הדמיית מיקרוסקופ כוח אטומי במהירות גבוהה של הרכבה עצמית של מוטיב כוכב תלת-נקודתי של DNA באמצעות הקשה פוטותרמית מחוץ לתהודה

במעבדה שלנו אנו מפתחים טכנולוגיות מדידה חדשות לביולוגיה בקנה מידה ננומטרי. במיוחד אנו מתמקדים בפיתוח מיקרוסקופ כוח אטומי במהירות גבוהה כדי לחקור תהליכים ביולוגיים דינמיים בקנה מידה ננומטרי. ולשם כך, פיתחנו לאחרונה מצב הדמיה חדש, שאנו מכנים הקשה בתהודה פוטותרמית או PORT.

במצב זה, אנו משתמשים בלייזר כונן ייעודי כדי להפעיל את השלוחים הנשלטים מאוד במהירות גבוהה, מה שמאפשר לנו לקבל את הנתונים ועד שני סדרי גודל מהר יותר מאשר בהקשה קונבנציונלית מחוץ לתהודה. תקן הזהב ב-AFM במהירות גבוהה הוא הדמיית מצב תהודה. במצב זה, השלוחה מופעלת בתדר תהודה זה, מה שאומר שלא ניתן לשלוט במיקום השלוחה, אלא רק במשרעת התנודה שלו.

עבור AFM במהירות רגילה, מצבי תהודה כבויים נפוצים יותר ויותר. עם זאת, תדירות ההפעלה מוגבלת כאן, מה שהופך את מצבי ההדמיה האלה לאיטיים למדי. על ידי שימוש בלייזר משני להפעלת השלוחה נוכל להשיג תדרי הפעלה גבוהים יותר, כלומר מהירויות הדמיה גבוהות יותר.

גישה זו מאפשרת לנו לשמור על היתרונות הקשורים למצבי איוש אחרים מחוץ לתהודה, כלומר אנו יכולים לייעל את האיזון בין רגישות ההדמיה למהירות. אנחנו מוגבלים במהירות ההדמיה על ידי הדיוקן הגבוה ביותר. אם ברצוננו להגדיל את הדיוקן, עלינו להגדיל את עוצמת הלייזר על מנת לשמור על אותה משרעת הפעלה.

זה יכול להוביל לבקרת כוח לקויה ולנזק לדגימה. שיפור רוחב הפס של השלוחים על ידי הקטנת גודלם ועל ידי שיפור יעילות ספיגת הלייזר יאפשר לנו להשיג קצבי יציאה גבוהים יותר תוך הבטחת מרווח דגימה נאות. התקדמות זו תאפשר קצבי הדמיה מהירים יותר החיוניים לבחינת המורכבויות של דינמיקת ההרכבה.

כדי להתחיל, יש לנקות ולהכין את השליחים. התקן שלוחה על מחזיק התואם למיקרוסקופ האלקטרונים הסורק או למערכת SEM. לאחר מכן מחממים את גז המבשר שישמש במערכת הזרקת הגז כדי לגדל את הקצה החדש.

ברגע שהוואקום מגיע מתחת ל-10 בחזקת חמישה מיליבר שליליים, נקה את קו הזרקת הגז 10 פעמים למשך שתי שניות כל אחת כדי להסיר שאריות אוויר מקו הזרבובית. השתמש ב-SEM כדי לאתר את קצה השלוחה. הטה את המחזיק לזווית כדי ליישר את השלוחה בצורה נכונה להדמיית מיקרוסקופ כוח אטומי.

התאם את המיקום והמיקוד של ה-SEM לתצוגה ברורה של קצה השלוחה שבו יגדל קצה ננו הפחמן. לאחר מכן, הגדר את פרמטרי התצהיר בתוכנה כדי להגדיל את הטיפ החדש. התחל את תהליך התצהיר כדי להגדיל את הקצה עם קרינה של קרן האלקטרונים על קצה השלוחה תוך הזרקת גז המבשר והפסק את הזרקת הגז לאחר השלמת התצהיר.

בצע הדמיית SEM לאחר צמיחה כדי להעריך את האיכות והמאפיינים של הקצה החדש שגדל, כולל הרדיוס והאורך שלו. הסר את המחזיק מתא ה- SEM. כדי להתחיל, הכינו מיקרוסקופ כוח אטומי במהירות גבוהה.

השתמש בפינצטה כדי להניח שלוחה קצרה במיוחד מתחת לתפס הקפיץ על מחזיק השלוחה. בעזרת מזרק, הוסף 50 מיקרוליטר נוזל דרך יציאת הגישה השמאלית לנוזל. לאחר מכן השתמש בשלושה כפתורים בראש ה-AFM כדי ליישר את לייזר הקריאה על השלוחה.

שימו לב לצל השלוחה על נייר לבן תוך הגדלת הסכום. לאחר מכן מרכז את נקודת הלייזר על דיודת הצילום באמצעות שני הכפתורים הייעודיים. לאחר מכן, סמן את התיבה המופעלת עירור בעירור VI כדי להפעיל וליישר את לייזר הכונן, להפעיל ולנענע את השלוחה.

הצג את אותות העירור והסטייה של השלוחה על אוסצילוסקופ. השתמש בשיטת הצל ומקסם את משרעת התנודה עם כפתורי כוונון לייזר כונן. כדי לכוונן את משרעת התנודה השלוחה בנמל, הוסף מתח DC למעגל הבקרה של דיודת הלייזר בתיבת התצורה בעירור VI והזן את כניסת ה-AC משיא לשיא עבור מעגל הבקרה של דיודות הלייזר.

כדי להשיג עקומות אינטראקציה, הגדר את בקר Z VI למצב מגע ולחץ על התחל כדי להתקרב למשטח הדגימה. לאחר הגעה למשטח, בצע עקומת כוח מול מרחק ברמפה VI לכיול רגישות לסטיית שלוחה. לחץ על withdraw כדי למשוך את ה-Z piezo מהמשטח שאליו הקצה אינו יכול להגיע.

לאחר נסיגה מלאה, עבור למצב יציאה בבקר Z VI והפעל את לייזר העירור בעירור VI.הגדר את מצב היציאה לתדר הרצוי. עקומות אינטראקציה ברורות הושגו על ידי הפחתת תנודה חופשית מתנודות מגע החיוניות להדמיית דגימה ביולוגית לא הרסנית. בקצב יציאה של 100 קילו-הרץ, הושגה איכות תמונה טובה.

עם זאת, ככל שתדירות העירור התקרבה לתהודה שלוחה, בקרת המשוב התדרדרה, מה שהוביל לעקומות אינטראקציה מטושטשות ולירידה באיכות התמונה. כדי להתחיל, הכינו תמיסה של 10 מילי-מולרית של מגנזיום אצטט. באמצעות מזרק המילטון, הזרקו 50 מיקרוליטר מהתמיסה לתוך התעלה הנוזלית של מחזיק השלוחה, וצרו טיפת נוזל העוטפת את השלוחה.

הגדר את גודל הסריקה בסריקה VI ל-800 על 800 ננומטר ואת קצב הקו ל-100 הרץ. כדי לסרוק את המשטח, לחץ על חץ המסגרת כדי לבדוק את האיכות. לאחר הסריקה, לחץ על נסיגה בבקר Z VI כדי למשוך את השלוחה מהמשטח.

בעזרת מזרק המילטון, הסר את תמיסת החיץ ממחזיק השלוחה. לאחר מכן הכינו תמיסת כוכב תלת-נקודתית של DNA מדולל והזריקו 50 מיקרוליטר מתמיסה זו למחזיק השלוחה. בצע הדמיה עם שטח של 800 על 800 ננומטר בקצב קו ברירת מחדל של 100 הרץ.

לאחר הסריקה הראשונית, התאם את גודל ומהירות ההדמיה וסרוק את VI לערכים שצוינו לרכישת נתונים נוספת שמור על הקלט לנקודת ההגדרה בתיבת נקודת ההגדרה של בקר Z VI ברמה הנמוכה ביותר הדרושה למעקב מדויק לאורך כל תהליך ההדמיה. חזור על פעולה זו עבור כל אזורי הדגימה הנדרשים. באמצעות פרוטוקול זה, ההרכבה בזמן אמת של מוטיבים של כוכב תלת נקודתי DNA לאיים יציבים נצפתה על ידי נמל AFM במהירות גבוהה.

תמונות ברורות התקבלו בקצבי קו של 100 ו-200 הרץ עבור קצב יציאה של 100 קילו-הרץ. עם זאת, מהירויות הדמיה גבוהות יותר מבלי להגדיל את קצבי היציאות הפחיתו את איכות התמונה עקב שינויים מהירים בטופוגרפיה. תוצאות הדמיה של כוכב שלוש נקודות DNA עבור כניסת ה-AC הנמוכה ביותר משיא לשיא הראו מבנים שלמים בעוד שכניסת ה-AC הגבוהה ביותר משיא לשיא גרמה לנזק לדגימה שניתן לצפות בו עקב כוחות גבוהים יותר.

באופן דומה, כניסת היסט ה-DC הנמוכה ביותר חשפה מבנים שלמים בעוד שכניסת היסט ה-DC הגבוהה ביותר גרמה לנזק מבני.