Name: הדמיה חיה ואפיון דינמיקה של תאי מיקרוגליה בעובר דג הזברה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-17T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: למד אפיון דינמיקה של תאי מיקרוגליה בעובר דג הזברה באמצעות מיקרוסקופיית קונפוקלית מהירה. פרוטוקול זה מאפשר ניתוח בזמן אמת של תנועת התאים והתפתחות המוח.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>הבהרת התנהגות תאי מיקרוגליה בהתפתחות טקטום אופטי של דגי זברה

<ol><li>Wolf, S. A., Boddeke, H. W., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+physiology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Microglia in physiology and disease.</a> Annu Rev Physiol. 79, 619-643 (2017).</li>
<li>Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resting+microglial+cells+are+highly+dynamic+surveillants+of+brain+parenchyma+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo.</a> Sci Rep. 308 (5726), 1314-1318 (2005).</li>
<li>Peri, F., Nusslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+neuronal+degradation+by+microglia+reveals+a+role+for+v0-ATPase+a1+in+phagosomal+fusion+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Live imaging of neuronal degradation by microglia reveals a role for v0-ATPase a1 in phagosomal fusion in vivo.</a> Cell. 133 (5), 916-927 (2008).</li>
<li>Marın-Teva, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+promote+the+death+of+developing+Purkinje+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Microglia promote the death of developing Purkinje cells.</a> Neuron. 41 (4), 535-547 (2004).</li>
<li>Paolicelli, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+pruning+by+microglia+is+necessary+for+normal+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development.</a> Science. 333 (6048), 1456-1458 (2011).</li>
<li>Hattori, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microglia-blood+vessel+interactions+in+the+developing+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">The microglia-blood vessel interactions in the developing brain.</a> Neurosci Res. 187, 58-66 (2023).</li>
<li>Colonna, M., Butovsky, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+function+in+the+central+nervous+system+during+health+and+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Microglia function in the central nervous system during health and neurodegeneration.</a> Annu Rev Immunol. 35, 441-468 (2017).</li>
<li>Xu, H. -T., Pan, F., Yang, G., Gan, W. -B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choice+of+cranial+window+type+for+in+vivo+imaging+affects+dendritic+spine+turnover+in+the+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex.</a> Nat Neurosci. 10 (5), 549-551 (2007).</li>
<li>Shin, J., Park, H. -C., Topczewska, J. M., Mawdsley, D. J., Appel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+cell+fate+analysis+in+zebrafish+using+olig2+BAC+transgenics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Neural cell fate analysis in zebrafish using olig2 BAC transgenics.</a> Methods Cell Sci. 25 (1), 7-14 (2003).</li>
<li>Chi, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foxn4+directly+regulates+tbx2b+expression+and+atrioventricular+canal+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Foxn4 directly regulates tbx2b expression and atrioventricular canal formation.</a> Genes Dev. 22 (6), 734-739 (2008).</li>
<li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regular+care+and+maintenance+of+a+zebrafish+%28Danio+rerio%29+laboratory%3A+An+introduction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: An introduction.</a> J Vis Exp. (69), e4196(2012).</li>
<li>Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenothiourea+sensitizes+zebrafish+cranial+neural+crest+and+extraocular+muscle+development+to+changes+in+retinoic+acid+and+IGF+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle development to changes in retinoic acid and IGF signaling.</a> PLoS ONE. 6 (8), e22991(2011).</li>
<li>Ariga, J., Walker, S. L., Mumm, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+time-lapse+imaging+of+transgenic+zebrafish%3A+visualizing+retinal+stem+cells+activated+by+targeted+neuronal+cell+ablation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Multicolor time-lapse imaging of transgenic zebrafish: visualizing retinal stem cells activated by targeted neuronal cell ablation.</a> J Vis Exp. (43), e2093(2010).</li>
<li>Ferrero, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+microglia+derive+from+primitive+macrophages+and+are+replaced+by+cmyb-dependent+definitive+microglia+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Embryonic microglia derive from primitive macrophages and are replaced by cmyb-dependent definitive microglia in zebrafish.</a> Cell Rep. 24 (1), 130-141 (2018).</li>
<li>Xu, J., Wang, T., Wu, Y., Jin, W., Wen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+colonization+of+developing+zebrafish+midbrain+is+promoted+by+apoptotic+neuron+and+lysophosphatidylcholine%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Microglia colonization of developing zebrafish midbrain is promoted by apoptotic neuron and lysophosphatidylcholine.</a> Dev Cell. 38 (2), 214-222 (2016).</li>
<li>Svahn, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+ramified+microglia+from+early+macrophages+in+the+zebrafish+optic+tectum%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Development of ramified microglia from early macrophages in the zebrafish optic tectum.</a> Dev Neurobiol. 73 (1), 60-71 (2013).</li>
<li>Thion, M. S., Garel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+ontogeny%2C+diversity+and+neurodevelopmental+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Microglial ontogeny, diversity and neurodevelopmental functions.</a> Curr Opin Genet Dev. 65, 186-194 (2020).</li>
<li>Bohlen, C. J., Friedman, B. A., Dejanovic, B., Sheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+brain+development%2C+homeostasis%2C+and+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Microglia in brain development, homeostasis, and neurodegeneration.</a> Annu Rev Genet. 53, 263-288 (2019).</li>
<li>Squarzoni, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+modulate+wiring+of+the+embryonic+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Microglia modulate wiring of the embryonic forebrain.</a> Cell Rep. 8 (5), 1271-1279 (2014).</li>
<li>Schafer, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+sculpt+postnatal+neural+circuits+in+an+activity+and+complement-dependent%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Microglia sculpt postnatal neural circuits in an activity and complement-dependent.</a> Neuron. 74 (4), 691-705 (2012).</li>
<li>Parkhurst, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+promote+learning-dependent+synapse+formation+through+brain-derived+neurotrophic+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Microglia promote learning-dependent synapse formation through brain-derived neurotrophic factor.</a> Cell. 155 (7), 1596-1609 (2013).</li>
<li>Green, L. A., O'Dea, M. R., Hoover, C. A., DeSantis, D. F., Smith, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+embryonic+zebrafish+brain+is+seeded+by+a+lymphatic-dependent+population+of+mrc1%2B+microglia+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The embryonic zebrafish brain is seeded by a lymphatic-dependent population of mrc1+ microglia precursors.</a> Nat. Neurosci. 25 (7), 849-864 (2022).</li>
<li>Hughes, A. N., Appel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+phagocytose+myelin+sheaths+to+modify+developmental+myelination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Microglia phagocytose myelin sheaths to modify developmental myelination.</a> Nat Neurosci. 23 (9), 1055-1066 (2020).</li>
<li>Yu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C1q+is+essential+for+myelination+in+the+central+nervous+system+%28CNS%29%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">C1q is essential for myelination in the central nervous system (CNS).</a> iScience. 26 (12), 108518(2023).</li>
<li>Zengeler, K. E., Lukens, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immunity+at+the+crossroads+of+healthy+brain+maturation+and+neurodevelopmental+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Innate immunity at the crossroads of healthy brain maturation and neurodevelopmental disorders.</a> Nat Rev Immunol. 21 (7), 454-468 (2021).</li>
<li>Paolicelli, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+states+and+nomenclature%3A+A+field+at+its+crossroads%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Microglia states and nomenclature: A field at its crossroads.</a> Neuron. 110 (21), 3458-3483 (2022).</li>
<li>Réu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lifespan+and+turnover+of+microglia+in+the+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">The lifespan and turnover of microglia in the human brain.</a> Cell Rep. 20 (4), 779-784 (2017).</li>
<li>Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., Tetzlaff, W., Rossi, F. M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+self-renewal+can+sustain+CNS+microglia+maintenance+and+function+throughout+adult+life%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Local self-renewal can sustain CNS microglia maintenance and function throughout adult life.</a> Nat Neurosci. 10 (12), 1538-1543 (2007).</li>
<li>Mildner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+the+adult+brain+arise+from+Ly-6ChiCCR2%2B+monocytes+only+under+defined+host+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Microglia in the adult brain arise from Ly-6ChiCCR2+ monocytes only under defined host conditions.</a> Nat Neurosci. 10 (12), 1544-1553 (2007).</li>
<li>Cook, Z. T., Brockway, N. L., Weissman, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+the+developing+brain+in+living+zebrafish+using+Brainbow+and+time-lapse+confocal+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualizing the developing brain in living zebrafish using Brainbow and time-lapse confocal imaging.</a> J Vis Exp. (157), e60593(2020).</li>
<li>Tayanloo-Beik, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+modeling+of+autism+spectrum+disorders%2C+current+status+and+future+prospective%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Zebrafish modeling of autism spectrum disorders, current status and future prospective.</a> Front Psychiatry. 13, 911770(2022).</li>
<li>D'Amora, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+an+innovative+tool+for+epilepsy+modeling%3A+State+of+the+art+and+potential+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as an innovative tool for epilepsy modeling: State of the art and potential future directions.</a> Int J Mol Sci. 24 (9), 7702(2023).</li>
<li>Langova, V., Vales, K., Horacek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+zebrafish+and+laboratory+rodents+in+schizophrenia+research%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">The role of zebrafish and laboratory rodents in schizophrenia research.</a> Front Psychiatry. 11, 549232(2020).</li>
<li>Chia, K., Klingseisen, A., Sieger, D., Priller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+a+model+organism+for+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as a model organism for neurodegenerative disease.</a> Front Mol Neurosci. 15, 940484(2022).</li>
<li>Astell, K. R., Sieger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+in+vivo+models+of+cancer+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Med%22%5BJournal%5D)">Zebrafish in vivo models of cancer and metastasis.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 10 (8), 037077(2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>מיכלי גידול 1 ליטר</td><td>Tecniplast</td><td>ZB10BTE</td><td></td></tr><tr><td>1-phenyl-2-thiourea (PTU)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629</td><td>מדולל ל-0.2 מ"מ ב-E3 למניעת פיגמנטציה של עובר</td></tr><tr><td>צלחת הדמיה מזכוכית תחתונה</td><td>FluoroDish</td><td>FD3510-100</td><td></td></tr><tr><td>חד פעמי פיפטת העברה מדורגת</td><td>avantor</td><td>16001-188</td><td></td></tr><tr><td>מחמם בלוק יבש</td><td>Novolab</td><td>גרנט QBD4</td><td>כדי לשמור על אגרוז נמס נמוך ב-37 מעלות; C</td></tr><tr><td>אתיל 3-אמינובנזואט מתאנסולפונאט (טריקאין)</td> <td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>E10521-50G</td><td></td></tr><tr><td>Imaris 10.0</td><td>Oxford Instruments</td><td></td><td>תוכנת ניתוח</td></tr><tr><td>ממיר קבצים Oxford</td><td>Instruments</td><td></td><td>https://imaris.oxinst.com/big-data</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי לסריקת לייזר</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti2-E</td><td></td></tr><tr><td>מתילן כחול</td><td>טיפים למיקרו-מעמיס Sigma-Aldrich</td><td>M9140-25G</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>NuSieve GTG Agarose</td><td>Lonza</td><td>&nbsp; 50081</td><td></td></tr><tr><td>צלחות פטרי (90 מ"מ)</td><td>אוונטור</td><td>391-0559</td><td></td></tr><tr><td>פרונזה</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>11459643001</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; מלקחיים מנירוסטה Dumont מס' 5</td><td>FineScienceTools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ סטריאו</td><td>Leica</td><td>Leica M80</td><td>כדי להרכיב את העוברים</td></tr><tr><td>מתגרה מחט</td><td>אוונטור</td><td>76549-024</td><td></td></tr></tbody></table>

הדמיה חיה ואפיון דינמיקה של תאי מיקרוגליה בעובר דג הזברה

Live Imaging and Characterization of Microglia Dynamics in the Zebrafish Embryo

תאי מיקרוגליאה המבטאים חלבון פלואורסצנטי ירוק (eGFP) ותאי אנדותל המבטאים DsRed ב-Tg(mpeg1:eGFPgl22; KDRL:CRES898; actb2:loxP-STOP-loxP-DsRedexpress,sd5) עוברים טרנסגניים משולשים14 צולמו ב 3 dpf, על פי הפרוטוקול המתואר. עובר בודד של דג זברה הורכב באגרוז נמס נמוך של 1% על צלחת זכוכית תחתונה ותהליך ההדמיה לא הפריע לגדילת העובר בזמן הרכישה. חלוף הזמן תועד באמצעות מערכת מסחרית לסריקה נקודתית של מיקרוסקופ קונפוקלי המצוידת בעדשת מטרה יבשה 10x 0.45 NA, ולייזרים עירור 488 ננומטר ו-561 ננומטר שימשו להדמיית תאי מיקרוגליה ואנדותל, בהתאמה. בנוסף, מרווח הזמן, רזולוציית התמונה, גודל הפיקסלים וצעד z היו 30 שניות, 1024x1024, 0.49 מיקרומטר ו-2.5 מיקרומטר, בהתאמה. הקלטת Timelapse נמשכה 3.5 שעות (שעה).
שדה הראייה הנרכש כיסה את כל ראש העובר, אך הניתוח התמקד במיוחד בטקטום האופטי, שכן במהלך השבוע הראשון להתפתחות, מיקרוגליה מוגבלת בעיקר לשכבת הסומה העצבית באזור זה של המוח התיכון הגבי, מה שמאפשר לחוקרים לדמיין את כל האוכלוסייה בו זמנית15. ניתוח המעקב התלת-ממדי בוצע באמצעות Imaris 10.0, כפי שהוסבר לעיל. כפי שניתן לראות באיור 4, המעקב היה מוצלח, והתוצאה הייתה 25 מסלולים, התואמים את המספר הצפוי של תאי מיקרוגליה הנמצאים בטקטום האופטי ב-3 dpf16. נדרש תיקון מסילה ידני מינימלי. איור 5 מציג דוגמה לנתונים שניתן לחלץ מניסוי מעקב מוצלח. התיוג הסימולטני של מקרופאגים ותאי אנדותל מאפשר לכמת את מיקום תאי המיקרוגליה ביחס לאחרון, ומאפשר לחוקרים לדמיין את המרחק היחסי של כל תא לתא האנדותל הקרוב ביותר בזמן ולבחון את התדירות והמספר של אינטראקציות פוטנציאליות (איור 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66533/66533fig01.jpg"> איור 1: סקירה כללית של הליך הניסוי. (A) הכנת עוברים של דגי זברה והרדמה. (B) הרכבה ומיקום לדוגמה. (ג) רכישת תמונה. (D) עיבוד תמונה וחילוץ נתוני תנועתיות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66533/66533fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66533/66533fig02.jpg"> איור 2: דימות מיקרוגליה ואינטראקציות עם הסביבה התאית במוח בעובר דג הזברה. (A) תמונת שדה בהיר של ראש ומוח של דג זברה עוברי 3 dpf (מבט גבי), המסמנת את הטקטום האופטי ואת המוח האחורי. מוחו של דג הזברה העוברי ניתן לצילום בשלמותו בשלב זה בשל גודלו הקטן ושקיפותו האופטית. (ב-ד) ניתן להמחיש מיקום והתנהגות של מיקרוגליה על ידי שימוש בקווים טרנסגניים כגון (B,C) Tg(mpeg1:eGFP)gl22 ו-(D) Tg(mpeg1:mcherry)gl23, והתמקדות ב-OT. (B) תאי עצב וגופי התא שלהם ניתנים לזיהוי באמצעות קו הדיווח Tg(XlTubb:D sRed)zf148, וניתן להמחיש אינטראקציות מיקרוגליה-נוירון על-ידי מיזוג שני הערוצים בקווים המבטאים יחד את שני הטרנסגנים. נראה מיזוג של האותות הירוק (מיקרוגליה) והאדום (נוירונים, במגנטה). (ג,ד) קווי כתב יכולים גם לשפוך אור על אינטראקציות מיקרוגליה (בירוק) עם תאי אנדותל, כאן מסומנים באדום באמצעות Tg כפול (kdrl:cres898; actb2:LOXP-STOP-LOXP-Dsredexpress, SD5) transgenics, או עם תאי גלייה כגון oligodendrocytes ומבשריהם, באמצעות (D) כפול Tg (olig2:EGFP; MPEG1:mcherry ) קו מהונדס. 1: אוליגודנדרוציטים ותאי אב ב- OT, 2: נוירונים eurydendroid במוח הקטן. פסי קנה מידה = 50 מיקרומטר. קיצורים: dpf = ימים לאחר ההפריה; OT = טקטום אופטי; HB = מוח אחורי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66533/66533fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66533/66533fig03.jpg"> איור 3: פער מורפולוגי ומרחבי בין מקרופאגים בעור לבין מיקרוגליה בעובר של דג זברה 3 dpf. (A,B) מבט גבי על עובר דג זברה Tg(mpeg1:eGFP)gl22 ב-3 dpf, המתאר (A) תאי מיקרוגליה פרנכימליים (מסומנים בכוכביות מגנטה) לעומת מקרופאגים עוריים (כוכביות לבנות), המזוהים על סמך מיקומם היחסי לאורך ציר z, כפי שניתן לראות ב-(B), המציג את התמונה התלת-ממדית בשחור-לבן המעובדת בקידוד צבע של ציר z. (ג,ד) מבט רוחבי על (C) A ו-(D) B, המציג את עומקי z של תאי mpeg1:eGFP+ בתוך ראש העובר ומדגיש את הלוקליזציה השטחית של מקרופאגים בעור בהשוואה לתאי מיקרוגליה. (ה-ק) הגדלה גבוהה של כל תא מסומנת על ידי כוכבית ב- A ו - B, המספקת הדמיה מפורטת של המורפולוגיה הייחודית בין מיקרוגליה אמבואידית (E-G) לבין מקרופאגים מאורכים בעור (H-K). מוטות קנה מידה = 30 מיקרומטר. קיצור: dpf = ימים לאחר ההפריה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66533/66533fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66533/66533fig04.jpg"> איור 4: מעקב אחר תאי מיקרוגליאה בעובר של דג זברה 3 dpf. (A) מבט גבי ראש של 3 dpf Tg (kdrl:cres898; ACTB2: LOXP-STOP-LOXP-Dsredאקספרס, SD5; mpeg1:eGFPgl22) עובר מהונדס משולש, המראה מיקרוגליה (ירוק) ואת עיבוד פני השטח של כלי הדם (מגנטה). (ב-ד) מעקב מייצג אחר תנועות מיקרוגליה בחלון זמן של 3.5 שעות (B). תאים בודדים נראים לעקוב אחר מסלולים מורכבים. (C) פרט מקיטוע זמן, המציג תצוגה מוגדלת של האזור ב-B התחום בריבוע מקווקו. שישה פריימים מהסרט (בהפרש של 45 דקות זה מזה) מוצגים, המתעדים תאי מיקרוגליה יוצרים קשרים חולפים עם תאי אנדותל במיקרו-סביבה שלהם. (D) מסלולים של נדידת תאי מיקרוגליאה בודדים בתוך הטקטום האופטי, כאשר צירי X, Y ו-Z מייצגים ממדים מרחביים. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. קיצור: dpf = ימים לאחר ההפריה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66533/66533fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66533/66533fig05.jpg"> איור 5: תצוגה חזותית של הנתונים המתקבלים. דוגמה לנתונים מרחביים שניתן לקבל באמצעות הפרוטוקול המתואר. הגרפים מתארים (A) את המהירות הממוצעת של תאי מיקרוגליה, (B) את המרחק הממוצע שהם מכסים בשעה אחת, (C) את התזוזה הריבועית הממוצעת שלהם, ו-(D) את התפלגות שלהם במרחב בזמנים שונים. עיבוד פני השטח של כלי השיט איפשר גם למדוד את המרחק הקצר ביותר בין תאי מיקרוגליה לתאי אנדותל בכל זמן נתון, הן ברמת (E) תא בודד והן כממוצע עולמי (F). עבור A, B ו- D, כל נקודה מייצגת תא בודד. N = עובר אחד. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66533/66533fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
קובץ משלים 1: <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66533/66533_20240306_SupplementalFile1%20(2).zip" target="_blank">אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.</a>

Microglia are highly dynamic cells and their migration and colonization of the brain parenchyma is a crucial step for proper brain development and ...

live-imaging-characterization-microglia-dynamics-zebrafish

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

בסרטון הזה, אנחנו מראים שיטה שבאמצעותה לנתח את המוח חוליות עוברי דג הזברה מתפתח לחיות ברזולוציה של תא בודד על ידי מיקרוסקופיה confocal. זה כולל את השיטה שבאמצעותה אנו מזריקים את העובר מתא בודד דג הזברה ולאחר מכן הר התמונה במוח המתפתח.

חיים הדמיה של המוח על ידי עוברי דג הזברה מיקרוסקופיה confocal

פרוטוקול זה מתאר הדמיה של נוירונים בודדים או תאים הרכס העצבי החיים עוברים דג הזברה. שיטה זו משמשת כדי לבחון התנהגויות הסלולר לוקליזציה אקטין פלואורסצנטי באמצעות מיקרוסקופיה confocal זמן לשגות.

הדמיה חיה של תנועתיות התא ואת cytoskeleton אקטין של נוירונים בודדים לבין תאים קרסט עצבית בעוברים דג הזברה

מפתח להבנת תהליכים המוךפו"גנטי שהולך המעצבים את העובר המוקדם הוא היכולת תאים תמונה ברזולוציה גבוהה. אנו מתארים כאן טכניקה תיוג תאים בודדים או קבוצות קטנות של תאים עוברי דג הזברה שלם עם חלבון הממברנה ממוקד, פלורסנט ירוק.

סימון תאים הדמיה למוח האחורי של דג הזברה

מקור: ניו, ל. ואחרים. הדמיה של מוות תאי ליז של מקרופאגים במהלך זיהום מיקובקטריאלי בעוברי דגי זברה באמצעות מיקרוסקופיה תוך-חיונית. J. Vis. Exp. (2019)סרטון זה מדגים את השימוש במיקרוסקופיה קונפוקלית תוך-חיונית כדי להמחיש מוות תאי ליז של מקרופאגים בעוברי דגי זברה לאחר זיהום Mycobacterium marinum .

הדמיה חיה של מוות תאי מקרופאג במהלך זיהום מיקובקטריאלי בעוברי דגי זברה

סרטון זה מדגים בדיקת ספיגת נוגדנים לאיתות Notch/DeltaD באבות גליה רדיאלית של דגי זברה. היא כוללת הרכבה של עוברי דגי זברה דכוריוניים משובצים באגרוז, הזרקת תמיסת צבע המכוונת לליגנדות DeltaD על RGPs, והדמיה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי לחלוקת תאים אסימטרית המאשרת את הפעלת האיתות Notch/DeltaD.

בדיקת ספיגת נוגדנים לאיתות חריץ הדמיה / DeltaD באבות גליה רדיאלית של דגי זברה

מקור: Lahne, M., et.al. תרבית של צמחי רשתית של דג זברה טרנסגני בוגר להדמיית תאים חיים על ידי מיקרוסקופ מולטיפוטון. J. Vis. Exp. (2017)סרטון זה מדגים הדמיה של תא חי של נדידת גרעין גליה של מולר באקספלנטים של רשתית דג הזברה המשובץ באגרוז בעקבות נזק לקולטני אור המושרה על ידי אור. גורם נמק גידול-אלפא (TNF-α) המשתחרר על ידי קולטני אור פגומים מפעיל תאי גליה של מולר, ומפעיל נדידה גרעינית דרך השכבות הגרעיניות הפנימיות והחיצוניות למיטוזה ויצירת אבות עצביים. התמונות שצולמו חושפות את הדינמיקה של הגירה...

הדמיית תאים חיים של נדידת גרעין גליית מולר במהלך התחדשות רשתית דג הזברה

הדמיית ההתנהגות הדינמית של אברונים ומבנים תת-תאיים אחרים in vivo יכולה לשפוך אור על תפקודם במצבים פיזיולוגיים ומחלות. כאן, אנו מציגים שיטות לתיוג גנטי של שני אברונים, צנטרוזומים ומיטוכונדריה, והדמיית הדינמיקה שלהם בעוברי דג זברה חיים באמצעות מיקרוסקופיה רחבת שדה וקונפוקלית.

הדמית מבני subcellular בעובר דג הזברה החייה

שילוב של טכניקות אופטי מתקדם של סריקת מיקרוסקופ עם זמן עירור קרינה פלואורסצנטית פוטון מרובה אורך גל לייזר בוצע כדי ללכוד דימות ברזולוציה גבוהה, תלת מימדי, בזמן אמת של הרכס העצבי הגירה ב Tg (sox10:EGFP) ו- Tg (foxd3:GFP) דג זברה עוברי.

פוטון רב זמן לשגות הדמיה כדי להמחיש את התפתחות בזמן אמת: ויזואליזציה של העברת תאי הרכס העצבי עוברי דג זברה

Microinjection של דג זברה עוברי וזחלים היא טכניקה חיונית ומאתגרת המשמשים דגמים רבים של דג זברה. כאן, אנו מציגים מגוון רחב של כלים microscale כדי לסייע ייצוב והכיוון של דג זברה הן microinjection והן הדמיה.

Microstructured מכשירי Microinjection אופטימיזציה והדימות של הזחלים דג זברה

אנו מדווחים על טכניקה המאפשרת הדמיה חיה של דינמיקה של מיקרוטובולים בתאי גליובלסטומה (GBM) הפולשים לרקמת מוח של בעלי חוליות. צימוד ההזרקה האורתוטופית של תאי GBM המתויגים באופן פלואורסצנטי למוח שקוף של דגי זברה עם הדמיה תוך-חיונית ברזולוציה גבוהה מאפשר מדידה של דינמיקת השלד הציטוסקולרי במהלך פלישת סרטן באתרו .

הדמיה חיה של דינמיקת מיקרוטובולים בתאי גליובלסטומה הפולשים למוח דג הזברה

מוצג כאן פרוטוקול להדמיית מוח שלם in vivo של דגי זברה זחלים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי תלת ממדי. הליך הניסוי כולל הכנת דגימה, רכישת תמונה והדמיה.

ב Vivo הדמיה מוחית שלמה של זחלי דגי זברה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי תלת מימדי

למד אפיון דינמיקה של תאי מיקרוגליה בעובר דג הזברה באמצעות מיקרוסקופיית קונפוקלית מהירה. פרוטוקול זה מאפשר ניתוח בזמן אמת של תנועת התאים והתפתחות המוח.

הדמיה חיה ואפיון דינמיקה של תאי מיקרוגליה בעובר דג הזברה

גלה סרטונים נוספים