Name: אפיון אפנן קולטנים המופעלים על ידי פרוטאז עם בדיקת ניוד סידן באמצעות קורא צלחות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-24T13:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: למדו פרוטוקול משופר לבדיקת ניוד סידן בתאי אנדותל לזיהוי ליגנדים של קולטני PAR. השיטה מקצרת זמן הניסוי ומשפרת שחזוריות התוצאות בחקר תרופות לדלקת טרומבוטית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>חקר ליגנדות קולטן המופעלות על ידי פרוטאז בתאי אנדותל

<table><tbody><tr><td><ריאגנטים חזקים >תרבית תאים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>דבקים תאי EA.hy926 ATCC</td><td></td><td>CRL-2922</td><td></td></tr><tr><td>CellStripper מגיב דיסוציאציה של תאים</td><td>Corning</td><td>25-056-CI</td><td>ניתן להשתמש באופן אופציונלי, אך בהחלט יש להימנע ממנו עם מבחני PAR2.</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) עם פנול אדום</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>Avantor</td><td>97068-091</td><td></td></tr><tr><td>ג'לטין מעור חזיר</td><td>MilliporeSigma</td><td>G2500</td><td>השתמשו להכנת תמיסה מימית של 0.4% (w/v) עם מים נטולי יונים. חיטוי לפני השימוש לעיקור.</td></tr><tr><td>עט/סטרפטוקוקוס (100X)</td><td>קורנינג</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS)</td><td>קורנינג</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>טריפאן כחול (0.4% משקל/נפח)</td><td>קורנינג</td><td>25-900-CI</td><td></td></tr><tr><td><ריאגנטים לגיוס סידן></חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-(2-הידרוקסיאתיל)-1-פיפרזינאתיאנסולפונית חומצה (HEPES)</td><td>תרמו</td><td>172571000</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין בסרום בקר (BSA)</td><td>Avantor</td><td>97061-420</td><td></td></tr><tr><td>סידן כלוריד דיהידראט</td><td>Thermo</td><td>42352-0250</td><td></td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד</td><td>Thermo</td><td>J66650-AD</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4/AM</td><td>Invitrogen</td><td>F14201</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת המלח המאוזנת של האנק (ללא Ca/Mg/פנול-אדום)</td><td>קורנינג</td><td>21-022-CV</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד הקסהידראט</td><td>MilliporeSigma</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>פלורוני F-127 (פולוקסמר 407)</td><td>ספקטרום כימי</td><td>P1166</td><td></td></tr><tr><td>Probenecid</td><td>TCI America</td><td>P1975</td><td></td></tr><tr><td>נתרן הידרוקסיד</td><td>VWR International</td><td>BDH9292</td><td></td></tr><tr><td>TFLLRN-NH2 (מלח TFA)</td><td></td><td></td> <td>הוכן על ידי טרודי הוליסט ב-Versiti Blood מכון מחקר</td></tr><tr><td><חזק>חומרים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-מטופלים היטב בתרבית, קירות שחורים, צלחת בדיקה תחתונה שקופה</td><td>קורנינג</td><td>3603</td><td>עם מכסים שקופים</td></tr><tr><td>צינור צנטריפוגה, 15 מ"ל</td><td>Avantor</td><td>89039-664</td><td></td></tr><tr><td>צינור צנטריפוגה, 50 מ"ל</td><td>Avantor</td><td>89039-656</td><td></td></tr><tr><td>בקבוק תרבות, T-75</td><td>קורנינג</td><td>353136</td> מאגר ריאגנטים חד פעמי <td>שטופל בתרבית רקמות</td></tr><tr><td>, 50 מ"ל</td><td>קורנינג</td><td>RES-V-50-S</td><td></td></tr><tr><td>קורא צלחות Enspire</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>צינור מיקרוצנטריפוגה שהופסק, 1.5 מ"ל</td><td>Avantor</td><td>20170-038</td><td></td></tr><tr><td>פיפטה פסטר, 9 אינץ'</td> <td>פישר</td><td>13-678-6B</td><td>חייב להיות מעוקר</td></tr><tr><td>רצועת צינור PCR עם שטוח נפרד רצועות כובע</td><td>Avantor</td><td>76318-802</td><td></td></tr><tr><td>קצות פיפטה, 20 ומיקרו; L</td><td>Biotix</td><td>63300042</td><td>סטרילי, קצוות מסוננים</td></tr><tr><td>קצות פיפטה, 200 ומיקרו; L</td><td>Biotix</td><td>63300044</td><td>סטריליים, קצוות מסוננים</td></tr><tr><td>קצות פיפטה, 1250 ומיקרו; L</td><td>Biotix</td><td>63300047</td><td>סטריליים ומסוננים טיפים</td></tr><tr><td>פריזמה</td><td>GraphPad</td><td></td><td>כרך 6 משומש</td></tr><tr><td>פיפטה סרולוגית, 5 מ"ל</td><td>Tradewinds Direct</td><td>&nbsp; 07-5005</td><td></td></tr><tr><td>פיפטה סרולוגית, 10 מ"ל</td><td>Tradewinds Direct</td><td>&nbsp; 07-5010</td><td></td></tr><tr><td>פיפטה סרולוגית, 25 מ"ל</td><td>Tradewinds Direct</td><td>&nbsp; 07-5025</td><td></td></tr></tbody></table>

אפיון אפנן קולטנים המופעלים על ידי פרוטאז עם בדיקת ניוד סידן באמצעות קורא צלחות

Characterizing Modulators of Protease-Activated Receptors with a Calcium Mobilization Assay Using a Plate Reader

מטרת בדיקה זו היא בדרך כלל לייצר עקומות ריכוז-תגובה (CRC) עבור שלושה עד ארבעה פרמודולינים חדשים. על כל צלחת בדיקה, CRC נוסף עבור תרכובת ידועה, כגון NRD-21, נוצר לעתים קרובות המשמש כבדיקת איכות עבור הניסוי בשל IC50 הידוע שלה. כדי ליצור CRCs, יש לתכנן מפת לוחות כמו זו המתוארת בטבלה 1 . אם רוצים במקום זאת תגובות ריכוז חד-נקודתיות, יש להוסיף תרכובות בריכוזים סופיים של 10 מיקרומטר (או ריכוזים מועדפים אחרים) לשלוש בארות לפחות.
בעת ביצוע הבדיקה, אמורה להיות עלייה מהירה בפלואורסצנטיות (העלייה צריכה להתחיל בתוך 3-4 הסריקות הראשונות) המוצגת על-ידי קורא הלוחות (ראו איור 2A לדוגמה פלט בהשוואה לפלט הכושל באיור 2B). חשוב לציין כי יש להוסיף את האגוניסט במהירות (תוך 15 שניות) כדי שקורא הלוחות יוכל ללכוד במדויק את העלייה בפלואורסצנטיות. בניסוי עבודה, אות הפלואורסצנטיות לבאר הרכב צריך להישאר שטוח, בעוד שהאות הפלואורסצנטי בבארות הבקרה החיוביות (רכב + 6.5 מיקרומטר TFLLRN-NH2) אמור להתחיל לעלות לאחר שלוש או ארבע סריקות. ברגע שמגיעים לערך המרבי (לאחר ~10 סריקות), האות הפלואורסצנטי אמור להתחיל לרדת לאט. בניסויים עם אנטגוניסטים יעילים מאוד, הבארות עם הריכוזים הגבוהים ביותר של אנטגוניסט צריכות להיות בעלות אות שנשאר שטוח יחסית, בדומה לבקרה השלילית. כמו כן, אמור להיות הבדל קטן בין האות של בארות הבקרה החיוביות לבין אלה עם ריכוזים נמוכים של האנטגוניסט (איור 2C). אם הריכוזים הנמוכים ביותר של אנטגוניסט עדיין מעכבים את ניוד הסידן, יש להתאים את הריכוזים המוקרנים כך שיכללו ריכוזים נמוכים יותר. CRCs שנוצרו צריכים להיות לפחות נקודת נתונים אחת ~ 100% כדי להראות באופן מלא את האופי הסיגמואידלי של העקומה.
הסימן הנפוץ ביותר לכך שניסוי לא עבד הוא אם באר הבקרה החיובית (רכב + 6.5 מיקרומטר TFLLRN-NH2) אינה מראה עלייה גדולה בפלואורסצנטיות (איור 2B). זה יכול לקרות ממגוון סיבות: ספירת התאים יכולה להיות נמוכה (אם המפגש לא אושר), הפתרון האגוניסטי עלול להיפגע, או כמויות לא מספיקות של צבע יכול היה להיקלט על ידי התאים. אפשר גם בטעות לא להוסיף אגוניסט לבארות מסוימות.
בשיטה מתוכנתת, הנתונים מופקים כשישה גיליונות אלקטרוניים נפרדים, שכל אחד מהם מכיל נתונים עבור שתי עמודות. חמש הסריקות של הפלואורסצנטיות הבסיסית נמצאות בשורה משלהן, כאשר 20 הסריקות נלקחו לאחר הוספת אגוניסט בשורה שמיד למטה (ראו איור 3 לפלט מייצג). לצורך חישוב לדוגמה, ייעשה שימוש בעמודה מניסוי באמצעות NRD-21. בקובץ המיוצא (איור 3), הפלואורסצנטיות הבסיסית מכל באר מופקת לעמודות C עד G, ונתונים לאחר חיבור האגוניסט (20 הסריקות הבאות) מופקים לעמודות C עד V בשורה הבאה. שורות 14-17 בקובץ מכילות את הבקרה החיובית של שתי עמודות נפרדות. הממוצע של שורת הבסיס עבור אחת מבארות הבקרה החיוביות חושב באמצעות הפקודה "=AVERAGE(C16:G16)", שנתנה ערך של 1,039.8. פקודה זו חזרה על עצמה עבור מדידות הבסיס הנוספות בכל באר. מקסימום סריקות הניסוי חושב באמצעות הפקודה "=MAX(C16:V16)", שנתנה ערך של 2,629. שוב, הפקודה חזרה על עצמה עבור כל הבארות. הפלואורסצנטיות הבסיסית עבור כל באר הופחתה לאחר מכן מהערך המרבי. בניסוי זה, הנתונים נורמלו על ידי הפחתת השינוי בפלואורסצנטיות בבקרה השלילית מכל באר (שהיה 142.6 בטור לדוגמה). ערכים אלה חולקו לאחר מכן בערך המחושב באופן דומה של הבקרה החיובית. בעמודה זו, הערך המרבי היה 2,629, המדידה הבסיסית הממוצעת הייתה 1,039.8, והערך שהופחת עבור החסר היה 142.6. ערך הבקרה החיובית המתואם הוא אפוא 1,446.6 (מחושב מתוך המשוואה). משוואה זו חוזרת על עצמה עבור כל באר בעמודה, והערכים המחושבים מחולקים ב- 1,446.6 כדי לתת את השינוי היחסי שלהם בפלואורסצנטיות. היחסים הומרו לאחוזים והועתקו לתוכנה האנליטית. תהליך זה חזר על עצמו עבור 11 העמודות האחרות.
כדי לעבד את הנתונים באמצעות התוכנה שאליה מתבצעת הפניה, יש לבחור טבלת XY עם אפשרות לבצע שלוש מדידות חוזרות בעמודות זו לצד זו. יש להזין את ערכי -log של כל ריכוז לערכי x, ואת האחוזים המחושבים להוסיף לערכי y. יש לבצע ניתוח רגרסיה לא ליניארית על הנתונים, מה שגורם ליצירת ארבע עקומות ריכוז-תגובה. התוכנית גם מפיקה ערכי IC50 , סטטיסטיקות שגיאות מכומתות וסטטיסטיקות התאמה טובות.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66507/66507fig01.jpg"> איור 1: Fluo-4/AM נטען לתוך תאי EA.hy926. Fluo-4 נטען באופן סלקטיבי לתוך תאי EA.hy926, לאחר דגירה של צבע ושלבי שטיפה. כל הפלואורסצנטיות נמצאת בתוך התאים, ללא דליפת צבע. התמונה התקבלה באמצעות הגדרת GTP במצלמת תא EVOS והגדלה של פי 20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66507/66507fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66507/66507fig02.jpg"> איור 2: תפוקה פוטנציאלית של בדיקה. (A) פלט קורא לוחיות מייצג של ניסוי עובד. שורה A היא הבקרה השלילית ואין בה שינוי בפלואורסצנטיות. שורה B היא הבקרה החיובית ומראה עלייה מהירה בפלואורסצנציה. שורות C-H הן בארות הניסוי, כאשר הריכוזים הגבוהים יותר של פרמודולין נמוכים יותר בצלחת. (B) פלט לדוגמה של ניסוי כושל. לא נראית עלייה בפלואורסצנטיות בשורה B, שהיא הבקרה החיובית. (C) שינוי פלואורסצנטי לאורך זמן המושרה על ידי אגוניסט PAR1 TFLLRN-NH2. סריקת שתי עמודות של צלחת 96 בארות באמצעות ההגדרות שסופקו אורכת ~ 5 דקות בקורא לוחות PerkinElmer EnSpire (כלומר, ~ 15 שניות בין סריקות של כל באר). פתרונות NRD-21 שונים הם כפי שצוין, "אגוניסט" הוא 6.5 מיקרומטר tfllrn-nh2, n = 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66507/66507fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66507/66507fig03.jpg"> איור 3: פלט Excel לדוגמה עבור בדיקת עבודה. פלואורסצנטיות בסיסית מופקת לשורות זוגיות, החל משורה 10, והתוצאה מ-10 הסריקות הראשונות לאחר חיבור אגוניסט מוצגת בשורות אי-זוגיות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66507/66507fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66507/66507fig04.jpg"> איור 4: טיפול רובוטי בנוזלים לעומת "הבהוב". ציפוי מקדים של לוחות הבדיקה בג'לטין וביצוע ידני של חילופי מדיה על ידי הזזת הצלחת וייבוש שלה מייצר עקומות ריכוז-תגובה עם שונות נמוכה יותר. (A) עקומות ריכוז-תגובה של פרמודולינים ML161 ו-NRD-21 ו-5 מיקרומטר TFLLRN-NH2, n = 3 (טיפול אוטומטי בנוזלים). (B) עקומות ריכוז-תגובה של פרמודולינים ML161 ו-NRD-21 ו-5 מיקרומטר TFLLRN-NH2, n = 3 (לוחות מצופים ג'לטין, מצופים). הנתונים הם אמצעים ± SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66507/66507fig04large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66507/66507fig05.jpg"> איור 5: מחקרי טמפרטורה. ביצוע הבדיקה ב 37 ° C מייצר נתונים לשחזור יותר מאשר בטמפרטורת החדר. (A) עקומות ריכוז-תגובה של ML161 ו-5 מיקרומטר TFLLRN-NH2, n = 3 (טמפרטורת החדר). (B) עקומות ריכוז-תגובה של ML161 ו-5 מיקרומטר TFLLRN-NH2, n = 3 (37°C). הנתונים הם אמצעים ± SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66507/66507fig05large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66507/66507fig06.jpg"> איור 6: מחקרי צפיפות תאים. צפיפות התאים האופטימלית היא 60,000 תאים לבאר בעת זריעה 16-24 שעות לפני תחילת הבדיקה. (A) עקומות ריכוז-תגובה של TFLLRN-NH2 בצפיפויות תאים שונות, n = 3. (B) עקומת ריכוז-תגובה של TFLLRN-NH2 בצפיפות תאים אופטימלית של 60,000 תאים/באר. הנתונים הם אמצעים ± SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66507/66507fig06large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66507/66507fig07.jpg"> איור 7: נפח המבחן. שימוש בנפח בדיקה של 100 μL יוצר יותר עקומות ריכוז-תגובה הניתנות לשחזור מאשר בדיקות המשתמשות בנפח סופי של 200 μL. (A) עקומות ריכוז-תגובה של ML161 ו- 5 μM TFLLRN-NH2, n = 3 (נפח סופי של 200 μL). (B) עקומות ריכוז-תגובה של ML161 ו-5 מיקרומטר TFLLRN-NH2, n = 3 (נפח סופי של 100 מיקרוליטר). הנתונים הם אמצעים ± SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66507/66507fig07large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66507/66507fig08.jpg"> איור 8: יצירת גורמי Z כדי לקבוע את היכולת של הבדיקה לזהות תרכובת פגיעה. תגובות ניוד סידן עם 6.5 מיקרומטר TFLLRN-NH2 (עמודה B) בתוספת אנטגוניסטים אופציונליים PAR1 10 מיקרומטר NRD-21 (עמודה C) או 0.316 מיקרומטר vorapaxar (עמודה D). (A) הבדיקה הושלמה 16 שעות לאחר זריעת התא. (B) הבדיקה הושלמה 24 שעות לאחר זריעת התא. (C) טבלת גורמי Z המחושבים באמצעות המשוואה הבאה: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66507/66507eq01v5.jpg" style="margin: auto;">, כאשר σp היא סטיית התקן של הבקרה החיובית, σn היא סטיית התקן של הבקרה או המדגם השליליים, μp הוא הממוצע של הבקרה החיובית, ו- μn הוא הממוצע של הבקרה או המדגם השליליים. כל ערך מחושב על ידי ייעוד רכב + 6.5 מיקרומטר TFLLRN-NH2 כבקרה החיובית והשוואה למצב המצוין כבקרה שלילית (רכב) או מדגם (NRD-21 ו- vorapaxar). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66507/66507fig08large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66507/66507fig09.jpg"> איור 9: ניוד סידן מאגוניסט PAR2. שינוי פלואורסצנטי לאורך זמן המושרה על ידי 10 מיקרומטר SLIGKV-NH2, n = 4. הנתונים הם אמצעים ± SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66507/66507fig09large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
טבלה 1: מפת לוחות 96 בארות לדוגמה להקרנה מורכבת. כל ריכוז נמדד בשלשה. שורה A מכילה פקדים שליליים (ללא אנטגוניסט; ללא אגוניסט), ושורה B מכילה פקדים חיוביים (ללא אנטגוניסט; אגוניסט). עמודות 1 עד 3 מכילות שישה ריכוזי חצי יומן של הפרמודולין NRD-21 שניתן להשתמש בהם באופן אופציונלי לבקרת איכות. PM-A, PM-B, PM-C הם פרמודולינים ללא שם. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66507/66507_Table%201.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>
טבלה 2: השוואה בין פרוטוקול שפורסם בעבר לבין פרוטוקול חדש וממוטב. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66507/66507_Table%202.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>

Changes in calcium concentration in cells are rapidly monitored in a high-throughput fashion with the use of intracellular, fluorescent, calcium-binding ...

characterizing-modulators-protease-activated-receptors-with-calcium

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

Assay הגיוס שתואר כאן הקרינה מבוססת סידן הוא מערכת הקרנת פרמקולוגיה ההפוכה בינוני תפוקה לזיהוי ליגנד תפקודי הפעלה (ים) של קולטני G-חלבון בשילוב יתום (GPCRs).

אפיון של רצפטורים מצמידים גרמו חלבון על ידי Assay גיוס סיד הקרינה מבוססת

וזמינותו הסלולר המתוארת נועד לצורך זיהוי הקולטן כימוקין CXC 4 (CXCR4)-סוכנים שמעצבת לעכב או לגרות, תחרותי או allosterically, תאיים Ca2 + שחרור שיזם CXCR4 הפעלה.

קינטי מבוסס על-ידי קרינה פלואורסצנטית Ca2 + גיוס Assay לזהות את G-חלבון בשילוב קולטן אגוניסטים היריבים, מאפננים Allosteric

אנו מציגים פפטיד fluorogenic assay המחשוף המאפשר הקרנה מהירה הפעילות הפרוטאוליטי של פרוטאזות על פפטידים המייצגים האתר המחשוף של פפטידים פיוז'ן ויראלי. שיטה זו יכולה לשמש גם על כל מוטיב חומצת אמינו אחרות בתוך רצף חלבונים כדי לבדוק את הפעילות פרוטאז.

Fluorogenic פפטיד Assay המחשוף, למסך לפעילות הפרוטאוליטי: יישומים עבור הקורונה ספייק הפעלת חלבון

טכניקות ליצירת ספרייה של פפטידים קצרים שיכולים להפעיל תאי פיסט באמצעות קולטן MRGPRX2 מתוארים. טכניקות הקשורות הן קלות, זולות, וניתן להרחיבן לקולטני תאים אחרים.

הקרנת פפטידים המפעילים MRGPRX2 באמצעות תאי HEK מהונדסים

בעבודה זו מתוארת בדיקה פלואורסצנטית של סידן תוך-תאי בעל תפוקה גבוהה עבור צלחות של 384 בארות לסינון ספריות מולקולות קטנות על קולטנים מצומדים לחלבון G רקומביננטי (GPCRs). המטרה, קולטן קינין מקרציית קדחת הבקר, Rhipicephalus microplus, מתבטאת בתאי CHO-K1. בדיקה זו מזהה אגוניסטים ואנטגוניסטים המשתמשים באותם תאים במבחן "תוספת כפולה" אחת.

בדיקת סידן פלואורסצנטית "דו-תוספת" לבדיקת תפוקה גבוהה של קולטנים מצומדים לחלבון G רקומביננטי

אנו מדווחים ומדגימים בדיקת קשירת ניטרוצלולוז אופטימלית שניתן להשתמש בה כדי לכמת זרחון עצמי של היסטידין קינאזות חיידקיות מטוהרות. לשיטה שלנו מספר יתרונות על פני טכניקות מסורתיות מבוססות SDS-PAGE, המספקות אלטרנטיבה חשובה לאפיון חלבונים חשובים אלה.

כימות של חיידקי היסטידין קינאז autophosphorylation באמצעות Assay כריכה Nitrocellulose

כאן, אנו מציגים הידרוליזה יעיל והגנה Fmoc הבאות של חומצת אמינו מבודדת מתסביך Ni-שיף-בסיס. תנאים הידרוליזה שהוצגו כאן מתאימים לשימוש כאשר השמירה של קבוצות הגנה חומצה-רָפִיף בצד שרשרת נדרשת. טכניקה זו עשויה להיות להתאמה למגוון של מצעי חומצות אמינו לא טבעיים.

הידרוליזה של תנאי Ni-שיף-Base מורכבים באמצעות מתאים שמירת חומצה-רָפִיף קבוצות הגנה

כאן, אנו מציגים שני פרוטוקולים עבור המידה של Ca2 + זרם מיטוכונדריאלי המיטוכונדריה מבודד, תאים בתרבית. עבור המיטוכונדריה מבודד, אנחנו פירוט של צלחת המבוסס על הקורא Ca2 + ייבוא assay באמצעות של Ca2 + רגיש לצבוע סידן ירוק-5N. עבור תאים בתרבית, אנו מתארים שיטה מיקרוסקופיה קונפוקלית באמצעות Ca2 + לצבוע רוד-2/AM.

ניתוחים של סידן מיטוכונדריאלי זרם המיטוכונדריה מבודד, תאים בתרבית

כאן נתאר פרוטוקול לחקור את prenylation ואת guanosine-5'-טריפוספט (GTP)-טעינה של GTPase רו. פרוטוקול זה מורכב משתי שיטות מפורט, כלומר assay ממברנה fractionation ו- immunosorbent של GTPase-מקושרים. הפרוטוקול יכול לשמש כדי למדוד את prenylation ואת GTP העמסת שונים GTPases קטנים אחרים.

זיהוי של GTPase Prenylation קטן ו GTP איגוד באמצעות ממברנה Fractionation ו GTPase-מקושרים Immunosorbent Assay

שיטה זו מספקת דרך לזוג אלקטרואופטיקה וחיישני סידן מקודד גנטית לתמונה בסיסית ציטוסולג רמות סידן ושינויים בארעיות הסידן מעורר בשרירי הגוף של האורגניזם מודל ג. אלגיה.

בשנת הדמיה Vivo סידן בג. אלגיה שרירי הגוף

למדו פרוטוקול משופר לבדיקת ניוד סידן בתאי אנדותל לזיהוי ליגנדים של קולטני PAR. השיטה מקצרת זמן הניסוי ומשפרת שחזוריות התוצאות בחקר תרופות לדלקת טרומבוטית.

אפיון אפנן קולטנים המופעלים על ידי פרוטאז עם בדיקת ניוד סידן באמצעות קורא צלחות

גלה סרטונים נוספים