטחון גבוהה לצורך בדיקת היפותזות ואופטימיזציה של תרכובות.
- ביולוגיה של הגילוי: מאפשרת בחינה מונחית-השערה של קישור ליגנדים וביצוע מודולציה של מסלולים.
- סריקה: מספקת מפות צפיפות ליגנדים כמותיות וניתנות לשחזור לצורך ניתוח השוואתי.
- אנליזה: מספקת קואורדינטות אטומיות מזוקקות ומפות הפרשים לתמיכה בהערכה סטטיסטית של אירועי קישור.
- מחקר תרגומי: מקשר בין ממצאים מבניים למטרות רלוונטיות למחלה ואסטרטגיות של סמנים ביולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת זרימת עבודה סטנדרטית וניתנת להרחבה עבור יוזמות מתמשכות של תכנון תרופות מבוסס מבנה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף מטרות.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של מידול וזיקוק ליגנדים במערכות חלבונים מגוונות.
- ערך אסטרטגי: מסייע בקבלת החלטות go/no-go ומשפר את יעילות ההון על ידי הפחתת סיכון מבני בשלבים מאוחרים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכון ובקידום של מטרות שעברו תיקוף מבני.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בעיבוד נתוני cryoEM, בניית מודלים ותוכנות זיקוק (refinement).
- מחייב גישה לתשתיות מחשוב בעלות ביצועים גבוהים וכלי ויזואליזציה.
- מצריך סטנדרטיזציה בין-צוותית של ספי thresholds למפות, קריטריוני תיקוף וזיקוק קואורדינטות.
- עשוי לדרוש התאמה עבור מחלקות חלבונים שונות, סוגי ליגנדים או רמות רזולוציה שונות.
- תלוי באיכות הדגימה, ברזולוציית המפה ובמגבלות הרעש המולדים בנתוני cryoEM.
