Name: ייצור, תחזוקה וזיהוי של מודלים של דגי זברה נטולי חיידקים מזחלים ועד שלבים צעירים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-12T13:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 38 s
Description: למד לייצר ולתחזק דגי זברה נטולי חיידקים מזחלים ועד שלבים צעירים לחקר אינטראקציות מארח-מיקרוביום. שיטה זו מאפשרת לחקור את השפעת החיידקים על התפתחות וחסינות ב-Danio rerio.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים בכנות לתמיכה של פרויקט הכישרונות של האוניברסיטה הרפואית של צ'ונגצ'ינג (מס 'R4014 ל- DSP ו- R4020 ל- PPJ), הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (NSFC, מס '32200386 ל- PPJ), סטודיו מנטור חדשנות פוסט-דוקטורט בצ'ונגצ'ינג (X7928 DSP), ותוכנית המרכז המשותף סין-סרי לנקה למחקר והדגמה של טכנולוגיית מים על ידי האקדמיה הסינית למדעים (CAS) / המרכז המשותף סין-סרי לנקה לחינוך ומחקר על ידי CAS.

אופטימיזציה של מודלים של דגי זברה GF: ייצור, תחזוקה ומחקרים מיקרוביאליים

הפרוטוקול של GF Artemia הוענק כפטנט על ידי מנהל הקניין הרוחני הלאומי של סין, אשר יקל על השימוש המוגבל בשיטה לאחר קבלת אישור המחברים. המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים מתחרים או כלכליים אחרים.

צעדים קריטיים במסגרת הפרוטוקולים של דגי GF והכנת מזון GF במהלך יצירת מודלים של דגי GF היו מעורבים מספר שלבים קריטיים, כולל הכנת חומרים סטריליים, עיקור עוברים, חידוש יומי של GZM, איסוף דגימות שונות ובדיקה סטרילית של כל דגימה במספר שיטות. בין השלבים הללו, הטיפול הראשוני בעוברים הוא בסיסי ומכריע להצלחת מודלים של GF. בקרת הסוכנים, ריכוזיהם וזמני הטיפול חיוניים להשגת שיעורי עיקור אופטימליים והצלחת בקיעה. תשומת לב קפדנית נחוצה בעת טיפול בעוברי דגי GF לזחלים, הכרוכה בשינויים בינוניים יומיומיים ומבטיחה כי חומרים ופלטפורמות מעוקרים ביסודיות באמצעות אור אולטרה סגול או autoclaving בעת הסרת לוחות מן האינקובטור. ניטור תנאי הטמפרטורה וזמן ההפעלה במהלך החורף חיוני למניעת מוות של זחלים הנגרם כתוצאה מטמפרטורות נמוכות יותר בספסלים נקיים.
חלמון ביצה סטרילי וארטמיה GF צריכים לעבור גילוי לפני שהם מוזנים לדגים לאחר 7 dpf כדי להבטיח את מצבם הסטרילי עבור מודלים GF לטווח ארוך. במהלך תקופת ההאכלה, ניקוי שאריות המזון חשוב כחלק מהדגימות הנאספות לגילוי בעת חידוש מצע הפסולת. המיכל, נפח ה-GZM ומסת המזון צריכים להיות מותאמים יחד עם שלבי הגידול וההתפתחות כדי למנוע אובדן דגי GF עקב סביבה מוגבלת ובעיות באיכות המים. ניטור שוטף והתאמות בפרמטרים אלה תורמים לתחזוקה מוצלחת של דגמי דגי GF.
שינויים ומשמעות של פרוטוקולים אלה התהליך הפשוט בן שלושת השלבים ליצירת עוברים של דגי זברה GF, הכולל חומרים אופטימליים, ריכוזים וזמני חשיפה של פתרונות AB-GZM, PVP-I ו- NaClO, מבטיח קצב סטרילי גבוה ופיתוח בריא של מודלים. בנוסף, שיטות הזיהוי הסטריליות של דגימות יומיות שוכללו צלחות ותרביות בינוניות נוזליות בתנאים אירוביים ואנאירוביים, יחד עם טכניקות מולקולריות המשתמשות בפריימרים חיידקיים נפוצים. התנסויות נוספות בבדיקות מזהמים חיידקיים ופטריות נועדו לייעל מזהמים איזולטורים ובדיקות סטריליות במהלך טכניקות GF בבעלי חיים48.
הפרוטוקול הספציפי של GF Artemia nauplii כמזון חי למודלים של דגים נחקר במחקר שלנו, ופטנט הוענק ל- PPJ ו- DSP על ידי מנהל הקניין הרוחני הלאומי של סין (No. ZL202210482684.8). מודלים ארוכי טווח של דגי GF מוגבלים באופן עקבי על ידי תזונה לקויה ולא מתאימה, מה שמחמיר חולשות בתפקודי המעי הקשורות לעיכול וספיגה. כמקור מזון אמין למודלים של דגי מדאקה ודגי זברה בשלבי חיים שונים, GF Artemia sp. צריך להיות קל להכנה בהליך פשוט, זמן דגירה קצר וזיהוי סטרילי בזמן אמת לשימוש יומיומי. בשיטה זו, ציסטות ארטמיה נורמליות נשטפות בריכוז מספיק של NaClO כדי להיות אספטיות ולאחר מכן מודגרות בבקבוק מצופה סרט, כמו גם על צלחת ובמדיום נוזלי לזיהוי. זה תומך בנאופלי בקיעה טרייה להאכלת דגי GF. קצב הסטריליות וקצב הבקיעה של ארטמיה, כמו גם אורך הגוף, המשקל והפעילות של, מצוינים, מה שמעיד על יישומים זמינים בפועל.
המשמעות של שינויים אלה בדגי GF ובפרוטוקולי מזון GF מועילה לחוקרים ביצירת מודלים בעוברים, זחלים, שלבי נעורים, ואפילו שלבים מוקדמים של בוגרים ובוגרים במצבים ימיים ומים מתוקים. בעלי חיים ארוכי טווח של GF יספקו אישור כמו מודלים in vivo במחקר על סינון תרופות ותפקודים מיקרוביאליים במהלך גדילה והתפתחות הפונדקאי, במיוחד בבשלות של חסינות ושורות תאי מעיים קשורות. לדוגמה, לזחלי דגי זברה יש חסינות מולדת רק בשבוע הראשון, ואז מפתחים את מערכת החיסון הנרכשת במהלך 7-21 dpf, יחד עם בגרות בלוטת התימוס31,49. יתר על כן, מודלים של דגי GF יכולים לספק את האפשרות לנתח אינטראקציות חיידקים-חיידקים ומיקרוביוטה-מארח עם תצפית חיה של תהליכי התיישבות ונדידה דינמיים באורגניזמים50,51.
מגבלות השיטה גידול דגי GF מצעירים למבוגרים מוקדמים (28 dpf-2.5 mpf) ובוגרים מינית (>2.5 mpf) נותר מאתגר בשל תמותה מוגברת והסיכון לזיהום חיידקי במהלך תחזוקת המודל. מגבלות אלה נובעות בעיקר מהיעדר מערכות אוטוקולטורה מתאימות לדגים החיים בסביבת GF. מערכות אלה צריכות לכלול אוויר נקי, מים ומערכת מזון כדי לשמור ביעילות על בעלי החיים וסביבתם, ולהבטיח בידוד מוחלט ממיקרואורגניזמים חיצוניים. שלא כמו מודלים אחרים של חיות GF כגון עכברים ותרנגולות52, השגת דגי זברה GF באמצעות פעולות אנטומיות מהורי CR היא מאתגרת בשל הרגלי המים שלהם וסגנון ההפריה הטבעי שלהם.
גם ההתייחסות לבעלי חיים בוגרים כנטולי מיקרוביוטה של המעי היא מאתגרת. בעוד שטיפול אנטיביוטי עשוי לגרום למצב דומה לבעלי חיים ספציפיים נטולי פתוגן (SPF), המאופיין במיקרוביוטה מופחתת שזוהתה בדגימות צואה, השגת מודלים אמיתיים של דגים בוגרים GF נותרה קשה. האתגרים הכרוכים בהקמה ובתחזוקה של מודלים של GF, במיוחד במהלך המעבר ממצב צעיר למצב ארוך טווח, הם משמעותיים. החשיבות של צאצאי GF, כגון ביצי GF F1 או F2 מדגי GF בוגרים, במחקר מיקרוביאלי מוכרת. עם זאת, התגברות על אתגרים בהקמה ותחזוקה של מודלים ארוכי טווח של דגי GF בוגרים דורשת זמן רב.
ראוי לציין כי דגי זברה גנוטוביוטיים עם התיישבות חיידקים ספציפית פותחו, ומראים הישרדות כרונית בהתבסס על מודלים של GF. עם זאת, עדיין לא בטוח אם מודלים אלה יכולים לשמש חלופות בנות קיימא למודלים של GF בזיהום חיידקי ובמחקר ביו-רפואי.
יישומים עתידיים של מודלים של דגי GF במחקר זה, שכללנו את הפרוטוקול ליצירת מודלים של דגי זברה GF, המתקדמים מעוברים לצעירים. התקדמות זו טומנת בחובה יישומים משמעותיים בביולוגיה התפתחותית, אימונולוגיה, חקר מחלות אנושיות ואורגנוגנזה. באמצעות בידוד וזיהוי מסה, המחקר בוחן את הפונקציות, המנגנונים והמטבוליטים שמקורם במעיים של זני חיידקים בודדים. החקירה כוללת הדבקת מודלים של דגי זברה GF לאחר שהנביעה פותחת את שלב47,53. בנוסף, חיידקים מסומנים עם פלואורסצנטיות מאפשרים תצפית על התיישבות והפצה בזחלי GF חיים, ללא השפעות מיקרוביאליות אחרות54. מודלים דומים של דגי GF, כגון מדאקה ימית או מים מתוקים, יכולים להיווצר בשיטות דומות עם סוכנים שונים או שינויים בינוניים.
כדי לחקור מנגנוני מחלה אנושיים, המחקר משתמש בשיטות FMT, העברת דגימות מחולים או תורמים לבעלי חיים בריאים או מודלים GF55. שלא כמו בעלי חיים שגודלו באופן קונבנציונלי (CR), מודלים של GF מציעים ראיות חזקות לתפקודים, השפעות או תגובות מיקרוביאליות בפונדקאי, במיוחד בשילוב עם בקטריופאג'ים כדי לווסת חיידקי מטרה במיקרוביוטה46.
לסיכום, דגי זברה GF משמשים כמודלים רבי עוצמה להערכת בטיחות חיידקים, יעילות תרופות, רעילות מזהמים או הפרעות מורכבות, בשל סביבת המעי הרגישה והטהורה שלהם. מחקר עתידי של יישומי דגי GF צריך להקיף תחומים שונים, עם צורך ליצור מודלים של דגי GF בוגרים להבנה עמוקה יותר של תפקודים מיקרוביאליים על פני שלבי חיים שונים.

המיקרוביוטה (כלומר, ארכאה, חיידקים, אאוקריה ווירוסים) ממלאת תפקיד מכריע בשמירה על בריאות המאכסן ותורמת להתפתחות מחלות שונות על ידי השפעה על תהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים באמצעות אינטראקציות סימביוטיות בתוך מחסום המעי, פני השטח של האפיתל ותפקודי מוצין אצל אנשים 1,2,3. הרכב המיקרוביוטה בשלבי חיים שונים, מינקות ועד יובלה, בגרות והזדקנות, כמו גם נוכחותה במקומות שונים כגון אתרי נארס, פה, עור ומעיים, מעוצבים באופן דינמי על ידי סביבות ובתי גידול מגוונים4. מיקרוביוטת המעי באורגניזמים מעורבת בספיגת חומרי מזון, תגובה חיסונית, פלישת פתוגנים, ויסות מטבולי וכו'5,6. מחקרים על מטופלים הראו כי שיבושים במיקרוביוטה של המעי קשורים להשמנת יתר אנושית, הפרעות שינה, דיכאון, מחלות מעי דלקתיות (IBD), מחלות נוירודגנרטיביות (פרקינסון, אלצהיימר), הזדקנות וסוגי סרטן שונים 7,8,9. יתר על כן, מסלולים אינטראקטיביים בין מיקרוביוטת המעי לפונדקאים כוללים גורמים דלקתיים, מוליכים עצביים, מטבוליטים, מחסום מעיים ועקה חמצונית, כפי שנצפה במחקרים קודמים באמצעות מודלים של עכברים ודגים 10,11.
לאחרונה, גישות או טיפולים רבים הקשורים לחיידקים, כולל פרוביוטיקה פוטנציאלית והשתלת מיקרוביוטה בצואה (FMT), נחקרו עבור הפרעות אלה במודלים קליניים ובבעלי חיים. מחקרים אלה מבוססים על תגליות הקשורות לציר המיקרוביוטה-מעי-מוח/כבד/כליות, תוצרים שמקורם במיקרוביוטה ופעילות קולטנים משתנה12,13. עם זאת, הפיתוח, התפקודים והמנגנונים השונים של מערכת המיקרוביוטה-פונדקאי עדיין אינם מובנים ומזוהים לחלוטין בשל המורכבות של קהילת החיידקים והאתגר של יצירת מודלים חזקים של מחלות דמויות אדם.
כדי להתמודד עם בעיות אלה, מודלים של בעלי חיים נטולי חיידקים (GF) הוצעו בדחיפותבאמצע המאה ה-19 ופותחו בעיקר במהלך המאהה-20. שכלולים מאוחרים יותר, כולל מודלים גנוטוביוטיים וטיפולים אנטיביוטיים, יחד עם התקדמות בטכנולוגיות זיהוי ותצפית מיקרוביאליות, שכללו עוד יותר את המודלים האלה 14,15,16. חיות GF, שנוצרו על ידי מחיקת הרקע שלהן והימנעות ממיקרובים סביבתיים, מציעות אסטרטגיה מצוינת לחקר יחסי הגומלין בין מיקרואורגניזמים למארחים שלהם17. באמצעות יישום מודלים של בעלי חיים ופרוטוקולים מעודנים, חוקרים הצליחו לשחזר הרכבים מיקרוביאליים דומים שנמצאו בחולים בעכברי GF ובדגים. בנוסף, מודלים אחרים של חיות GF, כגון כלבים, תרנגולות וחזירים, מספקים אפשרויות מגוונות כמושאי מחקר 18,19,20,21. גישה זו אפשרה לחקור את ההשפעות הטיפוליות האפשריות של מיקרוביום קומנסלי על מחלות שונות, כולל אימונותרפיה לסרטן בבני אדם 16,18. מודלים של GF מציעים תובנות מדויקות יותר לגבי המאפיינים והמנגנונים של התיישבות חיידקים ספציפיים, נדידה, כפל ואינטראקציה בתוך פונדקאים. זה מספק תובנות חדשות חיוניות על התרחשות ופיתוח של מחלות הקשורות למיקרוביוטה22,23. ההיסטוריה של הקמה ויישום של דגי זברה GF במחקר מיקרוביאלי התפתחה מהדוחות של Rawls et al. בשנת 2004 ו- Bates et al. בשנת 2006 לפרוטוקול של Melancon et al. בשנת 2017 16,24,25. עם זאת, ההיתכנות של מודלים GF בוגרים או רבייה היא עדיין תהליך ממושך, מלווה בתוחלת חיים משתנה, שיעורי הצלחה ואתגרים בריאותיים.
בין מודלים שונים של בעלי חיים, דג זברה (Danio rerio) בולט ככלי קריטי למחקר בסיסי וביו-רפואי כאחד בשל הדמיון המועיל שלו לאיברים אנושיים ולגנומיקה, מחזור התפתחות קצר, פריון גבוה ועוברים שקופים19,26. דגי זברה, המשמשים כמודלים אמינים של מחלות אנושיות, מציעים ייצוג חזותי של תהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים in vivo, ומספקים תובנות לגבי התכונות האטרקטיביות של אינטראקציות בין מיקרואורגניזמים מארחים. יש לציין כי לדגי זברה יש שושלות תאים נפרדות, המאפשרות הדמיה של פיזיולוגיה של המעי, דינמיקה מיקרוביאלית, גונדות והתפתחות רבייה, הבשלה של מערכת החיסון של המאכסן, התנהגות ומטבוליזם27. עוברי דגי זברה מתפתחים בתוך כוריות הגנה עד הבקיעה, והופכים לזחלים לאחר 3 ימים לאחר ההפריה (dpf). הם צדים באופן פעיל מזון ב 5 dpf ומגיעים לבגרות מינית סביב 3 חודשים לאחר ההפריה (mpf)28. דג הזברה המוצלח הראשון ללא חיידקים (GF), שדווח על ידי Rawls et al.24, הראה כי זחלים שניזונו ממזון אוטוקלאבי לאחר ספיגת החלמון הציגו נמק רקמות מ- 8 dpf ומוות כולל ב- 20 dpf. זה הצביע על ההשפעות של דיאטה או על החשיבות של התחשבות באספקת חומרים מזינים אקסוגניים בניסויים הכוללים דגים לטווח ארוך (>7 dpf) GF29. מחקרים מאוחרים יותר שיפרו את פרוטוקול הייצור של דגי GF, תוך שימוש במזון סטרילי ובשיטות ששוכללו במודלים שונים של דגים16.
עם זאת, רוב המחקר על מודלים של דגי זברה GF התמקד בשלבי חיים מוקדמים, הכוללים זיהום חיידקי ב 5 dpf במשך 24 שעות עד 48 שעות, עם דגימות שנאספו לפני 7 dpf בסיום הניסויים 25,30,31. ידוע כי המיקרוביוטה באורגניזמים, כולל בני אדם ודגי זברה, מאוכלסת בתחילת החיים ומעוצבת במהלך גדילה והתפתחות. ההרכב נשאר יציב בשלבים בוגרים, כאשר תפקידי המיקרוביוטה בפונדקאי הם קריטיים לאורך החיים, במיוחד בהזדקנות, ניוון עצבי, השמנת יתר מטבולית ומחלות מעיים3. לפיכך, פרספקטיבות של חיות GF עם הישרדות ארוכה יותר יכולות לספק תובנות לגבי המנגנונים של תפקידים מיקרוביאליים בהתפתחות איברים מארחים ותפקודם, בהתחשב במערכות החיסון והרבייה הלא בשלות של זחלי דגים בתחילת החיים. בעוד זני חיידקים במעיים של דגי זברה בודדו וזוהו במחקרים קודמים, והציעו את הפוטנציאל להדבקת מודלים של GF בבעלי חיים לבחירת פרוביוטיקה או לחקר תפקודי חיידקים בפונדקאי19,25, הדור והיישום של מודלים של דגי GF הוגבלו בעיקר לשלבי חיים מוקדמים. מגבלה זו, המיוחסת לתהליך הייצור המורכב, עלויות תחזוקה גבוהות ובעיות הקשורות למזון ולמערכת החיסון, מעכבת את מאמצי המחקר שמטרתם לחקור את ההשפעות ההתפתחותיות והכרוניות של מיקרוביוטה בפונדקאי.
שיעור ההישרדות, ההתנהגות, הגדילה, ההתבגרות והבריאות הכללית של דגים, במיוחד במודלים נטולי חיידקים (GF), מושפעים באופן משמעותי מהרגלי האכלה, הכוללים צריכת תזונה וספיגה במהלך תקופת פתיחת הפה מהזחלים המוקדמים ועד הצעירים32,33. עם זאת, אחד האתגרים בגידול דגי GF הוא המחסור בתזונה סטרילית מתאימה, המגביל את יעילות התמיכה התזונתית לקיום הצמיחה וההישרדות של הזחלים. פתרון בעיה זו חיוני לשיקום חייהם של דגי GF, בהתחשב במנגנוני ההגנה ההתפתחותיים שלהם וביכולות העיכול החלשות שלהם עקב היעדר מיקרוביום במעי. מבחינת מזון, שרימפס מלח חי (Artemia sp.) מתגלה כתזונה המתאימה ביותר לזחלים פתוחים לפה לדגים צעירים. נצפה כי דגים הניזונים מחסילוני מלח חיים מפגינים שיעורי גדילה והישרדות גבוהים יותר בהשוואה לאלה הניזונים מחלמון ביצה מבושל או פיתיונות טבעיים וסינתטיים אחרים34. בעוד שמודלים מוקדמים של דגי GF יכולים לשרוד עם תמיכה בחלמון ומודלים של זחלי GF יכולים להישמר עם הזנה סטרילית, יצירת מודלים ארוכי טווח מזחלים לצעירים והגעה לבגרות מינית נותרה מאתגרת. בנוסף, מזון פתיתים או אבקה מוגבל על ידי הרכב תזונתי לא שוויוני ויכול להשפיע על איכות המים. לעומת זאת, לארטמיה חיה יתרונות כגון הישרדות הן במלח והן במים מתוקים, גודל קטן המתאים לזחלים לבוגרים, קלות האצווה ואיכות בקיעה גבוהה יותר35. בהתבסס על שיטות קודמות 16,24,30, פישטנו את תהליך הטיפול המורכב והתמודדנו עם אתגר הדיאטה על ידי ביסוס GF לחיות ארטמיה sp. מודגר בקלות כמזון סטרילי לפרקי זמן ארוכים יותר מאשר דגי GF בתחילת החיים.
מחקר זה מציג פרוטוקול אופטימלי המכסה (1) דור, (2) תחזוקה, (3) זיהוי קצב סטרילי, ו-(4) תחזוקה והזנה כדי להבטיח צמיחה של דגי זברה נטולי חיידקים (GF) מעוברים לזחלים ולשלבים צעירים. התוצאות מציעות ראיות ראשוניות על בקיעה, הישרדות, גדילה וסטריליות של דגי זברה GF, יחד עם מדדים חיוניים עבור GF Artemia sp. כמזון סטרילי. השלבים המפורטים ביצירת מודלים והכנה של מזון חי סטרילי מספקים תמיכה טכנית חיונית לבנייה ויישום של מודלים ארוכי טווח של דגי GF, כמו גם GF Artemia sp. במחקר אינטראקציה מיקרוביוטה-מארח. הפרוטוקול מתייחס לבידוד, זיהוי וזיהום חיידקים במודלים של דגי GF, מתווה שיטות לתיוג פלואורסצנטי חיידקי וצפייה בהתיישבות שלהם במעי דגים תחת מיקרוסקופ. דגי GF, דגים גנוטוביוטיים עם זיהום חיידקי, או מודלים של מיקרוביוטה אנושית מועברת יעברו גילויים שונים כדי להבהיר את תפקידיהם והשפעתם על חסינות המאכסן, העיכול, ההתנהגות, ויסות השעתוק וההיבטים המטבוליים. בטווח הארוך, פרוטוקול זה יכול להיות מורחב למיני דגים שונים מסוג בר, כגון מדאקה ימית, ואולי גם לקווי דגי זברה טרנסגניים נבחרים אחרים הקשורים לרקמות או מחלות ספציפיות.

<table><tbody><tr><td>AB-GZM</td><td>אמפוטריצין:Solarbio; &nbsp; קנמיצין:סולארביו; אמפיצילין: סולארביו.</td><td>אמפוטריצין:CAS:1397-89-3; kanamycin:CAS: 25380-94-0; אמפיצילין: CAS: 69-52-313.</td><td>49.6 מ"ל GZM, 50 ומיקרו; תמיסת מלאי אמפוטריצין L (250 ומיקרו; גרם/מ"ל), 25 ומיקרו; תמיסת מלאי קנמיצין L (10 מ"ג/מ"ל), ו-250 ומיקרו; תמיסת מלאי L אמפיצילין (20 מ"ג/מ"ל).</td></tr><tr><td>1.5 מ"ל, 15 מ"ל, 50 מ"ל צינורות EP biosharp</td><td></td><td>BS-15-M</td><td>לאיסוף דגימות, והחזקת סוכנים</td></tr><tr><td>2.4 גרם/ליטר NaClO</td><td>XILONG SCIENTIFIC CO., Ltd.</td><td>CAS: 7681-52-9</td><td>מדולל בתמיסה מימית של 8% נתרן היפוכלוריט.</td></tr><tr><td>צלחות 6 בארות, 24, 48- צלחות</td><td>באר LABSELECT&nbsp;</td><td>11112</td><td>לתרבית דגים</td></tr><tr><td>AeronomasNCBI</td> <td>מס' מס MK178499</td><td></td><td>2019-JPP-ESN</td></tr><tr><td>לוחות TSA אנאירוביים</td><td>טריפטון: אוקסואיד ; פפטון סויה: Solarbio ; NaCl:Biosharp; אבקת אגר: BioFroxx.</td><td>טריפטון:LP0042B; פפטון סויה:Cat#S9500; NaCl:BS112; אבקת אגר: 9002-18-0.</td><td>צלחות ה-TSA הוכנו עם מדיום של 400 מ"ל המכיל 6 גרם טריפטון, 2 גרם פפטון סויה, 2 גרם NaCl ו-6 גרם אבקת אגר תחת המערכת האנאירובית.</td></tr><tr><td>תחנת עבודה אנאירובית</td><td>GENE SCIENCE</td><td>E200G</td><td>בידוד חיידקים, בדיקות סטריליות</td></tr><tr><td>ניתוח</td><td>GraphPad Prism 5</td><td>v6.07</td><td>לניתוח הנתונים</td></tr><tr><td>API 20 E ערכות</td><td>&nbsp; BioMerieux SA, צרפת</td><td>No.1005915090</td><td>Ref 20100 ערכות לאיתור מטבוליזם חיידקי</td></tr> <tr><td>Artemia (שרימפס מי מלח)</td><td>Shangjia Aquarium Co., Ltd.</td>ציסטות <td>ארטמיה של המותג Aquamaster</td><td>, וביצי שרימפס מלח&nbsp;</td></tr><tr><td>מערכת מחזור אוטומטי לגידול דגים</td><td>Ningbo Hairui Technology Co., Ltd</td><td>No Cat</td><td>שמור על</td></tr><tr>הדג<td>Autoclave</td><td>Zeal Way</td><td>G154DWS</td><td>הכן את החומרים</td></tr><tr><td>BHI</td><td>Aerobic Coolaber</td><td>Cat # PM0640</td><td>BHI מדיום הוכן , שבו 100 מ"ל בינוני כלל 3.7 גרם אבקת BHI.</td></tr><tr><td>BHI Anaerobic</td><td>Coolaber</td><td>Cat # PM0640</td><td>מדיום BHI הוכן וחולק לצינורות אנאירוביים תחת המערכת האנאירובית.</td></tr><tr><td>חממה ביוכימית</td><td>LongYue Co., Ltd</td><td>SPX</td><td>לדגים וצלחות</td></tr><tr><td>ארון בטיחות ביולוגית</td><td>Haier</td><td>HR40-IIA2</td><td>טיפול ובדיקה סטריליים</td></tr><tr><td>חומר הלבנה של 0.02 גרם/ליטר NaClO</td><td>XILONG SCIENTIFIC CO., Ltd.</td><td>CAS: 7681-52-9</td><td>תמיסת עבודה עם ריכוז נתרן היפוכלוריט (NaClO): מדולל בתמיסה מימית של נתרן היפוכלוריט 8% או 166.6 uL 6% נתרן היפוכלוריט עם 500 מ"ל מים מזוקקים.</td></tr><tr><td>צלחות דם</td><td>כבשים: חתול סולארביו</td><td>מס' TX0030</td><td>דם כבשים סטרילי דפיברין נוסף ל-TSA להכנת 5% לוחות דם.</td></tr><tr><td>בקבוק תרבית תאים</td><td>קורנינג</td><td>430639</td><td>לתרבית דגים</td></tr><tr><td>צבעי CM-Dil</td><td>בדיקות מולקולריות</td><td>חתול #C7000&nbsp; &nbsp;</td><td>לתייג את החיידקים</td></tr><tr><td>חממת טלטול בטמפרטורה קבועה</td><td>Peiving Co., Ltd</td><td>HZQ-X100</td><td>מסד נתונים של תרביות חיידקים</td></tr><tr><td></td><td>NCBI</td><td>מסד נתונים של חיידקים וארכיאה</td><td>קישור: Archaea FTP: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Archaea/ חיידקים FTP: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Bacteria/</td></tr> <tr><td>חד פעמי פסטר</td><td>פיפטה biosharp</td><td>bs-xh-03l</td><td>משמש להחלפת מים והעברת ביצים</td></tr><tr><td>צלחת פטרי חד פעמית</td><td>biosharp</td><td>BS-90-D</td><td>לתרבית ערכות DNA של דגים</td></tr><tr><td></td><td>Solaribio</td><td>Cat #D1600</td><td>ערכות מיצוי DNA גנומי חיידקי&nbsp;</td></tr><tr><td>פיפטה חשמלית</td><td>SCILOGEX</td><td>Levo me</td><td>שינוי מים</td></tr><tr><td>Exiguobacterium</td><td>NCBI מס' נתונים</td><td>MK178504</td><td>2019-JPP-ESN</td></tr><tr><td>GZM</td><td>מלח ים: LANDEBAO Co., Ltd.</td><td>ללא חתול</td><td>מורכב מ-1 ליטר מים ו-1.5 מ"ל תמיסת מלח ים (40 גרם/ליטר), חיטוי. תכולת מלח הים בתמיסת GZM הייתה 60 מ"ג/ליטר.</td></tr><tr><td>מערכת מים טהורים במעבדה</td><td>הייטק ושות', בע"מ</td><td>Prima-S15</td><td>הכן את הסוכנים</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ</td><td>ניקון</td><td>SMZ18</td><td>עם אור פלורסנט לצפייה בזחלי</td></tr><tr><td>דגים ערכות PCR</td><td>TIANGEN</td><td>Cat#ET101</td><td>ערכת Taq DNA פולימראז</td></tr><tr><td>פיפטה</td><td>LABSELECT&nbsp;</td><td>sp-013-10</td><td>החלפת מים</td></tr><tr><td>פובידון יוד (PVP-I)</td><td>Aladdin</td><td>Lot#H1217005</td><td>תמיסה מימית פובידון יוד 0.4 גרם/ליטר מים טהורים.</td></tr><tr><td>ממיר תזמון</td><td>PinYi Co., Ltd</td><td>AL-06</td><td>כדי לווסת את האור</td></tr><tr><td>TSA לוחות</td><td>טריפטון: אוקסואיד; פפטון סויה: Solarbio ; NaCl:Biosharp; אבקת אגר: BioFroxx.</td><td>טריפטון:LP0042B; פפטון סויה:Cat#S9500; NaCl:BS112; אבקת אגר: 9002-18-0.</td><td>צלחות TSA הוכנו עם מדיום של 400 מ"ל המכיל 6 גרם טריפטון, 2 גרם פפטון סויה, 2 גרם NaCl, 6 גרם אבקת אגר</td></tr>.<tr><td>TSB טריפטון אירובי</td><td>: אוקסואיד ; פפטון סויה: Solarbio ; NaCl:Biosharp;</td><td>טריפטון:LP0042B; פפטון סויה:Cat#S9500; NaCl:BS112;</td><td>הוכן מדיום TSB, שבו מדיום 400 מ"ל כלל 6 גרם טריפטון, 2 גרם פפטון סויה ו-2 גרם NaCl.</td></tr><tr><td>TSB טריפטון אנאירובי</td><td>: אוקסואיד ; פפטון סויה: Solarbio ; NaCl:Biosharp;</td><td>טריפטון:LP0042B; פפטון סויה:Cat#S9500; NaCl:BS112;</td><td>מדיום TSB הוכן וחולק לצינורות האנאירוביים תחת המערכת האנאירובית.</td></tr><tr><td>שולחן עבודה נקי במיוחד</td><td>Airtech</td><td>SW-CJ-2FD</td><td>טיפול ובדיקה סטריליים</td></tr><tr><td>מערכת זרימה טהורה במיוחד לגידול דגים</td><td>חברת ציוד ביולוגי ימי</td><td>No Cat</td><td>לייצר מים לדגים</td></tr><tr><td>VibrioNCBI</td> <td>מס' מס MK178501</td><td></td><td>2019-JPP-ESN</td></tr></tbody></table>

ייצור, תחזוקה וזיהוי של מודלים של דגי זברה נטולי חיידקים מזחלים ועד שלבים צעירים

Generation, Maintenance, and Identification of Germ-Free Zebrafish Models from Larvae to Juvenile Stages

דגי זברה משמשים כמודלים רבי ערך למחקר על גדילה, חסינות ומיקרוביוטה של המעי בשל הדמיון הגנומי שלהם ליונקים, עוברים שקופים שפותחו בסביבת כוריון נקייה יחסית, והתפתחות מהירה מאוד של זחלים בהשוואה למודלים של מכרסמים. דגי זברה נטולי חיידקים (Danio rerio) חיוניים להערכת רעילות המזהמים ולביסוס מודלים של מחלות דמויות אדם הקשורות לתפקודים מיקרוביאליים. בהשוואה למודלים קונבנציונליים (CR) (דגים בגידול משותף), דגי זברה GF מאפשרים מניפולציה מדויקת יותר של המיקרוביוטה המארחת, ומסייעים בקביעת הקשר הסיבתי בין מיקרואורגניזמים לפונדקאים. כתוצאה מכך, הם ממלאים תפקיד קריטי בקידום הבנתנו את מערכות היחסים הללו. עם זאת, מודלים של דגי זברה GF נוצרים ונחקרים בדרך כלל במהלך שלבי החיים המוקדמים (מעוברים ועד זחלים) עקב מגבלות בתפקוד מערכת החיסון ובספיגת חומרים מזינים. מחקר זה מייעל את הייצור, התחזוקה והזיהוי של מודלים מוקדמים של דגי זברה GF ללא האכלה ועם הזנה לטווח ארוך באמצעות מזון GF (כגון Artemia sp., שרימפס מלח). לאורך כל התהליך בוצעו דגימות יומיות ותרביות באמצעות זיהויים מרובים, כולל לוחות וריצוף rRNA 16S. הקצב האספטי, ההישרדות ומדדי ההתפתחות של דגי זברה GF תועדו כדי להבטיח את האיכות והכמות של המודלים שנוצרו. חשוב לציין, מחקר זה מספק פרטים על טכניקות בידוד חיידקים וזיהום עבור דגי GF, המאפשרים יצירה יעילה של מודלים של דגי GF מזחלים לשלבים צעירים עם תמיכה במזון GF. על ידי יישום הליכים אלה במחקר ביו-רפואי, מדענים יכולים להבין טוב יותר את היחסים בין תפקודי חיידקי המעי לבריאות המאכסן.

ניתן לייצר ביעילות את דגמי דגי הזברה GF על ידי ניצול שפע הביצים שהושרצו על ידי זוגות דגי זברה, כאשר הפרוטוקול מותאם למודלים קודמים של דגי GF35. צלחת אחת בת 6 בארות יכולה לגדל כ-30-48 עוברים/זחלים, מה שמאפשר איסוף נתונים נרחב וניתוח סטטיסטי. לאחר טיפול סטרילי, עוברי GF מתורבתים באינקובטור נקי עד לבקיעה לזחלים לאחר 48-72 שעות, ומשנים GZM מדי יום עם איתור הדגימות שנאספו, דבר חיוני לשמירה על מצב נקי מחיידקים (איור 1). לאחר 7 dpf, המזון של חלמון ביצה וארטמיה חיה צריך להיות מוכן עבור זחלים לשלבים צעירים. במהלך הצמיחה וההתפתחות של דגים, הנפח, המיכל והצפיפות של GZM צריכים להיות מווסתים או משתנים בזמן כדי למנוע מוות וכישלון של מעמד סטרילי. אם הגילוי אינו מראה זיהום חיידקי, ניתן לשמר את המודלים המוצלחים של GF ככרוניים מגיל צעיר ועד בגרות מוקדמת, אך שיעור ההישרדות נמוך בהרבה בפועל. לבסוף, ניתן למדוד את הקצב הסטרילי, שיעור ההישרדות, מדד ההתפתחות, ההתנהגות, הניתוח ההיסטופתולוגי ופרופיל השעתוק של מודלים של דגי GF ו-CR כדי לחקור את ההשפעה של שדות מיקרוביוטה ומסכי תרופות. במחקר זה הושוו המדדים ההתפתחותיים העיקריים (איור משלים 1), ושיעור הבקיעה של דגי GF היה נמוך ב-45.7% מדגי CR, עם 60% ב-72 כיפות. קצב הלב של זחלי GF ב-7 dpf היה נמוך משמעותית ועמד על 18.2 פעימות ל-10 שניות בהשוואה לדגי CR עם 22.6 פעימות ל-10 שניות, אך לא היה הבדל בין שתי הקבוצות ב-14 dpf עם שיעורים של 23.5-23.8 פעימות ל-10 שניות. שיעור ההישרדות של דגי GF ב-7 dpf היה זהה לזה של דגי CR ב-86.7%, אך ירד ל-60% ב-14 dpf בהשוואה ל-80% בדגי CR. עם זאת, שיעורי ההישרדות של דגי GF ו-CR ירדו ל-25%-10% לאחר תקופת פתיחת הפה, כאשר הם רכשו יכולות או הרגלים של האכלה. הכישלון לשמור על מעמדם הסטרילי של הדגים היה אחת הסיבות לשיעור ההישרדות הנמוך יותר. לכן, האכלה ותחזוקה תזונתית משלבי הנעורים ועד לבגרות המוקדמת הם אתגרים קריטיים בגידול דגים.
גורם מפתח נוסף המשפיע על גדילה והתפתחות של דגים הוא האכלה. במחקר הזה אנו חוקרים שיטות רבות להשגת ארטמיה GF כמזון חי עבור זחלי זברה GF ארוכי טווח לצעירים ובוגרים (תהליך שמוצג באיור 2). בשל השימוש היומיומי במזון לדגי GF, הפרוטוקול הממוטב עבור GF Artemia אמור להיות קל, חוסך זמן וחסכוני בפועל. לאחר השוואת התנועה הפעילה והמוות/חוסר התנועה של nauplii שנצפו במיקרוסקופ, מאפיינים של nauplii, ביצים שלא בקעו וקליפה, השיטה משתכללת. לאחר הדגירה היומית, המדדים של ארטמיה GF טרייה שהתקבלו מבקבוקים, כולל הבקיעה, שיעור ההישרדות והעיוות, והאורך והמשקל של nauplii, נצפו ונמדדו תחת המיקרוסקופ (איור 3). לאחר הטיפול, שיעור הבקיעה של ציסטות ארטמיה היה גבוה, עם ממוצע של 88.15%, הישרדות של nauplii שחייה היה 77.83%, ואת שיעור המום היה 1.87%. אורך הגוף של הנאופלי היה 546.70 מיקרומטר, ומדד משקל הגוף היה 3.80 מ"ג/100, המתאימים לתפיסת דגים והאכלתם מתקופת פתיחת חודש הזחלים ועד לשלב הנעורים והבוגרים.
זיהוי דגי GF וארטמיה GF חשוב גם לתחזוקת המודל. על-פי איסוף דגימות ושיטות בדיקה מרובות, התוצאות יכולות לספק את ההצלחה של עוברי דגי זברה מטופלים וציסטות ארטמיה בצלחת התרבית ובתווך הנוזלי (איור 4). הדגימות השונות הנאספות מדי יום צריכות להיות מזוהות כסטריליות בכל שיטות הבדיקה, אשר לאחר מכן יכולות להצביע על דגמי GF בזמן האיסוף. ארטמיה GF צריך להיות מזוהה לפני האכלה על דגים GF, או צלחת ותוצאות אינקובטור בינוני צריך להתייחס למצב סטרילי של nauplii חי טרי. כלומר, לטפח ארטמיה GF מציסטות על צלחות TSA או זכוכית בינונית נוזלית TSB או BHI בדגירה לנער, אשר יכול לשמש ליצירת ארטמיה GF ואימות סטרילי בו זמנית. פרוטוקול GF Artemia יכול להכיל מספר מוגבל של זחלים להאכלה. במהלך תהליך ההאכלה, היה ברור כי ארטמיה GF שחה בתוך GZM ולאחר מכן נלכד ונאכל על ידי זחלי דגי GF.
היישומים של מודלים של דגי GF כוללים תחומים שונים בביולוגיה וברפואה, ומאפשרים לחקור תפקודים מיקרוביאליים, גדילה והתפתחות, מנגנוני מחלות, וסינון פרוביוטי או תרופתי, בין היתר46. במחקר זה, למשל, שני חיידקי מעיים עיקריים, Aeromonas sp. ו- Vibrio sp., בודדו מדגי זברה. מאפייני המושבה וזיהויה בוצעו, ותפקודים מטבוליים מרובים נמדדו במבחנה באמצעות ערכות זמינות מסחריות (איור 5). חיידקים אלה בודדו וזוהו בריצוף 16S, ותוצאות הפיצוץ הוצגו בדו"ח קודם42. זני החיידקים שזוהו מאפשרים מחקר מדעי על ההשפעה של מיקרוביוטה יחידה או משולבת על בריאות המאכסן על ידי הדבקת מודלים של דגי GF. השקיפות של זחלי דגים מאפשרת תצפית על תאי חיידקים בעלי תווית פלואורסצנטית באמצעות צבעי CM-דיל, מה שחושף התיישבות ותפוצה במעיים של דגי GF (מוצג באיור 6). לאחר זיהום חיידקי ב 5 dpf, זחלי זברה GF ניתן לצלם עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי ולצפות ברציפות מ 6 עד 14 dpf, מתן תובנות על תפקודים מיקרוביאליים בשילוב עם אינדקסים התפתחותיים, שינויים היסטופתולוגיים, ושינויים מולקולריים47.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66512/66512fig01.jpg"> איור 1: פרוטוקול של דגי זברה GF מעוברים לזחלים ולצעירים. השלבים העיקריים ביצירת דגי זברה GF כוללים: (1) איסוף עוברים מדגי זברה מסוג בר ומיקום ב- AB-GZM. (2) יש לשטוף את הטיפול בסוכני PVP-I ו-NaClO כדי להבטיח סטריליות מלאה. (3) תרבית עוברים/זחלים GF בצלחות 6 בארות עם GZM, חידוש המדיום מדי יום. (4) הסדרת תנאי התרבות לצמיחה והתפתחות מיטביים. (5) דיגום בשלבי התפתחות שונים, ולאחר מכן בדיקת סטריליות בשיטות צלחת ומדיום נוזלי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66512/66512fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66512/66512fig02.jpg"> איור 2: פרוטוקול הכנת ארטמיה GF כמזון חי לדגי GF. השלבים העיקריים כוללים: (1) לשטוף את הטיפול בציסטות ארטמיה לסטריליות מלאה. (2) הכנת ציסטות GF בתווך. (3) דגירה בתמיסת מלח במשך 24 שעות לקידום הבקיעה. (4) סינון בקיעה כושלת וביצים ריקות לאיסוף נאופלי פעיל. (5) שטיפת נאופלי שנאספה לסילוק פסולת, תוך הבטחת מזון חי איכותי ונקי מזהמים. (6) בדיקת סטריליות של ארטמיה GF לפני האכלה לזחלי דגי GF. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66512/66512fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66512/66512fig03.jpg"> איור 3: אינדקסים של ציסטות ארטמיה GF ונאופלי מודגרות במשך 24 שעות. (A) ציסטות ארטמיה לא מטופלות עם סרט טומאה (סרגל קנה מידה: 500 מיקרומטר). (B) ציסטות ארטמיה מטופלות עם משטח קמור מעט לאחר ספיגת מים ומראה נקי יותר (סרגל אבנית: 500 מיקרומטר). (C) בדיקה מיקרוסקופית של GF Artemia nauplii חי מודגר טרי (סרגל קנה מידה: 2000 מיקרומטר) ו-(D) הגדלה עם סרגל קנה מידה של 1000 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66512/66512fig03large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66512/66512fig04.jpg"> איור 4: זיהוי סטרילי של דגי GF בכל שלב בחיים וארטמיה GF. (A) בדיקות סטריליות של דגימות CR ו-GF באמצעות TSB ו-BHI נוזל בינוני, TSA ולוחיות דם בתנאים אירוביים ואנאירוביים. (B) בדיקות סטריליות של ציסטות ארטמיה לא מטופלות, ציסטות ארטמיה GF ונאופלי באמצעות TSB ו- BHI מדיום נוזלי, TSA ולוחיות דם בתנאים אירוביים ואנאירוביים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66512/66512fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66512/66512fig05.jpg"> איור 5: בידוד וזיהוי חיידקי מעיים בדגי זברה. (A) זני חיידקים, מאפייני מושבות, מפות ריצוף 16S (דוגמאות: Aeromonas sp. ו-Vibrio sp). (B) הצטרפות לסוג ול-NCBI. (C) תפקודים מטבוליים של חיידקים שבודדו ממעי דגי זברה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66512/66512fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66512/66512fig06.jpg"> איור 6: זיהום והתיישבות של זני חיידקי מעיים בדגי זברה GF. (A) שחזור זני חיידקים מבודדים ומזוהים לצורך ניסויי זיהום. (B) תיוג חיידקים בצבעים פלואורסצנטיים וזיהום של זחלי זברה GF ב-5 dpf. הגדלה: 1x. (C) תצפית על התפלגות והתיישבות של חיידקים (Vibrio sp.) ברקמות המעי in vivo. הגדלה: 3x. (D) ספירה של CFUs של חיידקים (Aeromonas sp. ו - Vibrio sp.) בכל זחל דגים על ידי דגימה יומית. הנתונים מציגים ממוצע ± SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66512/66512fig06large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>פריימרים</td>
			<td>רצפים(5'-3')</td>
			<td>אורך המוצר</td>
		</tr><tr><td>27ו</td>
			<td>AGAGTTTGATCMTGGCTCAG</td>
			<td rowspan="2">1465 BP</td>
		</tr><tr><td>1492R</td>
			<td>ACGGYTACCTTGTTACGACTT</td>
		</tr><tr><td>63ו</td>
			<td>CAGGCCTAACACATGCAAGTC</td>
			<td rowspan="2">1324 BP</td>
		</tr><tr><td>1387R</td>
			<td>GGGCGGWGTGTACAAGGC</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 1: פריימרים המשמשים לזיהוי חיידקים.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>רכיבים</td>
			<td>יחידות</td>
			<td>נפח (μL)</td>
		</tr><tr><td>Taq DNA פולימראז</td>
			<td>2.5 U/μL</td>
			<td>0.1</td>
		</tr><tr><td>10× חוצץ (מ"ג2+)</td>
			<td>---</td>
			<td>2.1</td>
		</tr><tr><td>תערובת dNTP</td>
			<td>2.5 מ"מ</td>
			<td>1.6</td>
		</tr><tr><td>פריימר 27F</td>
			<td>10 מיקרומטר</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>פריימר 1492R</td>
			<td>10 מיקרומטר</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>ללא DNA/RNA H2O</td>
			<td>---</td>
			<td>13.2</td>
		</tr><tr><td>DNA של תבנית</td>
			<td>---</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>עוצמת קול כוללת</td>
			<td>---</td>
			<td>20</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 2: ריכוז סופי ונפח של רכיבים לכל תגובה.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>צעד</td>
			<td>טמפרטורה</td>
			<td>זמן</td>
			<td>מחזורים</td>
		</tr><tr><td>דנטורציה ראשונית</td>
			<td>95 °C</td>
			<td>4 דקות</td>
			<td>--</td>
		</tr><tr><td>דנטורציה</td>
			<td>94°C</td>
			<td>1 דקות</td>
			<td rowspan="3">35</td>
		</tr><tr><td>חישול</td>
			<td>55 °C</td>
			<td>1 דקות</td>
		</tr><tr><td>סיומת</td>
			<td>72 °C</td>
			<td>1 דקות</td>
		</tr><tr><td>הארכה סופית</td>
			<td>72 °C</td>
			<td>10 דק'</td>
			<td>--</td>
		</tr><tr><td>אחז</td>
			<td>4 °C</td>
			<td>∞</td>
			<td>--</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 3: תוכנית PCR להגברה של הגן rRNA 16S.
תרשים משלים 1: המדדים ההתפתחותיים הקריטיים של מודלים של דגי זברה GF ו-CR. (A) קצב הבקיעה של דגי זברה CR ו-GF ב-72 hpf, ו-(B) פעימות לב/10 שניות של דגי CR ו-GF ב-7 dpf ו-14 dpf. שיעורי ההישרדות (%) של דגי CR ו-GF ירדו מ-7 ימים ו-14 ימים עם 86%, 60%-80% ל-10%-25% ב-30 dpf. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66512/Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>

פרוטוקול זה מתאר את השלבים העיקריים להשגת עוברי דגים נטולי חיידקים (GF) ושמירה עליהם מהזחלים ועד לשלב הנעורים, כולל דגימה וגילוי מצבם הסטרילי. השימוש במודלים של GF עם זיהום חשוב להבנת תפקיד המיקרובים בבריאות המאכסן.

Zebrafish serve as valuable models for research on growth, immunity, and gut microbiota due to their genomic similarities with mammals, transparent ...

היקף המחקר הוא יצירת מודלים חדשניים של בעלי חיים נטולי חיידקים, אשר יהוו כלים מועילים ורבי עוצמה בחקירת תפקודי מיקרוביום שונים. בתחום זה נעשה לאחרונה שימוש במודלים המוקדמים של דגים נטולי חיידקים, אך המודלים ארוכי הטווח עדיין מוגבלים בשל תנאי תרבות שונים וההגנה ההתפתחותית של הצוות. המודלים הנוכחיים של דגי GF הם בדרך כלל מודלים של חיים מוקדמים.לכן, הטכנולוגיות כולל קנה המידה הסטרילי, שיטות זיהוי הדגימות, ואספקת מזון סטרילי הם אתגרים חשובים מאוד להתגבר עליהם. מודל דגי הזברה נטולי החיידקים חיוני לחקר האינטראקציה בין הפונדקאי למיקרוביוטה והשפעותיה על ההתפתחות ועל מערכת החיסון והמחלות. מודל זה מאפשר לחוקרים לתפעל במדויק את חיידקי המעי הבודדים ולבחון את השפעתם על עוברי דגי הזברה השקופים.הוא מספק תובנות חשובות לגבי תפקידם של חיידקי המעי היורשים את המחלה. בעתיד, המחקר שלנו יתמקד בעיקר בביסוס מודל של דגי זברה נטולי חיידקים לכל מחזור החיים כדי להבין טוב יותר את תפקוד מיקרוביום המעי.

generation-maintenance-identification-germ-free-zebrafish-models-from

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

מדריך צעד אחר צעד כדי ליצור ממוקד עוברי דג הזברה chimeric על ידי השתלת בשלב blastula או gastrula.

יצירת עוברים דג הזברה chimeric על ידי השתלה

פרוטוקול זה מתאר תחזוקה וטיפול קבוע כדי לשמור על תנאים אופטימליים לגידול בעלי דג זברה. הסרטון מדגים את הפרוטוקול לתחזוקת מערכת, דיור רגיל, הזנה, רבייה, וגידול של זחלי דג זברה.

טיפול קבוע ותחזוקה של דג זברה (<em&gt; Danio rerio</em&gt;) מעבדה: מבוא

עובר דג הזברה הוא מודל מצוין למחקר בביולוגיה התפתחותית. במהלך עובר, דג הזברה מתפתחת עם מסת חלמון, אשר מציבה אתגרים תלת ממדים לתצפית מדגם וניתוח. פרוטוקול זה מתאר כיצד ליצור הכנות הר שטוחות דו ממדים של הר שלם באתרם דגימות (לוואי) מוכתמות דג הזברה עובר.

הר הכנה שטוחה לתצפית וניתוח של עובר דג הזברה דוגמאות ויטראז בהר שלם<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה

דג הזברה הוא מערכת מודל רבת עוצמה לביולוגיה התפתחותית וחקר מחלות אנושיות בשל הדמיון הגנטי שלהם עם בעלי חוליות גבוהים יותר. פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיה ליצירת עוברי דג זברה הפלואידים שניתן להשתמש בהם לאסטרטגיות מסך קדימה לזיהוי מוטציות רצסיביות בגנים החיוניים לאמבריוגנזה מוקדמת.

ייצור של הפלואידים עוברי דג הזברה על ידי<em&gt; במבחנה</em&gt; הפריה

דג זברה שימשו מודל גנטי אמין האורגניזמים במחקר ביו-רפואי, במיוחד עם כניסתו של טכנולוגיות לעריכת ג'ין. כאשר הזחל פנוטיפים צפויים, זיהוי ה-DNA החילוץ, גנוטיפ יכול להיות מאתגר. כאן, אנו מתארים הליך genotyping יעיל עבור הזחלים דג זברה, מאת הזנב מסיכה, מוקדם ככל 72-h שלאחר ההפריה.

מיצוי DNA תפוקה גבוהה, Genotyping של הזחלים דג זברה 3dpf על-ידי המסיכה פין

התחדשות שרירי השלד מונעת על ידי תאי גזע שריריים תושב רקמות, אשר לקויים במחלות שרירים רבות כגון ניוון שרירים, וזה גורם לחוסר היכולת של השריר להתחדש. כאן, אנו מתארים פרוטוקול המאפשר בדיקה של התחדשות שרירים במודלים של דגי זברה של מחלת שרירים.

בחינת התחדשות שרירים במודלים של דגי זברה של מחלת שרירים

כאן אנו מציגים שיטה לדימוי המוח העוברי של דג הזברה בשלבים של זחלים ונוער. הליך מיקרו-פולשני זה, המותאם מגישות אלקטרופיזיולוגיות, מספק גישה לפרטים תאיים ותת-תאיים של נוירון בוגר וניתן לשלבו עם אופטוגנטיקה ומחקרים נוירופרמקולוגיים לאפיון תפקוד המוח והתערבות תרופתית.

In vivo הדמיה של רקמת מוח פעילה לחלוטין בזחלי דגי זברה ערים וצעירים על ידי הסרת גולגולת ועור

דג הזברה נוצל לאחרונה כמודל לאימות משנים פוטנציאליים של קרינה. הפרוטוקול הנוכחי מתאר את השלבים המפורטים לשימוש בעוברים של דגי זברה לניסויי סינון מבוססי קרינה וכמה גישות תצפיתיות להערכת ההשפעה של טיפולים וקרינה שונים.

זחלי דגי זברה כמודל להערכת רדיוסנסיטיזרים או מגינים פוטנציאליים

אנו מציגים פרוטוקול ללכידת הדינמיקה של התחדשות סנפיר זנב זחל דג הזברה בקנה מידה של רקמה שלמה באמצעות סטריאומיקרוסקופיה מבוססת שדה בהיר. טכניקה זו מאפשרת ללכוד את דינמיקת ההתחדשות ברזולוציית תא בודד. ניתן להתאים מתודולוגיה זו לכל סטריאומיקרוסקופ המצויד במצלמת CCD ותוכנת זמן-lapse.

לכידת תיקון רקמות דג הזברה זחלים עם הזמן לשגות Brightfield stereomicroscopy

במחקר זה, אנו מתארים שיטה פשוטה לביצוע ניתוח צבע כחול של אוונס (EBD) על זחלי דג הזברה.  טכניקה זו היא כלי רב עוצמה לאפיון שלמות שרירי השלד ותיחום מודלים של דג זברה של ניוון שרירים, והיא שיטה רבת ערך לפיתוח טיפולים חדשים.

ניתוח של יושרה שריר שלד דג הזברה זחלים עם אוונס הכחול צבע

למד לייצר ולתחזק דגי זברה נטולי חיידקים מזחלים ועד שלבים צעירים לחקר אינטראקציות מארח-מיקרוביום. שיטה זו מאפשרת לחקור את השפעת החיידקים על התפתחות וחסינות ב-Danio rerio.

ייצור, תחזוקה וזיהוי של מודלים של דגי זברה נטולי חיידקים מזחלים ועד שלבים צעירים

גלה סרטונים נוספים