Name: מידול ליגנדות למפות הנגזרות מקריומיקרוסקופ אלקטרונים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: למד מידול ליגנדים קטנים במפות קריומיקרוסקופ אלקטרונים של מקרומולקולות. הפרוטוקול מסביר זיהוי ומידול של ליגנדים ומולקולות ממיס ב-Coot ו-ChimeraX לפיתוח תרופות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ש"י הוא מקבל את מלגת הדוקטורט מ- DAE-TIFR, והמימון מוכר. KRV מכירה במענק DBT B-Life DBT/PR12422/MED/31/287/2014 ובתמיכת המחלקה לאנרגיה אטומית, ממשלת הודו, תחת פרויקט זיהוי מס'. RTI4006.

מידול ליגנדות של מולקולות קטנות במפות CryoEM של מקרומולקולות

למחברים אין מה לחשוף.

השיפורים בחומרה ובתוכנה של המיקרוסקופ הביאו לעלייה במספר מבני ה-cryoEM בשנים האחרונות. למרות שהרזולוציה הגבוהה ביותר שהושגה כרגע ב- cryoEM של חלקיק יחיד היא 1.2 Å 57,58,59, רוב המבנים נקבעים סביב רזולוציית 3-4 Å. מידול ליגנדות במפות ברזולוציה בינונית עד נמוכה יכול להיות מסובך ולעתים קרובות כרוך בעמימות. בהתחשב בשימוש הנרחב ב- cryoEM הן באקדמיה והן בתעשיית הפארמה למחקר תרגומי וגילוי תרופות, הבטחת מודלים נכונים וללא עמימות היא חיונית. לכן, זה נבון לכמת את יכולת הפתרון של אטומי ליגנד על ידי חישוב Q-scores60, אשר זמין כעת EMDB כמדד להערכת איכות המפות ואת ההתאמה של המודל, כמו גם בכימרה.
בדוגמה הראשונה, ChimeraX שימש לחישוב מפת ההבדל במרחב האמיתי בין ה-apo לבין המפות הקשורות לליגנד באנזים M. tuberculosis enolase. הצפיפות הנוספת בסף גבוה מצביעה על נוכחות הליגנד, פוספונולפירובט, באתר הפעיל ו- Mg2+ קשור לליגנד. חשוב לציין שבמקרה הזה, המפה היא ברזולוציה בינונית (3.2 Å), ולא ניתן למדל מולקולות מים בביטחון (איור 1). המגבלה הקשורה לשיטה זו היא שניתן ליישם אותה רק כאשר קשירת ליגנד אינה גורמת לשינויים קונפורמטיביים משמעותיים בחלבון. נורמליזציה של המפה לא בוצעה במקרה זה מכיוון שגם מערכי הנתונים APO וגם מערכי הנתונים הקשורים לליגנד נרכשו באותו גודל פיקסלים ועובדו עם פרמטרים זהים ב- Relion. עם זאת, ראוי לציין כי כאשר משווים מפות שנוצרו על ידי תוכניות שחזור שונות, כגון Relion46,47 ו- CryoSparc61, או באיכות שונה, נורמליזציה של המפות הופכת חיונית לפני שניתן לבצע השוואות משמעותיות.
הדוגמה הבאה היא mGlu5, אשר עובר ארגון מחדש מולקולרי גדול עם קשירה אגוניסטית, כפי שניתן לראות ממבני cryoEM51,62 (איור 2). בתרחיש זה, לא ניתן לחשב מפת הפרשים פשוטה בין קולטנים לא מאוגדים (apo) וקולטנים הקשורים לליגנד בגלל הבדלים מהותיים בין המפות. כאן נעשה שימוש ב-Servalcat, המשתמש בחצאי מפות לא מחודדות ולא משוקללות כקלט לצורך עידון במרחב הדדי ולאחר מכן מחשב מפת הפרש בין מפת הניסוי לבין המפה הנגזרת מהמודל. בסף גבוה, ניתן לדמיין הבדלים ולשמש כמדריך לתיקון ושיפור המודל. כמה כתמים לא מדגמים בתחום החוץ-תאי וליד התחום הטרנסממברנלי של mGlu5 נצפו ושימשו כמדריך לליגנדות מודל (איור 2).
הדוגמה השלישית מראה כיצד רזולוציה (2.3 Å) ממלאת תפקיד מכריע בפענוח מפה ובמידול של מעכב בגודל שבר בגלקטוזידאז β. כאן, האתגר היה לזהות ליגנד קטן מאוד (<200 Da) במפת ההבדלים של Servalcat בתוך הרעש המובנה בנתונים ולמדל אותו במדויק. בנוסף לרזולוציה הגלובלית הגבוהה שנקבעה באמצעות מתאם מעטפת פורייה (FSC), הרזולוציה המקומית הספציפית לליגנד הייתה גם גבוהה מספיק כדי להבטיח מיקום מדויק של המרכזים הכיראליים של הליגנדות (איור 3). צפיפות מולקולות הממס נצפתה במפת ההבדלים לאורך כל האנזים ובמיוחד סביב הליגנד. הודגמה גם השפעת הרזולוציה על מידול ליגנדות ואטומי ממס (איור 4). חשוב לנקוט משנה זהירות בעת מידול מולקולות מים או ממס מכיוון שלעיתים, רעש בסף נמוך עשוי להידמות למים או למולקולות ממס, מה שמוביל לפרשנויות שגויות פוטנציאליות.
שיקול חשוב נוסף הוא שמפות cryoEM לבדן עשויות שלא להספיק כדי לזהות במדויק יון מתכת בפני עצמו. שיטות ביופיזיקליות נוספות כמו Extended X-ray Absorption Fine Structure (EXAFS) או ספקטרוסקופיית קרני רנטגן מפזרת אנרגיה (EDX) נחוצות לעתים קרובות כדי לאשר את נוכחותו וזהותו של יון המתכת. הן באנזימי אנולאז והן באנזימי β-גלקטוזידאז, Mg2+ עוצב בשל שפע המידע הזמין כבר על חלבונים אלה, המאשר את זהותו של יון המתכת. כמו כן, התיאום של יוני המתכת במקרים אלה, שהודגם על ידי הגיאומטריה האוקטהדרלית הקלאסית ומרחקי הקואורדינציה הכמעט אידיאליים של Mg2+, סיפק הוכחה משמעותית לזהותם.
באופן כללי, יש לקחת בחשבון מספר שיקולים חשובים בעת מידול ליגנדות במפות cryoEM. ראשית, בחירת המפה הנכונה לזיהוי ליגנדים ומידול חשובה. בכל המקרים, מפה או חצי מפה לא מחודדת ולא משוקללת מומלצת מומלצת על פני מפה מחודדת ומשוקללת כדי להמחיש את צפיפות הליגנד, שכן חידוד ושקלול עלולים לגרום לאזורים לא מחודדים או מחודדים יתר על המידה (רעש עקב סיום סדרה) במפה. זה עלול לגרום לצפיפות ליגנד תת-אופטימלית, וניתן להשתמש בחידוד גורמי B שונים כדי להעריך את הצפיפות במהלך בניית מודל בקוט. למרות שקיים סיכון בשימוש במפה המושחזת לזיהוי ליגנדות במפת קריוEM, המפה הלא מחודדת עשויה שלא להציג את הפירוט המלא של צפיפות הליגנד, אך ניתן להשתמש בה למטרות הדגמה, כפי שמוצג באיור 1B,C.
יש לאמת את תנוחת הליגנד המודל, במיוחד במקרים בהם הנתונים חלשים. כפי שמוצג כאן עבור mGlu5, הרזולוציה המקומית משתנה על פני מפת cryoEM, ומידול בלתי משוחד של הליגנד יכול להיות מאתגר. Servalcat יכול לשמש ככלי רב ערך לאיתור אי דיוקים פוטנציאליים במידול חלבונים וליגנד22.
הטרוגניות קומפוזיציונית יכולה להיות נוכחת בקומפלקס חלבונים-ליגנדים שבו רק אוכלוסייה מסוימת עשויה להכיל את הליגנד (אם הליגנד הוא בעל משקל מולקולרי נמוך, אז שלב הסיווג עשוי שלא להסיר את ההטרוגניות). עם זאת, חשוב לבצע את שלבסיווג 63 התלת-ממדי באופן איטרטיבי במהלך עיבוד התמונה לפני מידול הליגנד ולוודא אם צפיפות הליגנד משתפרת. אם קיימים עותקים מרובים של חלבון, יש לנקוט משנה זהירות בעת החלת סימטריה על פני המפה במהלך יצירת המודל הראשוני והעידון, מכיוון שהדבר עשוי לחשב את צפיפות הליגנד בכל המולקולות הקשורות לסימטריה. סימטריה צריכה להיות מוטלת רק לאחר שהמפה נבדקה ביסודיות כדי לאשר את נוכחות צפיפות הליגנד בכל שרשראות החלבון.
בהתאם למצב (גביש או תמיסה) ולמיקום (קבור או פני שטח), האטומים יכולים להיות דינמיים, ובעידון המודל, זה נקרא פרמטר התזוזה האטומית (ADP). יחד עם מפת ההפרשים, המספקת רמזים חזותיים לאי דיוקים אפשריים במודל, ניתן להשתמש בערכי ADP כדי להעריך את דיוק הליגנדות לאחר עידון 64,65,66,67. בדרך כלל, לליגנד צריכים להיות ערכי ADP דומים לשאריות הסובבות אותו, כלומר, אם הם קשורים ביציבות ומעוצבים בצורה מדויקת. עם זאת, ליגנדות בפריפריה או אטומים של ליגנד (כמו ליפידים) הרחוקים ממקרומולקולות יכולים להיות בעלי ערכי ADP גבוהים יותר. בנוסף לליטוש הקואורדינטות, הן Refmac33,34 והן Phenix מאפשרים חידוד של ערכי ADP 28,68. ב- Refmac, קירוב Mott-Bethe משמש לחישוב גורם פיזור האלקטרונים של אטומים בודדים במהלך חישוב המפות. בגרסה האחרונה של פניקס, עידון גורם B אינדיבידואלי, בדומה לקריסטלוגרפיה, הוצג כדי להסביר הפרעת אטום. לעתים קרובות, במודלים המעודנים הנגזרים מ- cryoEM, נצפים מגוון רחב של ערכי ADP (לפעמים ערכים קרובים לאפס), ואפילו ציון Q המשמש ב- EMDB להערכת התאמת המודל למפה תלוי במפה הראשית שהופקדה ובאופי חידוד גורם B60. בבניית מודל cryoEM, מפות מרובות משמשות לעתים קרובות, ולכן, המפות המשמשות במידול ועידון צריכות להיות מוזכרות בבירור בשיטות, שכן בשל רזולוציה אנאיזוטרופית במקרומולקולות רבות, מפה אחת בודדת עשויה שלא להספיק כדי להסביר את כל הפרטים. 
במידול ליגנדות במקרומולקולות, אחת המגבלות העיקריות של מפות cryoEM (כמו בקריסטלוגרפיה) היא שאם אתר קשירת הליגנד הוא ברזולוציה נמוכה או אם הליגנד הכבול הוא דינמי, אז בירור הקונפורמציה הנכונה עשוי להיות קשה. בנוסף, לרוב מבני ה-cryoEM יש רזולוציות נמוכות מ-3 Å, והייצוג של מולקולות מים במפות מוגבל, מה שמקשה על הערכת תפקיד ההידרציה בקשירת ליגנד או תרופה (כפי שמוצג כאן עם הדוגמאות של אנולאז ו-mGluR). ניתן להשתמש בשיטות חישוביות בשילוב עם נתוני cryoEM כדי להתמודד עם מגבלות אלה69. בניגוד לקריסטלוגרפיה, רק המודל עובר עידון, לא המפה. כיום, השיטה היחידה לציין נוכחות של ליגנד או להבטיח מידול מדויק היא על ידי יצירת מפות השמטה (באמצעות כלים כמו Servalcat). לפיכך, ישנם מספר כלים המסייעים לחוקרים לבנות ולהעריך את המודל, אך ישנם מספר תחומים בחידוד המודל שבהם ניתן לצפות לגישות חדשות יותר או שינויים בגישות הנוכחיות בעתיד הקרוב.
במאמר זה, התמקדנו בגישות הנוכחיות למידול ליגנדות, הכוללות בדיקה ידנית של צפיפות הליגנד, יצירת קובץ הגיאומטריה של הליגנד, ולאחר מכן מידול הליגנד במפת cryoEM. זוהי תקופה מרגשת בביולוגיה מבנית ובגילוי תרופות, שכן גלאי אלקטרונים ישירים עם קצב פריימים מהיר יותר ושימוש באיסוף נתונים מהיר יותר70 הביאו להשגת מפות ברזולוציה גבוהה (<2.8 Å) של מספר מקרומולקולות הקשורות לעתים קרובות לליגנדות של מולקולות קטנות בזמן קצר יחסית. ההשקה האחרונה של כלי מידול ליגנדים אוטומטיים כגון GEMspot69 בסוויטת שרדינגר ואמרלד17 בסוויטת רוזטה, המנסה למצוא את תנוחת הכריכה הסבירה ביותר של הליגנד תוך שקלול נתוני ה- cryoEM הניסיוניים, מבטיחה לייעל ולהפוך תהליך זה לאוטומטי. בדומה לקריסטלוגרפיה של קרני רנטגן, החזון הוא שזיהוי מצבי הקישור של ליגנדות של מולקולות קטנות על ידי cryoEM, אולי שניים או יותר ביום אחד, יהפוך לאפשרות מציאותית.

תאים משיגים את תפקידיהם על ידי ביצוע אינספור תגובות כימיות בו זמנית ובאופן עצמאי, כל אחת מווסתת בקפידה כדי להבטיח את הישרדותם ואת יכולת ההסתגלות שלהם בתגובה לרמזים סביבתיים. זה מושג על ידי זיהוי מולקולרי, המאפשר ביומולקולות, במיוחד חלבונים, ליצור קומפלקסים חולפים או יציבים עם מקרומולקולות אחרות, כמו גם מולקולות קטנות או ליגנדות1. לפיכך, אינטראקציות חלבון-ליגנד הן בסיסיות לכל התהליכים בביולוגיה, הכוללים את ויסות ביטוי ופעילות החלבון, זיהוי מצעים וקו-פקטורים על ידי אנזימים, כמו גם כיצד תאים תופסים ומעבירים אותות 1,2. הבנה טובה יותר של התכונות הקינטיות, התרמודינמיות והמבניות של קומפלקס החלבון-ליגנד חושפת את הבסיס המולקולרי של אינטראקציית ליגנד וגם מאפשרת תכנון רציונלי של תרופות על ידי אופטימיזציה של אינטראקציה וספציפיות של תרופות. גישה חסכונית ומהירה יותר לחקר אינטראקציה בין חלבונים לליגנדים היא שימוש בעגינה מולקולרית, שהיא שיטה חישובית שלמעשה סורקת מגוון רחב של מולקולות קטנות וחוזה את מצב הקישור והזיקה של ליגנדות אלה לחלבוני מטרה3. עם זאת, ראיות ניסיוניות ממבנים ברזולוציה גבוהה שנקבעו על ידי עקיפה של קרני רנטגן (XRD), תהודה מגנטית גרעינית (NMR) או קריומיקרוסקופ אלקטרונים (cryoEM) מספקות את ההוכחה החיונית לתחזיות כאלה ומסייעות בפיתוח מפעילים או מעכבים חדשים ויעילים יותר למטרה נתונה. מאמר זה משתמש בקיצור 'cryoEM' כפי שנהוג להתייחס לטכניקה. עם זאת, קיים ויכוח מתמשך על בחירת המינוח הנכון, ולאחרונה הוצע המונח cryogenic-sample Electron Microscopy (cryoEM) כדי לציין שהדגימה נמצאת בטמפרטורה קריוגנית ומצולמת עם אלקטרונים4. באופן דומה, המפות הנגזרות מ- cryoEM נקראו פוטנציאל אלקטרונים, פוטנציאל אלקטרוסטטי או פוטנציאל קולומב, ולשם הפשטות, כאן אנו משתמשים במפות cryoEM 5,6,7,8,9,10.
למרות ש-XRD הייתה טכניקת תקן הזהב בקביעת מבנה ברזולוציה גבוהה של קומפלקסים של ליגנד חלבונים, לאחר מהפכת הרזולוציה11 cryoEM צברה תאוצה, כפי שעולה מהנחשול של מפות פוטנציאליות קולומב או מפות cryoEM שהופקדו במסד הנתונים של מיקרוסקופ אלקטרונים (EMDB)12,13 במהלך השנים האחרונות14. הודות להתקדמות בהכנת דגימות, הדמיה ושיטות עיבוד נתונים, מספר תצהירי בנק נתוני החלבונים (PDB)14 המשתמשים ב- cryoEM גדל מ- 0.7% ל- 17% בין 2010 ל- 2020, כאשר כ- 50% מהמבנים שדווחו בשנת 2020 נקבעו ברזולוציה של 3.5 Å או טוב יותר15,16. CryoEM אומץ במהירות על ידי קהילת הביולוגיה המבנית, כולל תעשיית התרופות, מכיוון שהוא מאפשר לחקור מקרומולקולות ביולוגיות גמישות ולא גבישיות, במיוחד חלבוני ממברנה וקומפלקסים מרובי חלבונים, ברזולוציה כמעט אטומית, להתגבר על תהליך ההתגבשות ולקבל גבישים דיפרקציה היטב הדרושים לקביעת מבנה ברזולוציה גבוהה על ידי XRD.
מידול מדויק של הליגנד במפת cryoEM הוא בעל חשיבות עליונה, מכיוון שהוא משמש כשרטוט של קומפלקס ליגנד החלבונים ברמה המולקולרית. ישנם מספר כלים אוטומטיים לבניית ליגנדים המשמשים בקריסטלוגרפיה של קרני רנטגן התלויים בצורה ובטופולוגיה של צפיפות הליגנד על מנת להתאים או לבנות את הליגנד לצפיפות אלקטרונים 17,18,19,20. עם זאת, אם הרזולוציה נמוכה מ- 3 Å, גישות אלה נוטות לייצר תוצאות פחות רצויות מכיוון שהתכונות הטופולוגיות שבהן הן תלויות לצורך הכרה ובנייה הופכות פחות מוגדרות. במקרים רבים, שיטות אלה הוכחו כלא יעילות במידול מדויק של ליגנדות למפות cryoEM, מכיוון שמפות אלה נקבעו בטווח הרזולוציה הנמוכה עד בינונית, בדרך כלל בין 3.5 Å-5 Å17.
השלב הראשון בקביעת מבנה תלת-ממדי של קומפלקס ליגנד חלבוני על ידי cryoEM כולל טיהור משותף של הליגנד עם החלבון (כאשר לליגנד יש זיקה גבוהה לחלבון) או דגירה של תמיסת החלבון עם הליגנד למשך זמן מסוים לפני הכנת הרשת. לאחר מכן, נפח דגימה קטן מונח על רשת TEM חורית מנוקה פלזמה, ואחריו הקפאת הבזק באתאן נוזלי ובסופו של דבר הדמיה עם cryo-TEM. תמונות ההקרנה הדו-ממדיות ממאות אלפי עד מיליוני חלקיקים בודדים ממוצעות כדי לשחזר מפה תלת-ממדית (תלת-ממדית) של פוטנציאל קולומב של המקרומולקולה. זיהוי ומידול ליגנדות ומולקולות ממס במפות אלה מציבים אתגרים משמעותיים במקרים רבים בשל הרזולוציה האנאיזוטרופית על פני המפה (כלומר, הרזולוציה אינה אחידה על פני המקרומולקולה), גמישות באזור שבו הליגנד קשור והרעש בנתונים. רבים מכלי המידול, העידון וההדמיה שפותחו עבור XRD מותאמים כעת לשימוש ב- cryoEM לאותן מטרות 18,19,20,21. במאמר זה מוצגת סקירה כללית של שיטות ותוכנות שונות המשמשות כיום לזיהוי ליגנדות, בניית מודלים וחידוד הקואורדינטות הנגזרות מ- cryoEM. פרוטוקול שלב אחר שלב סופק כדי להמחיש את התהליכים המעורבים במידול ליגנדות באמצעות קומפלקסים ספציפיים של ליגנדים חלבוניים ברזולוציה ומורכבות משתנות.
השלב הראשון במידול ליגנדות במפות cryoEM כולל זיהוי צפיפות הליגנד (שאינו חלבון) במפה. אם קשירת ליגנד אינה גורמת לשינוי קונפורמטיבי כלשהו בחלבון, אזי חישוב מפת הפרשים פשוטה בין קומפלקס החלבון-ליגנד לבין חלבון האפו-חלבון מדגיש למעשה את האזורים בעלי צפיפות יתרה, מה שמרמז על נוכחות הליגנד. הבדלים כאלה ניתן לראות מיד, כפי שהוא דורש רק שתי מפות, ואפילו מפות ביניים במהלך תהליך של עידון 3D ניתן להשתמש כדי לבדוק אם הליגנד קיים. בנוסף, אם הרזולוציה גבוהה מספיק (<3.0 Å), מפת ההפרשים יכולה גם לספק תובנות לגבי המיקום של מולקולות מים, כמו גם יונים המקיימים אינטראקציה עם הליגנד ושאריות החלבון.
בהיעדר מפת חלבון אפו, ניתן כעת להשתמש ב- Servalcat22, הזמין ככלי עצמאי ושולב גם בחבילת התוכנה CCP-EM23,24 כחלק מעידון Refmac ובשחרור CCP4 8.025,26. Servalcat מאפשר חישוב של מפת הפרש משוקלל FSC (Fo-Fc) באמצעות חצאי מפות לא מחודדות ומודל אפופרוטאין כקלט. מפת השמיטה Fo-Fc מייצגת את הפער בין המפה הניסויית (Fo) לבין המפה הנגזרת מהמודל (Fc). בהיעדר ליגנד במודל, צפיפות חיובית במפת Fo-Fc החופפת למפת EM ניסיונית בדרך כלל מרמזת על נוכחות הליגנד. ההנחה כאן היא ששרשרת החלבונים מותאמת היטב במפה, והצפיפות החיובית הנותרת מצביעה על מיקום הליגנד. עם זאת, חשוב לבחון היטב האם הצפיפות החיובית נובעת מאי דיוקים במידול, כגון רוטמר שגוי של שרשרת צדדית של חלבון.
השלב השני כרוך בהשגה או יצירה של קובץ קואורדינטות קרטזי של הליגנד עם גאומטריה מוגדרת היטב מהמידע הכימי הזמין. ליגנדות סטנדרטיות (לדוגמה, ATP ו-NADP+) שכבר זמינות בספריית המונומרים CCP4 יכולות לשמש לעידון על-ידי אחזור קובצי הקואורדינטות והגיאומטריה באמצעות קוד ההצטרפות המונומרי שלהם. עם זאת, עבור ליגנדות לא ידועות או לא סטנדרטיות, כלים שונים זמינים ליצירת קובצי הגיאומטריה. חלק מהדוגמאות כוללות את eLBOW27 - (בונה ליגנדים אלקטרוניים ושולחן עבודה אופטימיזציה) בפניקס28, לידיה - כלי מובנה ב- Coot29, JLigand/ACEDRG30,31, CCP-EM23,24, Ligprep32-מודול של Glide בתוך חבילת שרדינגר. לאחר מכן קובץ קואורדינטות הליגנד מותאם בצפיפות, מונחה הן על ידי מפת ה- cryoEM הניסיונית והן על ידי מפת ההפרשים ב- Coot. זה ואחריו עידון החלל האמיתי בפניקס28 או עידון הדדי ב Refmac33. תחנת עבודה לינוקס או מחשב נייד מצויד כרטיס גרפי טוב ואת התוכנה הנ"ל נדרש. רוב התוכניות הללו כלולות בסוויטות שונות. CCP-EM24 ו- Phenix28 זמינים באופן חופשי למשתמשים אקדמיים וכוללים מגוון כלים המשמשים במאמר זה, כולל Coot, Refmac5 33,34,35,36, Servalcat, phenix.real_space_refine וכו '. באופן דומה, Chimera37, ו- ChimeraX38 מספקים רישיונות בחינם למשתמשים אקדמיים.

<table><tbody><tr>קונסורציום <td>CCP4-8.0</td><td>של מספר מכונים</td><td></td><td>https://www.ccp4.ac.uk חינם למשתמשים אקדמיים וכולל Coot ורשימת כלים שפותחו עבור קריסטלוגרפיה בקרני רנטגן</td></tr><tr>קונסורציום<td>CCP-EM</td><td>של מספר מכונים</td><td></td><td>https://www.ccpem.ac.uk/download.php חינם למשתמשים אקדמיים וכולל Coot, Relion ורבים אחרים</td></tr><tr><td>Coot&nbsp;</td><td>פול אמסלי, LMB, קיימברידג'</td><td>https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/</td> <td>תוכנה כללית לבניית מודלים אך זמינה גם עם חבילות אחרות שתוארו לעיל</td></tr><tr><td>DockinMap (Phoenix)</td><td>קונסורציום של מספר מכונים</td><td>https://phenix-online.org/documentation/reference/dock_in_map.html</td><td>תוכנה בתוך חבילת Phenix לעגינת מודל למפות cryoEM</td></tr><tr><td>בנק נתונים של מיקרוסקופיה אלקטרונית&nbsp;</td><td>קונסורציום של מספר מכונים</td><td>https://www.ebi.ac.uk/emdb/</td> <td>מאגר ציבורי למפות מיקרוסקופ אלקטרונים</td></tr><tr><td>Falcon</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/MSD/Technical-Notes/Falcon-3EC-Datasheet.pdf</td><td>פרסומת, מצלמה מבית Thermo Fisher&nbsp;</td></tr><tr><td>פניקס&nbsp;</td><td>קונסורציום של מספר מכונים</td><td></td><td>https://phenix-online.org/download בחינם למשתמשים אקדמיים וכולל</td></tr><tr>את<td>Coot Protein Data Bank</td><td>קונסורציום של מספר מכונים</td><td>https://rcsb.org</td><td>מאגר נתונים ציבורי של מבנים מקרומולקולריים</td></tr><tr><td>Pymol</td><td>Schrodinger</td><td>https://pymol.org/2/</td> <td>כלי ויוזליזציה מולקולרי. הגרסה החינוכית היא חינמית אך מגיעה עם מגבלה. ניתן להשיג את הגרסה המלאה בתשלום סמלי.</td></tr><tr><td>Relion</td><td>MRC-LMB, קיימברידג'</td><td>https://relion.readthedocs.io/en/release-4.0/Installation.html</td><td>תוכנה לעיבוד תמונה cryoEM, זמינה גם עם CCP-EM</td></tr><tr><td>Titan Krios</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>https://www.thermofisher.com/in/en/home/electron-microscopy/products/transmission-electron-microscopes/krios-g4-cryo-tem.html?cid=msd_ls_xbu_xmkt_tem-krios_285811_gl_pso_gaw_tpne1c&amp; gad_source=1& gclid=CjwKCAiA-P-rBhBEEiwAQEXhHyw5c8MKThmdA AkZesWC4FYQSwIQRk ZApkj08MfYG040DtiiuL8 RihoCebEQAvD_BwE</td><td>מסחרי, cryoTEM מבית Thermo Fisher</td></tr><tr><td>UCSF Chimera</td><td>UCSF, ארה"ב</td><td>https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html</td><td>תוכנה לשימוש כללי לתצוגה, ניתוח ועוד</td></tr><tr><td>UCSF Chimera X</td><td>UCSF, ארה"ב</td><td></td> <td>https://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/תוכנה לשימוש כללי לתצוגה, ניתוח ועוד</td></tr></tbody></table>

מידול ליגנדות למפות הנגזרות מקריומיקרוסקופ אלקטרונים

Modeling Ligands into Maps Derived from Electron Cryomicroscopy

פענוח יחסי הגומלין בין חלבונים לליגנד בקומפלקס מקרומולקולרי חיוני להבנת המנגנון המולקולרי, התהליכים הביולוגיים העומדים בבסיסו ופיתוח תרופות. בשנים האחרונות, מיקרוסקופ אלקטרונים בדגימה קריוגנית (cryoEM) התגלה כטכניקה רבת עוצמה לקביעת מבנים של מקרומולקולות ולחקור את אופן קשירת הליגנד ברזולוציה כמעט אטומית. זיהוי ומידול מולקולות שאינן חלבונים במפות cryoEM הוא לעתים קרובות מאתגר בשל הרזולוציה האנאיזוטרופית על פני המולקולה המעניינת והרעש המובנה בנתונים. במאמר זה, הקוראים נחשפים לתוכנות ושיטות שונות המשמשות כיום לזיהוי ליגנדים, בניית מודלים ושכלול קואורדינטות אטומיות באמצעות מקרומולקולות נבחרות. אחת הדרכים הפשוטות ביותר לזהות נוכחות של ליגנד, כפי שמודגם עם אנזים האנולז, היא להחסיר את שתי המפות המתקבלות עם ובלי הליגנד. הצפיפות הנוספת של הליגנד עשויה לבלוט במפת ההפרשים גם בסף גבוה יותר. ישנם מקרים, כפי שמוצג במקרה של קולטן גלוטמט מטבולי mGlu5, כאשר מפות הבדל פשוטות כאלה לא ניתן ליצור. השיטה שהוצגה לאחרונה לגזירת מפת ההשמטה Fo-Fc יכולה לשמש ככלי לאימות והדגמת נוכחות הליגנד. לבסוף, תוך שימוש בגלקטוזידאז β שנחקר היטב כדוגמה, מנותחת השפעת הרזולוציה על מידול הליגנדות ומולקולות הממס במפות cryoEM, ומוצגת השקפה על האופן שבו ניתן להשתמש ב- cryoEM בגילוי תרופות.

פרוטוקול זה מציג את הכלים הזמינים למידול ליגנדות של מולקולות קטנות במפות cryoEM של מקרומולקולות.

Deciphering the protein-ligand interactions in a macromolecular complex is crucial for understanding the molecular mechanism, underlying biological ...

אנו מעוניינים להבין את התהליכים הפיזיולוגיים המתרחשים ברחבי התא, במיוחד בממשק הממברנה. אנו משתמשים ב- Cryo-EM כטכניקה עיקרית ועובדים על בעיות ביולוגיות מעניינות ומאתגרות שונות בחקר קומפלקסים מקרומולקולריים מרובים. קביעת המבנים של חלבוני ממברנה וקומפלקסים אחרים הייתה מאתגרת לפני כמה עשורים.עם זאת, התקדמות טכנית ב- Cryo-EM, חומר ניקוי חדשני ומימטי שומנים ועם תרומות סללו את הדרך לקביעת מבנה מהירה של קומפלקסים אלה. כיום ניתן להשיג מבנים אלה ברזולוציה גבוהה ולהשתמש בהם באופן פוטנציאלי בגילוי תרופות. בחלקיק יחיד Cryo-EM, האתגרים כוללים רכישת דגימה יציבה והומוגנית, הטמעת הדגימה בכיוון אקראי בקרח דק, עיבוד מספר רב של תמונות עם יחס אות לרעש נמוך, וקביעה מדויקת של הכיוון הזוויתי והסיווג במהלך שחזור תלת ממדי.זיהוי ומידול מולקולות קטנות במפות cryo-EM של קומפלקסים של חלבוני ליגנד הוא מאתגר בשל רעש מובנה בנתונים ורזולוציית מפה איזוטרופית ונמוכה, הטרוגניות הדגימה וגמישות ליגנד. פרוטוקול זה הוא מדריך שלב אחר שלב לזיהוי ומידול ליגנדות ומולקולות ממס ברזולוציה נמוכה עד בינונית Cryo-EM.

modeling-ligands-into-maps-derived-from-electron-cryomicroscopy

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

ניתוח חלקיקים בודדים במיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית היא אחת הטכניקות העיקריות המשמשות לקביעת מבנה ההרכבים הביולוגיים ברזולוציה גבוהה. Scipion מספקת את הכלים ליצירת הצינור כולו לעיבוד המידע שנרכש על ידי המיקרוסקופ ולהשיג שחזור תלת מימדי של הדגימה הביולוגית.

ניתוח קריו-EM וחלקיקים בודדים עם Scipion

קביעת מבנה של מתחמים מקרומולקולריים באמצעות cryoEM הפכה לשגרה עבור סוגים מסוימים של חלבונים ומתחמים. כאן, צינור זה מסוכם (הכנה לדוגמה, סינון, רכישת נתונים ועיבוד) והקוראים מופנים למשאבים ומשתנים מפורטים נוספים שעשויים להשתנות במקרה של דגימות מאתגרות יותר.

מיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית חלקיקית בודדת: מדגם למבנה

מיומנות מרכזית בדוגמנות ביומולקולרית היא הצגת וביאור אתרים פעילים בחלבונים. טכניקה זו מודגמת באמצעות ארבע תוכניות פופולריות בחינם להדמיה מקרומולקולרית: iCn3D, Jmol, PyMOL, ו UCSF כימרהX.

מידול אתר פעיל אנזים באמצעות תוכנה חופשית להדמיה מולקולרית

מאמר זה מציג פרוטוקול לעיבוד cryo-EM תמונות באמצעות חבילת תוכנה SPHIRE. הפרוטוקול הנוכחי יכול להיות מיושם עבור כמעט כל חלקיקים יחיד פרויקטים EM כי היעד ברזולוציה אטומית כמעט.

ברזולוציה גבוהה ניתוח החלקיקים יחיד מאת אלקטרונים Cryo-microscopy תמונות באמצעות SPHIRE

אנו מציגים פרוטוקול פלואורסנציה למערכות ביולוגיות קיפול ואיגוד אינטראקציות עם thermolabile ליגנדים שימוש דיפרנציאלי calorimetry סריקה מהירה.

מדידת למערכות ביולוגיות DSC פרופילים עם Thermolabile ליגנדים לאפיין במהירות קיפול ואיגוד אינטראקציות

ספריות התצוגה חיידקי Biopanning היא טכניקה מוכחת על גילוי של פפטיד זיקה ריאגנטים, אלטרנטיבה איתנה נוגדנים. בשיטת המיון האוטומטי למחצה בזאת יש יעיל biopanning כדי להקטין את המופע של תוצאות חיוביות שגויות. כאן אנו ממחישים את התהליך המחשבתי וטכניקות מתבצעת הערכת המועמדים וצמצום ניתוח במורד הזרם.

Biopanning חצי אוטומטי של התצוגה חיידקי ספריות פפטיד זיקה ריאגנט גילוי וניתוח של מבודד וכתוצאה מכך

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי לנטר את הרכבה ופירוק של הרעלן גחלת באמצעות biolayer אינטרפרומטריה (בלי). בעקבות הרכבה/פירוק על פני ביוסנסור, משתחררים את מתחמי חלבון גדולה מפני השטח עבור פריט חזותי וזיהוי של רכיבי מתחמי באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני ו ספקטרומטר מסה, בהתאמה.

ניתוח דינאמי חלבון מתחמי נאסף בנושא ושוחרר מן Biolayer אינטרפרומטריה ביוסנסור באמצעות ספקטרומטר מסה ואלקטרון

להלן מוצגות שתי שיטות שבהן ניתן להשתמש בנפרד או במשולב כדי לנתח את השפעת בטא עמילואיד על מבנה קריש פיברין. כלול הוא פרוטוקול עבור יצירה של במבחנה clot פיברין, ואחריו קריש עכירות ואלקטרון סריקה שיטות.

ניתוח של β-עמילואיד-induced הפרעות על מבנה קריש פיברין על ידי ספקטרוסקופיה וסריקת מיקרוסקופ אלקטרונים

פרוטוקול זה מתאר את הסרת השומנים האנדוגניים מאלרגנים, ואת החלפתם בליגדות שצוינו על-ידי המשתמש באמצעות HPLC הפוך בשילוב עם חישול תרמי. 31 P-NMR ו dichroism מעגלי לאפשר אישור מהיר של הסרת ליגנד / טעינה, ואת ההתאוששות של מבנה אלרגנים מקורי.

הסרה והחלפה של ליגנדים אנדוגניים מחלבונים ואלרגנים הקשורים לשומנים

במאמר זה אנו מתארים את ההליכים שפותחו במעבדה שלנו להכנת אבקות של גבישי מולקולות קטנות לניסויי עקיפה של אלקטרונים במיקרו-גבישים (MicroED).

עקיפה של אלקטרונים מיקרו-גבישיים של מולקולות קטנות

למד מידול ליגנדים קטנים במפות קריומיקרוסקופ אלקטרונים של מקרומולקולות. הפרוטוקול מסביר זיהוי ומידול של ליגנדים ומולקולות ממיס ב-Coot ו-ChimeraX לפיתוח תרופות.

מידול ליגנדות למפות הנגזרות מקריומיקרוסקופ אלקטרונים

גלה סרטונים נוספים