חיזוי חישובי של העדפות חומצות אמינו של תחומים קושרי פפטיד רב-ספציפיים המעורבים באינטראקציות חלבון-חלבון

אנו מציעים פרוטוקול לחיזוי חישובי של העדפות חומצות אמינו באינטראקציות חלבון-חלבון ספציפיות יותר. פרוטוקול זה יכול להיחשב כצעד ראשון בתכנון המתווכים של אינטראקציות אלה. אנו מעוניינים להשתמש במתווכים אלה כמעכבים פוטנציאליים של אינטראקציות ספציפיות, בטכנולוג אימונולוגיה.

המיישם שלנו המשמש לאפיון העדפות חומצות אמינו בין אתרי הקישור הספציפיים הוא יקר ומסורבל. הפרוטוקול שלנו הוא טכנולוגיה מגובה ביו המבוססת על יעילות ופעולות סדרתיות. לאסטרטגיה זו יש פוטנציאל לעבד מספר גבוה של רצפי קווים, ולספק הבדל מלא ועקבי בהעדפות חומצות אמינו.

הפרוטוקול שלנו מציע חסכוני מקצועי על ידי עיבוד מספר רב של רצפי DNA המועדפים על פני תהליכים שלמים יותר ממספר הרצפים המוגבל בדרך כלל, תהליכים בגישות מעבדת אינטרנט. בנוסף לפיתוח מעכבים של מוצרים אימונולוגיים, ברצוננו להשוות את הביצועים של מתודולוגיה זו עם משפחות מוצרים אחרות. זה יאפשר לנו להבין טוב יותר את הבסיס המבני לרב-ספציפיות, לא רק בהקשר אימונולוגי, אלא גם בתפקודים תאיים אחרים, כגון איתות ותקשורת.

התחל בהורדת המבנה של קומפלקס החלבון-חלבון. לשם כך, נווט לדף הבית של מאגר נתוני החלבון והזן את מזהה ה-PDB בתיבת החיפוש הראשית. בעמוד הראשי של המבנה, לחץ על הורד קבצים, ולאחר מכן על הרכבה ביולוגית 1 כדי להוריד את הקבצים בפורמט PDB gz.

פתח את המבנה שהורדת ב-UCSF Chimera. נווט אל כלים, לאחר מכן עריכת מבנה, ולחץ על שינוי מזהי שרשרת. שנה את שם השרשרת השנייה שסומנה בתחילה כ-A, ל-B.לאחר מכן, לחץ על מועדפים, ולאחר מכן על לוח הדגם.

בחר את הדגם עם שתי השרשראות ולחץ על כפתור הקבוצה/פירוק הקבוצה כדי להפריד כל שרשרת לדגם אחר. לאחר מכן, בחר את שני הדגמים ולחץ על כפתור העתק/שילוב. הזן שם חדש עבור הדגם המשולב.

סמן את סגור דגמי מקור ולחץ על אישור. לחץ על בחירה, לאחר מכן על שרשרת ואשר שהשרשראות בדימר מזוהות כעת כ-A ו-B.לחץ על קובץ ושמור את PDB כדי לשמור את המבנה הערוך כקובץ PDB חדש. לזיהוי מקטע היעד בחלבון הליגנד, נווט לשרת BUDE Alanine Scan. לחץ על כפתור בחר קובץ תחת העלאת מבנה והעלה את קובץ ה-PDB השמור.

בעמוד הבא, בדוק שהמבנה נטען כהלכה, והזן שם למשימה בשרת. הגדר את שרשראות A כקולטן, ו-B כליגנד, ולחץ על כפתור התחל סריקה כדי לשלוח את העבודה. לאחר סיום המשימה, לחץ על הצג תוצאות כדי לפתוח את דף התוצאות.

מרשימת השאריות, בחר את מתיחת השאריות החזויה לאינטראקציה טובה יותר עם משטח כריכת היעד. באמצעות פרוטוקול זה ומקטע חומצות אמינו, אינטראקציה עם משטח הקישור IRF5, נחזה. באמצעות מוטגנזה חישובית של סריקת אלנין, נחזה מקטע של 13 חומצות אמינו ממיקומים 424 עד 436, כאשר מוטיב p L x IS מתחיל בארגינין 432.

כדי להתחיל, הכינו את ממשק פפטיד החלבון לגיוון הרצף. פתח את קובץ ה-PDB ב-Chimera וודא שמבנה יחידות המשנה של היעד שלם ללא אטומים או קשרים חסרים. להסרת כל המולקולות הלא חיוניות מהמבנה לחץ על בחר ולאחר מכן שאריות, ולאחר מכן בחר את כל המולקולות מלבד חומצות אמינו סטנדרטיות.

לאחר מכן לחץ על פעולות ואחריו אדמס/בונדס, ומחק לאחר מכן, לחץ על מועדפים, ברצף, ולאחר מכן לחץ על השרשרת הנחשבת לליגנד. חתוך את שרשרת הליגנד למקטע האינטראקציה המזוהה על ידי מחיקת כל השאריות למעט אלה שבין המיקומים שנבחרו.

לחץ על קובץ ושמור PDB כדי לשמור את המבנה הערוך בקובץ PDB אחר. העתק קובץ זה למיקום Linux הנגיש על-ידי יישומי Rosetta. השתמש ביישום fixedbb של רוזטה כדי לבצע אריזה מחדש של כל שרשראות הצד של חומצות האמינו של מבנה הבסיס לפני גיוון הרצף, על ידי הפעלת פקודה זו.

לאחר מכן שנה את שם קובץ ה-PDB של האריזה מחדש עם סיומת _ repack באמצעות הפקודה הבאה. לאחר מכן, הפעל את pepspec במצב עיצוב כדי לבצע גיוון רצף באמצעות פקודה זו. לאחר מכן, צור pwm באמצעות gen pepspec pwm.

כתב py כלול בחבילת רוזטה. כדי להפעיל קובץ Script זה, השתמש בפקודה הבאה. כדי ליצור לוגו רצף, פתח את הקובץ עם רצפי הפפטידים שנוצרו בשלב הקודם עם עורך טקסט מועדף והעתק את כל הרצפים.

נווט אל שרת WebLogo והדבק את הרצפים בתיבת הטקסט יישור רצפים מרובים. בחר את הפורמט והגודל הרצויים של הלוגו בהתאם לאורך הקלט, ולחץ על צור לוגו. באמצעות פרוטוקול זה, העדפות חומצות האמינו נחזו עבור מוטיב p L x IS השמור במשטח הקישור IRF5.

מיקום, מטריצת משקל ולוגו רצף שנוצרו עם גיוון הרצף הראו העדפה לגלוטמט בעמדה 432, וללאוצין ואיזולאוצין במיקומים 433 ו-435. עמדות 427, 429 ו-436, שבדרך כלל מאוישות על ידי סרין, הראו העדפה גבוהה יותר לאספרטט וגלוטמט, מה שמדגיש את תפקיד הזרחן ודימריזציה של IRF5. עמדה 425 הראתה העדפה גבוהה לסרין, מה שמרמז על מעורבותו באינטראקציה בין חלבון לחלבון בצורתו הלא זרחנית.