Name: כימות צריכת המזון ב- Caenorhabditis elegans על ידי מדידת פינוי חיידקים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-23T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 5 s
Description: למד כיצד לכמת צריכת מזון ב-Caenorhabditis elegans באמצעות מדידת פינוי חיידקים בתרבית נוזלית. פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים לחקור את הקשר בין התנהגות אכילה לאורך חיים ולזהות תרופות המאריכות תוחלת חיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו רוצים להודות ל- Xiaolan Ye, שכן פרוטוקול זה פותח כתוצאה מתצפית שהיא עשתה במקור. אנו מודים לכל חברי מעבדת Petrascheck בעבר ובהווה על עזרתם בפיתוח ואופטימיזציה של פרוטוקול זה. עבודה זו מומנה על ידי R21 AG080376 (ל- M.P). חלק מהזנים סופקו על ידי CGC, הממומן על ידי המשרד לתוכניות תשתית מחקר של NIH (P40 OD010440).

בדיקת תפוקה גבוהה למדידת Caenorhabditis elegans צריכת מזון ותוחלת חיים

<ol><li>Taormina, G., Mirisola, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calorie+restriction+in+mammals+and+simple+model+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Calorie restriction in mammals and simple model organisms.</a> Biomed Res Int. 2014, 308690(2014).</li>
<li>Cunningham, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amp-activated+kinase+links+serotonergic+signaling+to+glutamate+release+for+regulation+of+feeding+behavior+in+C%5BTitle%5D)+AND+%22elegans.+Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Amp-activated kinase links serotonergic signaling to glutamate release for regulation of feeding behavior in C.</a> elegans. Cell Metab. 16 (1), 113-121 (2012).</li>
<li>You, Y. J., Kim, J., Raizen, D. M., Avery, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin%2C+cgmp%2C+and+tgf-beta+signals+regulate+food+intake+and+quiescence+in+C%5BTitle%5D)+AND+%22elegans%3A+A+model+for+satiety.+Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Insulin, cgmp, and tgf-beta signals regulate food intake and quiescence in C.</a> elegans: A model for satiety. Cell Metab. 7 (3), 249-257 (2008).</li>
<li>Dorman, J. B., Albinder, B., Shroyer, T., Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+age-1+and+daf-2+genes+function+in+a+common+pathway+to+control+the+lifespan+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The age-1 and daf-2 genes function in a common pathway to control the lifespan of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 141 (4), 1399-1406 (1995).</li>
<li>Apfeld, J., Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+nonautonomy+of+C.+elegans+daf-2+function+in+the+regulation+of+diapause+and+life+span%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell nonautonomy of C. elegans daf-2 function in the regulation of diapause and life span.</a> Cell. 95 (2), 199-210 (1998).</li>
<li>Srinivasan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroendocrine+control+of+lipid+metabolism%3A+Lessons+from+C%5BTitle%5D)+AND+%22elegans.+J+Neurogenet%22%5BJournal%5D)">Neuroendocrine control of lipid metabolism: Lessons from C.</a> elegans. J Neurogenet. 34 (3-4), 482-488 (2020).</li>
<li>Calculli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+regulation+of+mitochondria+by+germline+proteostasis+prevents+protein+aggregation+in+the+soma+of%5BTitle%5D)+AND+%22elegans.+Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Systemic regulation of mitochondria by germline proteostasis prevents protein aggregation in the soma of.</a> elegans. Sci Adv. 7 (26), eabg3012(2021).</li>
<li>Avery, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+feeding+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of feeding in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 133 (4), 897-917 (1993).</li>
<li>Wu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+restriction+extends+lifespan+through+metabolic+regulation+of+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Dietary restriction extends lifespan through metabolic regulation of innate immunity.</a> Cell Metab. 29 (5), 1192-1205.e8 (2019).</li>
<li>Chen, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+convergence+reveals+a+lipid+pathway+that+regulates+C.+elegans+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Pharmacological convergence reveals a lipid pathway that regulates C. elegans lifespan.</a> Nat Chem Biol. 15 (5), 453-462 (2019).</li>
<li>Gomez-Amaro, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+food+intake+and+nutrient+absorption+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Measuring food intake and nutrient absorption in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 200 (2), 443-454 (2015).</li>
<li>Mckay, J. P., Raizen, D. M., Gottschalk, A., Schafer, W. R., Avery, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eat-2+and+eat-18+are+required+for+nicotinic+neurotransmission+in+the+Caenorhabditis+elegans+pharynx%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Eat-2 and eat-18 are required for nicotinic neurotransmission in the Caenorhabditis elegans pharynx.</a> Genetics. 166 (1), 161-169 (2004).</li>
<li>Hobson, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ser-7%2C+a+Caenorhabditis+elegans+5-ht7-like+receptor%2C+is+essential+for+the+5-ht+stimulation+of+pharyngeal+pumping+and+egg+laying%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Ser-7, a Caenorhabditis elegans 5-ht7-like receptor, is essential for the 5-ht stimulation of pharyngeal pumping and egg laying.</a> Genetics. 172 (1), 159-169 (2006).</li>
<li>Deshpande, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+Drosophila+food+intake%3A+Comparative+analysis+of+current+methodology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantifying Drosophila food intake: Comparative analysis of current methodology.</a> Nat Methods. 11 (5), 535-540 (2014).</li>
<li>Webster, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+rnai+screen+for+fat+regulatory+genes+in+C.+elegans+identifies+a+proteostasis-ampk+axis+critical+for+starvation+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Genome-wide rnai screen for fat regulatory genes in C. elegans identifies a proteostasis-ampk axis critical for starvation survival.</a> Cell Rep. 20 (3), 627-640 (2017).</li>
<li>Reis Rodrigues, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+ligands+of+cannabinoid+receptors+affect+dauer+formation+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22G3+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">Synthetic ligands of cannabinoid receptors affect dauer formation in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> G3 (Bethesda). 6 (6), 1695-1705 (2016).</li>
<li>Levichev, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+conserved+endocannabinoid+anandamide+modulates+olfactory+sensitivity+to+induce+hedonic+feeding+in+C%5BTitle%5D)+AND+%22elegans.+Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">The conserved endocannabinoid anandamide modulates olfactory sensitivity to induce hedonic feeding in C.</a> elegans. Curr Biol. 33 (9), 1625-1639.e4 (2023).</li>
<li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+behavioral+screen+identifies+an+orphan+anti-opioid+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genetic behavioral screen identifies an orphan anti-opioid system.</a> Science. 365 (6459), 1267-1273 (2019).</li>
<li>Cheong, M. C., Artyukhin, A. B., You, Y. J., Avery, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+opioid-like+system+regulating+feeding+behavior+in+C%5BTitle%5D)+AND+%22elegans.+Elife%22%5BJournal%5D)">An opioid-like system regulating feeding behavior in C.</a> elegans. Elife. 4, e06683(2015).</li>
<li>Lakowski, B., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+caloric+restriction+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The genetics of caloric restriction in Caenorhabditis elegans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (22), 13091-13096 (1998).</li>
<li>Huang, C., Xiong, C., Kornfeld, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurements+of+age-related+changes+of+physiological+processes+that+predict+lifespan+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Measurements of age-related changes of physiological processes that predict lifespan of Caenorhabditis elegans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (21), 8084-8089 (2004).</li>
<li>Witham, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+body+cavity+neurons+are+homeostatic+sensors+that+integrate+fluctuations+in+oxygen+availability+and+internal+nutrient+reserves%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">C. elegans body cavity neurons are homeostatic sensors that integrate fluctuations in oxygen availability and internal nutrient reserves.</a> Cell Rep. 14 (7), 1641-1654 (2016).</li>
<li>Hussey, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen-sensing+neurons+reciprocally+regulate+peripheral+lipid+metabolism+via+neuropeptide+signaling+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Oxygen-sensing neurons reciprocally regulate peripheral lipid metabolism via neuropeptide signaling in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Genet. 14 (3), e1007305(2018).</li>
<li>Zapata, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocytes+control+food+intake+and+weight+regain+via+vacuolar-type+h%28%2B%29+atpase%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Adipocytes control food intake and weight regain via vacuolar-type h(+) atpase.</a> Nat Commun. 13 (1), 5092(2022).</li>
<li>Clay, K. J., Yang, Y., Clark, C., Petrascheck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteostasis+is+differentially+modulated+by+inhibition+of+translation+initiation+or+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Proteostasis is differentially modulated by inhibition of translation initiation or elongation.</a> Elife. 12, e76465(2023).</li>
<li>Perez-Gomez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phenotypic+caenorhabditis+elegans+screen+identifies+a+selective+suppressor+of+antipsychotic-induced+hyperphagia%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A phenotypic caenorhabditis elegans screen identifies a selective suppressor of antipsychotic-induced hyperphagia.</a> Nat Commun. 9 (1), 5272(2018).</li>
<li>Zapata, R. C., Zhang, D., Chaudry, B., Osborn, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-administration+of+drugs+in+mouse+models+of+feeding+and+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Self-administration of drugs in mouse models of feeding and obesity.</a> J Vis Exp. (172), 62775(2021).</li>
<li>Zapata, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+clic1+for+the+treatment+of+obesity%3A+A+novel+therapeutic+strategy+to+reduce+food+intake+and+body+weight%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Metab%22%5BJournal%5D)">Targeting clic1 for the treatment of obesity: A novel therapeutic strategy to reduce food intake and body weight.</a> Mol Metab. 76, 101794(2023).</li>
<li>Stuhr, N. L., Curran, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+diets+differentially+alter+lifespan+and+healthspan+trajectories+in+C%5BTitle%5D)+AND+%22elegans.+Commun+Biol%22%5BJournal%5D)">Bacterial diets differentially alter lifespan and healthspan trajectories in C.</a> elegans. Commun Biol. 3 (1), 653(2020).</li>
<li>Stuhr, N. L., Curran, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+methods+of+killing+bacteria+diets+differentially+influence+Caenorhabditis+elegans+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22MicroPubl+Biol%22%5BJournal%5D)">Different methods of killing bacteria diets differentially influence Caenorhabditis elegans physiology.</a> MicroPubl Biol. 2023, (2023).</li>
<li>Solis, G. M., Petrascheck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+caenorhabditis+elegans+life+span+in+96+well+microtiter+plates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Measuring caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates.</a> J Vis Exp. (49), (2011).</li>
<li>Wofford, M. R., King, D. S., Harrell, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-induced+metabolic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Hypertens+%28Greenwich%29%22%5BJournal%5D)">Drug-induced metabolic syndrome.</a> J Clin Hypertens (Greenwich). 8 (2), 114-119 (2006).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.

Caenorhabditis elegans נמצא בשימוש נרחב בחקר ההזדקנות.  זה היה מודל רב עוצמה לחקור את הגנטיקה העומדת בבסיס חילוף החומרים בתיווך אריכות ימים הנגרמת על ידי הגבלה תזונתית, פעילות מיטוכונדריאלית מופחתת, או איתות אינסולין מופחת. 1,2,3,4,5,6,7. עם זאת, מדידת האכלה בהקשר של אריכות ימים הוכחה כקשה עבור C. elegans בשל גודלו הקטן של בעל החיים 3,8,9,10,11,12,13,14,15.
האכלה היא התנהגות ביולוגית בסיסית הנדרשת להישרדות, והרגולציה ההדוקה שלה נמצאת בליבת השמירה על בריאות מטבולית, רבייה והזדקנות. התנהגות האכלה נשלטת על ידי מסלולי איתות מרובים הן במערכת העצבים והן בפריפריה, ולכן ניתן לחקור אותה רק in vivo 16,17,18,19. האכלה מייצגת את הראשון מבין שלושה עמודי תווך: (i) צריכת אנרגיה, (ii) אחסון אנרגיה, ו-(iii) הוצאות אנרגיה השולטות בהומאוסטזיס האנרגיה של אורגניזם. האכלה ב- C. elegans נחקרה בעיקר על ידי מדידת שאיבת הלוע, כפי שהוגדרה על ידי קצב ההתכווצויות של הלוע. גישה זו סיפקה תובנות מכריעות לגבי התנהגות ההזנה של C. elegans 3,4,8,12,13,20,21; עם זאת, שאיבת הלוע, הנמדדת במיוחד על פני פרקי זמן קצרים של דקות, אינה בהכרח מתואמת עם צריכת מזון.
צריכת המזון נקבעת לא רק על ידי קצב שאיבת הלוע אלא גם על ידי פרמטרים כגון משך ותדירות התקפי האכלה וצפיפות חיידקי המזון. לבעל חיים עשויה להיות שאיבת לוע גבוהה מאוד, אך אורך התקפי ההאכלה שלו עשוי להיות קצר יותר, ולקזז את הקצב המוגבר. גורם מבלבל נוסף הוא היעילות שבה שאיבה עשויה או לא יכולה לבלוע ולטחון חיידקים. דוגמה קיצונית לשחרור צריכת מזון משאיבת הלוע היא תוספת של סרוטונין ללא נוכחות מזון (חיידקים). בנוכחות סרוטונין אקסוגני, בעלי חיים שואבים בקצב גבוה, אך ללא נוכחות חיידקים, קצב השאיבה הגבוה אינו מוביל לצריכת מזון 2,6,13,22,23.
שיטת פינוי החיידקים שמוצגת כאן מודדת את צריכת המזון של אוכלוסיות תולעים בבארות בודדות כירידה בריכוזי חיידקים לאורך זמן (איור 1). גישה זו דומה לאלה המשמשות במינים אחרים שבהם היעלמות המזון מייצגת מדד לצריכת מזון 10,11,24,25,26,27,28. בפרסום המקורי, תיקפנו שיטה זו למדידת צריכת מזון על ידי הזנת C. elegans עם 15N חיידקים המסומנים באיזוטופ11. מדדים מאוחרים יותר על ידי ספקטרומטריית מסות הראו כי מדידת היעלמותם של חיידקים הייתה בקורלציה חזקה עם התרחשות של תיוג איזוטופים, וחשפה את הספיגה בפועל של החיידקים לתוך החיה11. לכן, אנו בטוחים כי בדיקת פינוי החיידקים מייצגת צריכת מזון ברוב הנסיבות. מטרת הבדיקה אינה להחליף את בדיקת שאיבת הלוע אלא להוסיף לארגז הכלים של בדיקות לחקר הזנה ומטבוליזם ב- C. elegans וכיצד זה קשור להזדקנות ואריכות ימים.

<table><tbody><tr><td>אמפוטריצין B</td><td>RPI</td><td>A40030-0.1</td><td>ממס: EtOH</td></tr><tr><td>אמפיצילין</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP176025</td><td>ממס: מים</td></tr><tr><td>בקטו פפטון</td><td>BD Biosciences</td><td>211677</td><td>השתמש להכנת צלחות NGM</td></tr><tr><td>קרבניצילין</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>46-100-RG</td><td>ממס: מים</td></tr><tr><td>מסננת תאים</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>22363547</td><td>40 ומיקרו; M להסרת מבוגרים</td></tr><tr><td>כולסטרול&nbsp;</td><td>MP ביומדיקל</td><td>02101380-CF</td><td>מלאי 5 מ"ג/מ"ל</td></tr><tr><td>דיפקו, אגר, בקטריולוגי</td><td>BD Biosciences</td><td>214510</td><td>השתמש להכנת צלחות NGM</td></tr><tr><td>פלואורו-דאוקסיורידין</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>F0503</td><td>כדי לעקר תולעים ב-L4</td></tr><tr><td>מרק לוריא</td><td>RPI</td><td>L24045-1000.0</td><td>כמוסה פתוחה, לערבב עם 1 ליטר מים, חיטוי</td></tr><tr><td>מאגר M9&nbsp;</td><td>הוכן במעבדה</td><td></td><td>יש לאחסן בתנאים סטריליים בטמפרטורת החדר להכנת 1 ליטר: &nbsp; 15 גרם Na2HPO4*12H2O (FW: 358) 3 גרם KH2PO4 (FW: 136) &nbsp; 5 גרם NaCl (FW: 58), 0.25 גרם MgSO4*7H2O (FW: 246) &nbsp; אוטוקלאב</td></tr><tr><td>אוטם מיקרופלייט</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>236707</td><td></td></tr><tr><td>OP50</td><td>המרכז לגנטיקה של Caenorhabditis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>צלחת 96-באר&nbsp;</td><td>בז</td><td>351172</td><td></td></tr><tr><td>קורא צלחות</td><td>טקאן</td><td>30016056</td><td>השתמש בעדשת מסנן 600 ננומטר</td></tr><tr><td>אשלגן ציטראט, 1 מ ', pH 6</td><td>הוכן במעבדה</td><td></td><td>יש לאחסן בתנאים סטריליים בטמפרטורת החדר להכנת 1 ליטר: 268.8 גרם אשלגן ציטראט tribasic monohydrate (FW: 324) 26.3 גרם חומצת לימון מונוהידרט (FW: 210) 900 מ"ל של dH2O pH עד 6 באמצעות 5 M KOH autoclave&nbsp;</td></tr><tr><td>אשלגן פוספט, 1 מ ', pH 6&nbsp;</td><td>הוכן במעבדה</td><td></td><td>יש לאחסן בתנאים סטריליים בטמפרטורת החדר להכנת 1 ליטר: 136 גרם KH2PO4 (FW: 136) 900 מ"ל dH2O &nbsp; pH עד 6 באמצעות חיטוי 5 M KOH </td></tr><tr><td>ס-בזל</td><td>הוכן במעבדה</td><td></td><td>יש לאחסן בתנאים סטריליים בטמפרטורת החדר להכנת 1 ליטר: 5.9 גרם NaCl (FW: 58) &nbsp; 50 מ"ל 1 מ' אשלגן פוספט (pH 6) מוסיפים 900 מ"ל dH2O חיטוי, מצננים ל-55 מעלות; C</td></tr><tr><td>S-שלם</td><td>הוכן במעבדה</td><td></td><td>יש לאחסן בתנאים סטריליים בטמפרטורת החדר להכנת 1 ליטר: להוסיף ל-1 ליטר S-בזאלי (מקורר ל-55 מעלות; C או RT) &nbsp; 10 מ"ל של 1 מ 'אשלגן ציטראט &nbsp; pH 6, 10 מ"ל של תמיסות קורט מתכת &nbsp; 3 מ"ל של 1 מיליארד CaCl<תת>2</תת> 3 מ"ל של 1 מיליארד MgSO<תת>4</td></tr><tr><td>סרוטונין הידרוכלוריד</td><td>תרמו סיינטיפיק</td><td>AAB2126309</td><td>בשימוש של 5 מ"מ</td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>S7653-5 ק"ג</td><td>להכנת מאגרים וצלחות NGM</td></tr><tr><td>מרק נהדר</td><td>תרמו סיינטיפיק</td><td>J75856-A1</td><td>12.5 גרם ב-250 מ"ל מים, חיטוי</td></tr><tr><td>שייקר צלחת טיטר</td><td>תרמו סיינטיפיק</td><td>88880023</td><td>מטלטל ב 800 סל"ד, תלוי בשייקר</td></tr><tr><td>תמיסת קורט מתכות&nbsp;</td><td>הוכן במעבדה</td><td></td><td>יש לאחסן בתנאים סטריליים בטמפרטורת החדר להכנת 1 ליטר: 1.86 גרם Na2EDTA (FW: 372.24) 0.69 גרם FeSO4*7H2O (FW: 278) &nbsp; 0.20 גרם MnCl2*4H2O (FW: 198) 0.29 גרם ZnSO4*7H2O (FW: 287) &nbsp; 0.016 גרם CuSO4 (FW: 158) autoclave עוטפים בנייר אלומיניום לשמירה בחושך</td></tr></tbody></table>

כימות צריכת המזון ב- caenorhabditis elegans על ידי מדידת פינוי חיידקים

Quantifying Food Intake in Caenorhabditis elegans by Measuring Bacterial Clearance

הזנה היא תהליך ביולוגי חיוני לצמיחה, רבייה והישרדות של אורגניזם. בדיקה זו נועדה למדוד את צריכת המזון של Caenorhabditis elegans (C. elegans), פרמטר חשוב כאשר לומדים את הגנטיקה של הזדקנות או מטבוליזם. ברוב המינים, האכלה נקבעת על ידי מדידת ההפרש בין כמות המזון שסופקה לבין הכמות שנותרה לאחר מרווח זמן נתון. השיטה המוצגת כאן משתמשת באותה אסטרטגיה כדי לקבוע את האכלה של C. elegans. הוא מודד את כמות החיידקים, מקור המזון של C. elegans, שנוקו תוך 72 שעות. שיטה זו משתמשת בצלחות מיקרוטיטר של 96 בארות ואפשרה סינון של מאות תרופות בשל יכולתן לווסת את צריכת המזון במהירות ובעומק שאינם אפשריים במודלים אחרים של בעלי חיים. כוחה של בדיקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת למדוד האכלה ותוחלת חיים בו זמנית ומודדת ישירות את היעלמות המזון, ולכן מבוססת על אותם עקרונות המשמשים אורגניזמים אחרים, מה שמקל על השוואה בין מינים למינים.

<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66422/66422fig3_v1.jpg"> תרשים 3: נתונים מייצגים. (A) הגרף מציג עקומות מנה-תגובה של שינוי קפל בצריכת המזון כפונקציה של ריכוז הסרוטונין. כל הנתונים מראים צריכת מזון בסיסי לא מגורה מנורמל להזנה בסיסית N2. שימו לב שבעלי החיים מסוג daf-16(mu86) אוכלים יותר מבעלי חיים מסוג N2 פראי כאשר לא נוסף סרוטונין, אך מראים טווח קהה ביכולתם לשלוט בהאכלה. (B) גרף מראה תרשים כינור של שינוי קפל בצריכת המזון של תולעים שטופלו ב-50 מיקרומטר של לוקספין האנטי-פסיכוטי אך ניזונו מחיידקים שהומתו על-ידי קרני רנטגן, קרני γ או פרפורמלדהיד (C) גרף מראה תרשים כינור של שינוי קפל בצריכת המזון של מוטנטים שונים עם הגנוטיפים שלהם המסומנים בציר ה-x. נתונים אלה מצביעים על כך שמוטנטים exc-4 ו-cgr-1 אוכלים פחות, בעוד שמוטנטים של srp-6 אוכלים יותר. כוכביות מייצגות ** p &lt; 0.001, ****p &lt; 0.0001 כפי שנקבע על ידי ANOVA ובראון-פורסיית-וולש, מתוקן פוסט-הוק כדי להסביר בדיקות השערות מרובות. קווי שגיאה מציגים את ±S.E.M. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66422/66422fig3large_v1.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
איור 1 מדגיש את זרימת העבודה הכוללת של פרוטוקול זה. הוא ממחיש את התהליך כולו, החל מייצור החיידקים ועד לרכישת קריאת OD600 ביום הראשון וביום הרביעי. בנוסף, האינפוגרפיקה מפנה לשלבים הספציפיים של השיטות בהן נעשה שימוש. איור 2A, B מראה שתי פריסות אפשריות של לוחות ניסיוניים, כולל בארות בקרה "ללא תולעים" בשורה H, הנחוצות לחישוב שיעורי הליזה העצמית המתוארים בסעיף הדיון. מניסיונה של המעבדה שלנו, הכרחי שאחד התנאים לא יטופל בבקרת N2 כדי להסביר את השונות של צריכת חיידקים של תולעים שנצפתה בין ניסויים (ראו דיון: תכנון [אוכלוסיית ייחוס N2]).
איור 2C הוא דוגמה לגיליון האלקטרוני המשמש לניתוח הנתונים שנוצרו בפרוטוקול זה. זה מדגיש את ספירת התולעים בירוק, selflysis בכחול, יום 1 OD600 ויום 4 OD600 בכתום, ואת צריכת המזון לכל תולעת באדום. בנוסף, כל באר נמצאת במעקב אחר הזן, התרופה, הריכוז, תאריך הניסוי וטיפולים אחרים שנוספו. מידע נוסף על המשוואות הספציפיות בהן נעשה שימוש ניתן למצוא בסעיף 3 של הפרוטוקול. בסך הכל, גיליונות אלקטרוניים אלה (תבנית המסופקת כחומרים משלימים) מספקים איסוף וניתוח נתונים יעילים של פרוטוקול זה.
איור 3A מראה תוצאות מייצגות עבור עקומת מנה-תגובה של האופן שבו סרוטונין מווסת את ההזנה במוטציות N2 ו-daf-16 באמצעות פרוטוקול זה. בניסוי זה, השינוי בקיפול מצריכת המזון הבסיסי (הנקודה הראשונה בעקומה) חושב על פני חמש מנות הולכות וגדלות של סרוטונין. כפי שתוצאות אלה מדגישות, זן N2 מסוגל לאכול יתר על המידה באופן תלוי מינון. עם זאת, עבור מוטציית daf-16(mu86), למרות שההזנה הבסיסית גבוהה מ-N2, המוטנט אינו יכול להגיב לסרוטונין באותו אופן תלוי מינון כמו זן N2. פרוטוקול זה מאפשר לנו לקבוע את התנהגות ההזנה בין שני זנים שבהם ריכוז הסרוטונין היה הגורם המשתנה ליצירת עקומות מנה-תגובה. איור 3B מראה את צריכת המזון של תולעים שטופלו בלוקספין האנטי-פסיכוטי אבל ניזונו מחיידקים שנהרגים על-ידי קרני רנטגן, קרני γ או פרפורמלדהיד. יש לציין כי ניסויים אלה לא נערכו במקביל וכי ההבדלים אינם מייצגים את השיטות השונות להרוג את החיידקים אלא נובעים משונות בין ניסויים. איור 3C מראה את צריכת המזון של סדרה של זנים גנטיים, כאשר שני זנים מראים ירידה וזן אחד מראה עלייה בהתנהגות ההזנה ביחס ל-N2. יישום זה של הפרוטוקול מאפשר בדיקה של תרופה אחת בריכוז אחד על פני רקעים גנטיים שונים. הוא מתאים לזיהוי רקע גנטי המציג תגובת צריכת מזון שונה מזו של קבוצת ביקורת מסוג N2 פראי כאשר ניתנת אותה תרופה. ניתן לשלב אותו עם פרוטוקול תוחלת החיים שלנו כדי לסנן במהירות את צריכת המזון ואת תוחלת החיים באותה צלחת31.
חומר משלים: תבניות גיליון אלקטרוני המוצגות באיור 2C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66422/66422.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד חומרים אלה.</a>

פרוטוקול זה מתאר בדיקה לכימות קצב ההזנה של Caenorhabditis elegans בהתבסס על מדידת פינוי החיידקים בתרבית נוזלית.

כימות צריכת המזון ב- Caenorhabditis elegans על ידי מדידת פינוי חיידקים

Feeding is an essential biological process for an organism&#39;s growth, reproduction, and survival. This assay aims to measure the food intake of ...

המחקר שלי מתמקד בהבנת מסלולי השעתוק והמטבוליזם העומדים בבסיס שינויים הנגרמים על ידי תרופות בהתנהגות האכלה. אני עובד על זיהוי תרופות שמורידות את צריכת המזון ומאריכות את תוחלת החיים המעידות על הפעלת מסלולי צום בריאים. באמצעות בדיקת פינוי החיידקים שלנו, זיהינו שני מסלולים נפרדים המווסתים את צריכת המזון הנגרמת על ידי סרוטונין ואת צריכת המזון הנגרמת על ידי תרופות אנטי-פסיכוטיות.כעת אני חוקרת כיצד המסלולים האלה קשורים להאכלה של מוטנטים מאריכי חיים. פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים לחקור את הקשר בין הזנה לאריכות ימים. קצב ההזנה מאופיין בדרך כלל בשאיבת הלוע.עם זאת, קצב השאיבה ב-C.elegans אינו בהכרח פרופורציונלי לכמות המזון הנאכלת. כאשר מוסיפים אותו לבדיקות הקודמות, פרוטוקול זה נותן כמות ניתנת לכימות של צריכת מזון לכל אוכלוסיית תולעים. הבדיקה שלנו מאפשרת לנו לווסת כמותית את ההזנה באמצעות מולקולות קטנות, ולקבוע כיצד השינוי המושרה משנה את תוחלת החיים בו זמנית.

quantifying-food-intake-caenorhabditis-elegans-measuring-bacterial

Research

JoVE Journal

Behavior

התנהגות

סרטון זה מציג שיטה לדמיין ולמדוד את שלמות לומן המעי של C. elegans על ידי הזנת תולעים שכותרתן דקסטרן FITC. הפרוטוקול לדוגמה מציג את הבדיקה שנעשתה עם תולעים 3,3'-diindolylmethane (DIM) שטופלו וניזונו מפתוגן.

האכלת FITC-Dextran: שיטה לכימות חדירות המעי ב- C. elegans

מקור: טיילור, מ.נ., et.al. שימוש בנתוני תולעת בודדת כדי לכמת הטרוגניות באינטראקציות חיידקיות-חיידקיות Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2022)סרטון זה מדגים את החשיפה של תולעי Caenorhabditis elegans נטולות חיידקים ותואמות גיל לזן חיידקים לצורך קולוניזציה של המעי. זה מסביר את ההסרה הסלקטיבית של חיידקים חיצוניים שאינם נדבקים, ומשאירים רק חיידקים ברי קיימא דבוקים לאפיתל המעי לצורך כימות.

הערכת קולוניזציה של חיידקי מעיים ב - C. elegans נטול חיידקים

מקור: לה, ט. א. נ., ואחרים, מדידת השפעות חיידקים וכימיקלים על חדירות המעיים של Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2019)סרטון זה מדגים בדיקה מבוססת פלואורסצנציה לכמת חדירות המעי ב-C. elegans שנחשפו ל-Pseudomonas aeruginosa. בהשוואה לביקורת שקיבלו Escherichia coli, תולעים שטופלו בפתוגן מראות דליפת פלואורופור מוגברת לחלל הגוף, מה שמעיד על נזק למחסום האפיתליאלי.

הערכת חדירות המעי ב-C. elegans לאחר חשיפה לחיידקים

בסרטון זה אנו מדגימים טכניקה למדידת עומס חיידקי E. coli לאחר הזרקת E. coli לבית החזה של Drosophila melanogaster.

מדידת עומס חיידקי E. coli ב- Drosophila melanogaster בעקבות זיהום E. coli

כאן, אנו מציגים מסגרת להתייחס הגבלות תזונתיות מגוון רחב ביטוי גנים ואת תוחלת החיים. אנו מתארים פרוטוקולים עבור הגבלות תזונתיות מגוון רחב, הדמיה כמותית של ביטוי גנים תחת הפרדיגמה הזו. אנחנו עוד חלוקה לרמות ניתוחים חישובית לחשוף שבבסיס תכונות עיבוד המידע של מעגלים גנטי מעורב חישה מזון.

כימות של מידע מקודד על ידי גנים ביטוי רמות במהלך תוחלת החיים אפנון תחת הגבלת תזונה מגוון רחב C . elegans

נשימה מיטוכונדריאלי חיוני להישרדות organismal; לכן, קצב צריכת החמצן היא מדד מצוין של בריאות מיטוכונדריאלי. פרוטוקול זה, אנו מתארים את השימוש respirometer זמינים מסחרית כדי למדוד הבזליים, שיעורי צריכת חמצן מירבית חיים, שלמים, ולא תאי בחופשיות Caenorhabditis elegans.

מדידה של קצב הצריכה של חמצן בשלם Caenorhabditis elegans

פרוטוקול זה מתאר כיצד למדוד חדירות המעי של האלגיה. שיטה זו מועילה למחקרים ביולוגיים בסיסיים על בריאות המעיים הקשורים לאינטראקציה בין בקטריה מעיים למארחים שלהם ולהקרנה כדי לזהות פרוביוטיקה וחומרים כימיים כדי לרפא תסמונת המעיים הדולף ומחלות המעי דלקתיות.

מדידת ההשפעות של חיידקים וכימיקלים על חדירות המעי של האלמרנים

פרוטוקול זה מתאר שיבוש של 96 קידוחים של קאנורהבדיטיס אלגאן (Caenorhabditis elegans ) המיושבים בחיידקים בעקבות שיתוק קר והלבנת פני השטח כדי לסלק חיידקים חיצוניים. התרחיף המתקבל מצופה על לוחות אגר כדי לאפשר כימות מדויק בתפוקה בינונית של עומס חיידקים במספר גדול של תולעים בודדות.

שימוש בנתונים של תולעת בודדת כדי לכמת את ההטרוגניות באינטראקציות של Caenorhabditis elegans-Bacterial

Caenorhabditis elegans הוא מודל רב-עוצמה לבחינת הדטרמיננטים המולקולריים המניעים אינטראקציות בין המארח למיקרוביום. אנו מציגים צינור בתפוקה גבוהה המתאר את רמות ההתיישבות של מיקרוביום המעי בבעלי חיים בודדים יחד עם היבטים מרכזיים של הפיזיולוגיה של C. elegans.

יישום של ורמימטריית זרימה לכימות וניתוח של מיקרוביום המעי Caenorhabditis elegans

הליך המאפשר הדגמה של הגדלת החזקה של סמים המבקשים בחולדות מוגבלות מזון מתואר. לאחר אימון הרואין מנהל עצמי, חולדות לעבור תקופת התנזרות, בסביבה נקיה מסמים, שבמהלכו הם אסירי מזון מוגבל. מבקשי תרופה נבדקו ולאחר מכן בסביבה הקשורים בסמים.

פרוצדורה כדי לחקור את ההשפעה של הגבלת מזון ממושכת בהרואין מחפש אצל חולדות מתנזרות

למד כיצד לכמת צריכת מזון ב-Caenorhabditis elegans באמצעות מדידת פינוי חיידקים בתרבית נוזלית. פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים לחקור את הקשר בין התנהגות אכילה לאורך חיים ולזהות תרופות המאריכות תוחלת חיים.

כימות צריכת המזון ב- Caenorhabditis elegans על ידי מדידת פינוי חיידקים

גלה סרטונים נוספים