Name: שיטה פלואורסצנטית ניתנת לכימות וזולה ללא תאים כדי לאשר את היכולת של תרכובות חדשות לכלאט ברזל (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-23T13:55:00.000+00:00
Duration: 5 min 36 s
Description: למדו שיטת סקר פלואורסצנטית זולה ומהירה לאימות יכולת כלאט ברזל של תרכובות חדשות. השיטה משתמשת בבדיקת Calcein לזיהוי כלאטורים פוטנציאליים לטיפול בסרטן.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>בדיקה פלואורסצנטית לזיהוי כלטורי ברזל חדשניים

<ol><li>Hsu, P. P., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cell+metabolism%3A+Warburg+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cancer cell metabolism: Warburg and beyond.</a> Cell. 134 (5), 703-707 (2008).</li>
<li>Hsu, M. Y., Mina, E., Roetto, A., Porporato, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron%3A+An+essential+element+of+cancer+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Iron: An essential element of cancer metabolism.</a> Cells. 9 (12), 2591(2020).</li>
<li>Torti, S. V., Torti, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+and+cancer%3A+More+ore+to+be+mined%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Iron and cancer: More ore to be mined.</a> Nat Rev Cancer. 13 (5), 342-355 (2013).</li>
<li>Zhang, C., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+homeostasis+and+tumorigenesis%3A+Molecular+mechanisms+and+therapeutic+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">Iron homeostasis and tumorigenesis: Molecular mechanisms and therapeutic opportunities.</a> Protein Cell. 6 (2), 88-100 (2015).</li>
<li>Torti, S. V., Manz, D. H., Paul, B. T., Blanchette-Farra, N., Torti, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Nutr%22%5BJournal%5D)">Iron and cancer.</a> Annu Rev Nutr. 38, 97-125 (2018).</li>
<li>Welch, D. R., Hurst, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+hallmarks+of+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Defining the hallmarks of metastasis.</a> Cancer Res. 79 (12), 3011-3027 (2019).</li>
<li>Lehmann, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+defects+of+hepatocellular+carcinoma+are+already+found+in+non-neoplastic+liver+cells+from+patients+with+hereditary+haemochromatosis%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Epigenetic defects of hepatocellular carcinoma are already found in non-neoplastic liver cells from patients with hereditary haemochromatosis.</a> Hum Mol Genet. 16 (11), 1335-1342 (2007).</li>
<li>Fonseca-Nunes, A., Jakszyn, P., Agudo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+and+cancer+risk--a+systematic+review+and+meta-analysis+of+the+epidemiological+evidence%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Epidemiol+Biomarkers+Prev%22%5BJournal%5D)">Iron and cancer risk--a systematic review and meta-analysis of the epidemiological evidence.</a> Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 23 (1), 12-31 (2014).</li>
<li>Abdelaal, G., Veuger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversing+oncogenic+transformation+with+iron+chelation%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Reversing oncogenic transformation with iron chelation.</a> Oncotarget. 12 (2), 106-124 (2021).</li>
<li>Brown, R. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+iron+metabolism+and+impact+in+cancer+biology%2C+metastasis%2C+and+immunology%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">Altered iron metabolism and impact in cancer biology, metastasis, and immunology.</a> Front Oncol. 10, 476(2020).</li>
<li>Menyhárt, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+selection+of+functional+assays+to+evaluate+the+hallmarks+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the selection of functional assays to evaluate the hallmarks of cancer.</a> Biochim Biophys Acta. 1866 (2), 300-319 (2016).</li>
<li>Basu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovering+novel+and+diverse+iron-chelators+in+silico%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chem+Inf+Model%22%5BJournal%5D)">Discovering novel and diverse iron-chelators in silico.</a> J Chem Inf Model. 56 (12), 2476-2485 (2016).</li>
<li>Prus, E., Fibach, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+measurement+of+the+labile+iron+pool+in+human+hematopoietic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry measurement of the labile iron pool in human hematopoietic cells.</a> Cytometry A. 73 (1), 22-27 (2008).</li>
<li>Cold Spring Harb. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Phosphate-buffered+saline+%28pbs%29%22">Phosphate-buffered saline (pbs)</a>. 2006 (1), Cold Spring Harb Prot. (2006).</li>
<li>Kontoghiorghes, G. J., Pattichis, K., Neocleous, K., Kolnagou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+design+and+development+of+deferiprone+%28l1%29+and+other+iron+chelators+for+clinical+use%3A+Targeting+methods+and+application+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">The design and development of deferiprone (l1) and other iron chelators for clinical use: Targeting methods and application prospects.</a> Curr Med Chem. 11 (16), 2161-2183 (2004).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>אמוניום ברזל (II) סולפט הקסהידרט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>215406</td><td>חכם אחר הידוע בשם FAS</td></tr><tr><td>Calcein</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0875</td><td></td></tr><tr><td>Deferiprone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>379409</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco &prime; s פוספט חוצץ מלח</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5652</td><td>מגנזיום וסידן</td></tr><tr><td>ללא גריינר CELLSTAR 96 צלחות באר</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0812</td><td>כל צלחת שקופה אופטית 96 באר תעבוד</td></tr></tbody></table>

שיטה פלואורסצנטית ניתנת לכימות וזולה ללא תאים כדי לאשר את היכולת של תרכובות חדשות לכלאט ברזל 

Quantifiable and Inexpensive Cell-Free Fluorescent Method to Confirm the Ability of Novel Compounds to Chelate Iron

עבור השיטה שמוצגת בשלב 2, הניסוי הראשון הזה (איור 1) קבע את הטווח הליניארי של קורא הלוחות הפלואורסצנטיים של מיקרוטיטר בעת זיהוי פליטות פלואורסצנטיות של קלצאין. התוצאות המייצגות שלנו מראות טווח ליניארי רחב של פלואורסצנטיות Calcein בין 0-100 μM. ANOVA עם ניתוח LSD לאחר הוק מראה כי יש הבדלים מובהקים סטטיסטית RFU הממוצע עבור כל ריכוזי Calcein בהשוואה לבקרה של 0 מיקרומטר של Calcein. בניסויים נוספים, נעשה שימוש בקלצין 1 מיקרומטר (שלבים 3 ו-4) מכיוון שהוא מייצר הבדלים מובהקים סטטיסטית מבקרת 0 מיקרומטר ונופל בטווח שהוא מיושם בדרך כלל על תאים בצורה של Calcein AM בציטומטריית זרימה13.
עבור השיטה המוצגת בשלב 3, אנו מראים שכאשר מוסיפים ברזל בצורת Fe2+ בטווח של 0-1000 מיקרומטר (כ-FAS) ל-1 מיקרומטר קלצאין, יוני Fe2+ גורמים לירידה ליניארית בפלואורסצנטיות של קלצאין (RFU). זה מאפשר תצפית של Fe2+ מבוסס מרווה של פלואורסצנטיות Calcein. קלצין ככלטור ברזל חלש קושר ברזל וזה מפחית את התפוקה הפלואורסצנטית. באיור 2, ריכוזים של 8.9 מיקרומטר FAS ומעלה הראו ירידה משמעותית, p&lt;0.001, בפלואורסצנטיות של Calcein בהשוואה ל-1 μM Calcein בלבד. השימוש ב-8.9 מיקרומטר של FAS התאים לירידה של 33% בפלואורסצנטיות Calcein (ממוצע RFU). עבור ניסויים נוספים (שלב 4) 10 מיקרומטר FAS שימש כפי שהוא נופל בטווח של מרווה פלואורסצנטית של Calcein.
עבור השיטה שמוצגת בשלב 4, ניתן לראות את התחרות של קלצאין עבור יוני Fe2+ על-ידי כלטור ברזל באיור 3. ברזל בצורה של Fe2+ מקטין את פלואורסצנטיות הקלצין מבקרת 1 מיקרומטר והדפריפרון של כלטור הברזל מגביר פלואורסצנטיות זו עד לשיא, משחרר את מרווה הברזל של קלצין ומגביר את הפלואורסצנטיות (ממוצע RFU). Deferiprone (המשמש כדוגמה) בריכוזים הנעים בין 0.97-512 מיקרומטר הביא לעלייה מובהקת סטטיסטית בפלואורסצנטיות כפי שנצפה בניתוח ANOVA ו- LSD לאחר הוק (p&lt;0.001). השינוי הגדול ביותר בקיפול היה שינוי של פי 3 ב-RFU הממוצע ב-62.5 מיקרומטר של כלטור בהשוואה לבקרה של 1 מיקרומטר calcein AM ו-10 μM FAS. מעל 512 מיקרומטר של דפיריפרון לא היה הבדל מובהק סטטיסטית בין הכלטור לבין הבקרה של 1 מיקרומטר של קלצין ו -10 מיקרומטר של FAS.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66421/66421fig01.jpg"> איור 1: ריכוזי קלצאין ופלואורסצנטיות (RFU) נקבעים באמצעות קורא לוחות מיקרוטיטר פלואורסצנטי. ריכוזי הקלצין של 0-100 מיקרומטר מודגרים במשך 30 דקות ופלואורסצנטיות (RFU) שנקבעו מוצגים כאן. הנתונים מראים ממוצע של 8 משכפלים לניסוי ושלושה ניסויים בלתי תלויים, פסי שגיאה מראים רווח בר-סמך של 95% בממוצע. מובהקות סטטיסטית מסומנת על ידי ** כאשר p&lt;0.001 כפי שנקבע באמצעות ANOVA וניתוח LSD פוסט הוק (מחושב באמצעות מנסרת לוח גרף). ממוצע Calcein RFU של כל ריכוז מושווה לבקרה של PBS ו 0 מיקרומטר Calcein. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66421/66421fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66421/66421fig02.jpg"> איור 2: ריכוז מוגבר של FAS גורם לירידה ליניארית בפלואורסצנטיות של קלצאין. ריכוז FAS עלה מ-0-1000 מיקרומטר מה שהביא לירידה ליניארית בפלואורסצנטיות של 1 מיקרומטר קלצאין לאחר דגירה של 30 דקות ב-PBS הנתונים המוצגים הם ממוצע של 5 משכפלים לניסוי ושלושה ניסויים בלתי תלויים, פסי שגיאה מראים רווח בר-סמך של 95% בממוצע. מובהקות סטטיסטית מסומנת על ידי ** כאשר p&lt;0.001 כפי שנקבע באמצעות ANOVA וניתוח LSD פוסט הוק (מחושב באמצעות מנסרת לוח גרף). ממוצע Calcein RFU של כל ריכוז של FAS ו 1 מיקרומטר של Calcein מושווה לבקרה של 1 μM Calcein 0 מיקרומטר של FAS ב PBS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66421/66421fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66421/66421fig03.jpg"> איור 3: עלייה בריכוזים של דפריפרון. ריכוז הדפריפרון הוגדל מ-0-1000 מיקרומטר עם דגירה של 1 מיקרומטר קלצאין, 10 מיקרומטר FAS ב-PBS. פלואורסצנטיות נמדדה בקורא מיקרו-לוחות רב-מודאלי. הנתונים המוצגים הם ממוצע של 5 עותקים משוכפלים לניסוי ושלושה ניסויים בלתי תלויים, פסי שגיאה מראים רווח בר-סמך של 95% בממוצע. מובהקות סטטיסטית מסומנת על ידי ** כאשר p&lt;0.001 כפי שנקבע באמצעות ANOVA וניתוח פוסט-הוק LSD (מחושב באמצעות מנסרת כרית גרף). ממוצע RFU שבו לעומת 1 מיקרומטר Calcein ב PBS עם 10 μM FAS ו 0 μM של Deferiprone. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66421/66421fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>ריכוז (מיקרומטר)</td>
			<td>נפח החל מ (1 mM מלאי)</td>
			<td>נפח PBS</td>
			<td>עוצמת קול כוללת</td>
		</tr><tr><td>800</td>
			<td>800 מיקרוליטר</td>
			<td>200 מיקרוליטר</td>
			<td>1 מ"ל</td>
		</tr><tr><td>400</td>
			<td>400 מיקרוליטר</td>
			<td>600 מיקרוליטר</td>
			<td>1 מ"ל</td>
		</tr><tr><td>200</td>
			<td>200 מיקרוליטר</td>
			<td>800 מיקרוליטר</td>
			<td>1 מ"ל</td>
		</tr><tr><td>100</td>
			<td>100 מיקרוליטר</td>
			<td>900 מיקרוליטר</td>
			<td>1 מ"ל</td>
		</tr><tr><td>50</td>
			<td>50 מיקרוליטר</td>
			<td>950 מיקרוליטר</td>
			<td>1 מ"ל</td>
		</tr><tr><td>25</td>
			<td>25 מיקרוליטר</td>
			<td>975 מיקרוליטר</td>
			<td>1 מ"ל</td>
		</tr><tr><td>10</td>
			<td>10 מיקרוליטר</td>
			<td>990 מיקרוליטר</td>
			<td>1 מ"ל</td>
		</tr><tr><td>6</td>
			<td>6 μL</td>
			<td>994 מיקרוליטר</td>
			<td>1 מ"ל</td>
		</tr><tr><td>2</td>
			<td>2 μL</td>
			<td>998 מיקרוליטר</td>
			<td>1 מ"ל</td>
		</tr><tr><td>1</td>
			<td>1 μL</td>
			<td>999 מיקרוליטר</td>
			<td>1 מ"ל</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 1: הכנת מלאי משני של קלציין.

Cancer cells require large amounts of iron to maintain their proliferation. Iron metabolism is considered a hallmark of cancer, making iron a valid target ...

quantifiable-inexpensive-cell-free-fluorescent-method-to-confirm

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

בסרטון זה, אנו מתארים שיטה מבוססת קולורימטריה לקביעת תכולת ברזל שאינה הם ברקמת כבד עכבר. Bathophenanthroline sulfonate משמש כמצע כרומוגני בנוכחות סוכן חיזור, אשר ממיר ברזל ברזל ברזל ברזל chelatable.

בדיקת Colorimetric מבוססת Bathophenanthroline Sulfonate: שיטה פשוטה ומהירה לכימות ברזל שאינו הם ברקמת כבד עכבר

סרטון זה מדגים טכניקה במבחנה להערכת זמינות ביולוגית של ברזל במקורות מזון מורכבים. הטכניקה משלבת סימולציה של עיכול אנושי יחד עם ספיגת ברזל על ידי תאי Caco-2 ממוינים. היווצרות פריטין תוך תאי פועלת כסמן לספיגת ברזל תאי.

Caco-2 cell bioassay: שיטה חוץ גופית למדידת זמינות ביולוגית של ברזל במקורות מזון מורכבים

Ascorbate משחק תפקידים חשובים רבים בחילוף חומרים תאיים, שרבים מהם מגיע רק לאור בשנים האחרונות. כאן אנו מתארים בינוני תפוקה, assay microplate הספציפי וזול לקביעת שני ascorbate התוך וחוץ תאי בתרבית תאים.

Microplate Assay מהיר והספציפי לקביעת Ascorbate Intra-ותאי בתאים בתרבית

אנו מציגים פרוטוקול פשוטה ואמינה למדידת תוכן ברזל ברקמות הצמח באמצעות השיטה כחול פרוסי ערכי צבע מוחלטים.

שיטה ערכי צבע מוחלטים למדידת תכולת ברזל צמחים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לזהות סה כ חמצן הסלולר מינים (ROS) באמצעות 2 ', 7 '-diכלור דיהידרוטסטוסטרון diאצטט (DCFH-DA). שיטה זו יכולה להמחיש לוקליזציה של רוס הסלולר בתאי חסיד עם מיקרוסקופ פלואורסצנטית ועוצמה ROS מכמת עם קורא צלחת הקרינה. פרוטוקול זה הוא פשוט, יעיל וחסכוני.

גילוי של מינים החמצן תגובתי כוללת בתאי חסיד על ידי 2 ', 7 '-Diכלור דיהידרוטסטוסטרון di, מכתים

אנו מציגים שיטת כימות קלה של מתכות הציגו דגימות שהוכנו באמצעות כרומטוגרפיה של זיקה מתכת ללא קיבוע. השיטה משתמשת הידרוקסילנול כחול מחוון הצבע מתכת וספקטרוסקופיה UV-Vis כמו הגלאי.

קוונפיקציה של מתכת Leaching ב קיבוע מתכת זיקה כרומטוגרפיה

מאמר זה מדגים כיצד להכין ולנהל ברזל איזוטופי לא-רדיואקטיבי הקשור לטרנספרין למחקרים על הובלת ברזל בהריון עכבר. כמו כן מתוארת הגישה לכימות ברזל איזוטופי בתאי fetoplacental.

הובלת ברזל כמותית על פני שליבת העכבר In Vivo באמצעות איזוטופים של ברזל לא רדיואקטיבי

כאן, פרוטוקול למדידת התוכן ברזל שאינו heme ברקמות בעלי חיים מסופק, באמצעות בדיקה צבעונית פשוטה ומבוססת היטב שניתן ליישם בקלות ברוב המעבדות.

מדידה של תוכן ברזל רקמות שאינן Heme באמצעות בדיקת צבע מבוססת Bathophenanthroline

הבדיקה הביולוגית של תאי Caco-2 לזמינות ביולוגית של ברזל (Fe) מייצגת גישה חסכונית ורב-תכליתית להערכת הזמינות הביולוגית של Fe ממזונות, מוצרי מזון, תוספי מזון, ארוחות ואפילו משטרי תזונה. הוא מאומת ביסודיות למחקרים בבני אדם, ומייצג את מצב האמנות למחקרים על זמינות ביולוגית של Fe.

הבדיקה הביולוגית של תאי Caco-2 למדידת זמינות ביולוגית של ברזל במזון

פרוטוקול זה מציג שיטות להערכת התפלגות וכמות שקיעת הברזל ברקמות, במיוחד במוח. הפרוטוקול מפרט את הנהלים להכנת דגימה, צביעת Perls/DAB, לכידת תמונה וניתוח נתונים.

הערכת שקיעת ברזל במוחם של עכברי 5xFAD על ידי צביעת Perls/DAB

למדו שיטת סקר פלואורסצנטית זולה ומהירה לאימות יכולת כלאט ברזל של תרכובות חדשות. השיטה משתמשת בבדיקת Calcein לזיהוי כלאטורים פוטנציאליים לטיפול בסרטן.

שיטה פלואורסצנטית ניתנת לכימות וזולה ללא תאים כדי לאשר את היכולת של תרכובות חדשות לכלאט ברזל

גלה סרטונים נוספים