Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) - בדיקה מבוססת למדידת אינטראקציות של CRAF עם 14-3-3 חלבונים בתאים חיים
1 במרץ 2024
פרוטוקול זה מתאר בדיקה מבוססת BRET למדידת האינטראקציות של קינאז CRAF עם 14-3-3 חלבונים בתאים חיים. הפרוטוקול מתאר שלבים להכנת התאים, קריאת פליטות BRET וניתוח נתונים. מוצגת גם תוצאה לדוגמה עם זיהוי בקרות מתאימות ופתרון בעיות עבור מיטוב מבחן.
המוקד העיקרי של המחקר שלנו הוא לחשוף נקודות תורפה חדשות במסלול הקינאז Ras-MAPK באמצעות מחקר של מוטציות הקשורות למחלות נדירות בתוכו. לאחרונה פיתחנו בדיקה נוספת מבוססת BRET למדידת פעילויות מעכבות אוטומטיות של קינאזות RAF בתאים חיים. חשוב לציין כי בדיקה זו הייתה חיונית לאפיון קבוצה של מוטציות נדירות בתאי הנבט בתחום העשיר בציסטאין BRAF, אשר המחישו את חשיבותו הקריטית של תחום זה לשמירה על עיכוב אוטומטי של BRAF ולמניעת פעילות ביולוגית מכוננת של BRAF.
בדיקה זו מודדת את האינטראקציות של 1433 חלבונים עם CRAF קינאז של חיל האוויר המלכותי, ואינטראקציות אלה ממלאות תפקידים חיוניים בתיווך תפקוד חיל האוויר המלכותי הן בהתפתחות והן במחלות. בנוסף, בדיקה זו בשילוב עם בדיקות שנקבעו בעבר למדידת עיכוב אוטומטי של חיל האוויר המלכותי והאינטראקציה בין חיל האוויר המלכותי לחיל האוויר המלכותי מהווים את הבסיס לערכת כלים לניתוח מנגנוני הבקרה של קינאזות RAF בתאים חיים.
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר בדיקה מבוססת BRET למדידת האינטראקציות של קינאז ה-CRAF עם חלבוני 14-3-3 בתאים חיים. הבדיקה חיונית להבנת מנגנוני הבקרה של קינאזות RAF הן בהתפתחות והן במחלה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה של התא
- ביוכימיה
- העברת אותות
רקע
- נתיב ה-RAS-MAP kinase חיוני לתהליכים תאיים שונים.
- קינאזות RAF, כולל B-RAF ו-C-RAF, הן רגולטורים מרכזיים בנתיב זה.
- חלבונים מסוג 14-3-3 מקיימים אינטראקציה עם קינאזות RAF ומשפיעים על תפקודן.
- הבנת אינטראקציות אלו עשויה לחשוף תובנות לגבי מוטציות במחלות נדירות.
מטרת המחקר
- למדידת האינטראקציות של CRAF עם חלבוני 14-3-3.
- לאפיון תפקידן של מוטציות ספציפיות בקינאזות RAF.
- לפיתוח ערכת כלים לבחינת הבקרה של RAF בתאים חיים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת תאי 293 FT עבור בדיקות BRET.
- מדידת פליטות BRET להערכת אינטראקציות בין חלבונים.
- ניתוח נתונים לאופטימיזציה של הבדיקה וזיהוי ביקורות.
- שימוש בבדיקות שהוקמו בעבר לצורך ניתוח מקיף.
תוצאות עיקריות
- מדידה מוצלחת של אינטראקציות בין חלבון CRAF לבין חלבון 14-3-3.
- זיהוי דומיינים קריטיים בקינזות RAF המעורבים בעיכוב עצמי (auto inhibition).
- הדגמת התועלת של הבדיקה במחקר של מוטציות נדירות.
- ביסוס מסגרת עבודה למחקרי RAF עתידיים.
מסקנות
- הבדיקה המבוססת על BRET יעילה לחקר אינטראקציות של קינאז RAF.
- התובנות שנרכשו יכולות להנחות אסטרטגיות טיפוליות למחלות קשורות.
- עבודה זו תורמת להבנת הוויסות של קינאז RAF.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מדידה כמותית של אינטראקציות בין חלבוני CRAF ו-14-3-3 בתאים חיים נותנת מענה לאתגר קריטי בתיקוף מטרות עבור גילוי תרופות למסלול RAS-MAPK. בדייה זו, המבוססת על BRET, מאפשרת הפחתת סיכונים מכניסטית על ידי בחינה ישירה של אינטראקציות רגולטוריות בין חלבונים המעורבות באותות אונקוגניים ובמחלות נדירות. גישה זו תומכת בביטחון חיזוי בנקודת המפנה של הגילוי המוקדם ומיון המטרות לצורך קידום פורטפוליו הפיתוח.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בדיקה ישירה של אינטראקציות בין CRAF ל-14-3-3 המרכזיות לוויסות של מסלול ה-RAS.
- תומך בתיקוף תפקודי של מוטציות רלוונטיות למחלה המשפיעות על פעילות הקינאז RAF.
- מקל על הפחתת סיכונים מכניסטית על ידי כימות השפעותיהן של מוטציות ספציפיות על קישור חלבונים.
- מספק הקשר של תאים חיים להערכת אינטראקציות בין חלבונים רגולטוריים הרלוונטיות לביולוגיה של המחלה.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מספק פלטפורמה מאושרת למדידה כמותית של אינטראקציות בין חלבונים בתאים חיים.
- מאפשר זיהוי הדיר בשיטה הניתנת לשחזור של הפרעה באינטראקציה על ידי מוטציות ספציפיות לאתר.
- תומך בסטנדרטיזציה של הבדיקה וביכולת הרחבה (scalability) עבור סריקת תרכובות המכוונת לממשקי RAF-14-3-3.
- מייצר פלטי כמותיים חזקים המתאימים לתהליכי עבודה של סריקה בשלבים הבאים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתכתב עם מערכות רלוונטיות למחלה באמצעות מידול אינטראקציות המעורבות בסרטן וב-RASopathies.
- מספק רצף מגילוי מכניסטי ועד לתיקוף פרה-קליני של מודולציית מסלולים.
- מאפשר קבלת החלטות על קידום מותאם-סיכון המבוססות על נתוני אינטראקציה כמותיים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
בדיקה זו, המבוססת על BRET, משתלבת ברצף הגילוי החל משלב אישור המטרה המוקדם, דרך זיהוי מובילים ועד למחקרים פרה-קליניים, ובכך היא תומכת הן במחקרים מכניסטיים והן במערכי סריקה.
- ביולוגיה של גילוי: מכמת אינטראקציות של חלבונים רגולטוריים כדי להבהיר מנגנוני מסלולים ולתקף היפותזות טיפוליות.
- סריקה: מספקת מוכנות של בדיקה (assay) והדירות לצורך הערכת מודולטורים של קישור CRAF-14-3-3.
- אנליטיקה: מספקת יחסי BRET כמותיים ותוצאות התלויות במוטציה לצורך ניתוח השוואתי.
- מחקר תרגומי: ממדל אינטראקציות של חלבונים הרלוונטיים למחלה לצורך המשכיות פרה-קלינית.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס ערכת כלים לשימוש חוזר לצורך ניתוח הרגולציה של RAF kinase במערכות של תאים חיים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף מטרות.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של בדיקות אינטראקציה בתאים חיים לצורך הדירות ויכולת הרחבה.
- ערך אסטרטגי: מספק בסיס להחלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) ומשפר את יעילות ההון על ידי הפחתת סיכונים במטרות מוקדמות.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם סיכונים ובקידום תוכניות של מסלול ה-RAS.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בפיתוח סבבי בדיקה (assays) בתאים חיים ובניתוח אינטראקציות בין חלבונים.
- נדרשת גישה לקוראי לוחות רב-מצב (multi-mode plate readers) ותשתית לגילוי BRET כמותי.
- נדרשת סטנדרטיזציה בין צוותים להגדרת הבדיקה, לניתוח הנתונים ולאימות ביטוי החלבון.
- ייתכן שיהיה צורך בהתאמה עבור שורות תאים שונות או איזופורמים של RAF, בהתאם למיקוד המחקר.
- רגישות וספציפיות הבדיקה תלויות בתכנון ה-construct ובבחירת המוטציות, כפי שהודגם בפרוטוקול.
