Name: חיזוי ואימות מטרות חלבונים של תרכובת מולקולות קטנות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: למד שיטה לחיזוי ואימות אינטראקציות בין מולקולות קטנות למטרות חלבוניות באמצעות docking מולקולרי ו-TSA. הפרוטוקול משפר שחזוריות ומפחית עלויות בביוכימיה וביולוגיה מבנית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82004031) ותוכנית המדע והטכנולוגיה של סצ'ואן (2022NSFSC1303). אנו מביעים את הערכתנו הרבה לג'יה-יי סון במכון החדשני לרפואה סינית ורוקחות, אוניברסיטת צ'נגדו לרפואה סינית מסורתית, על הסיוע בכתם המערבי.

אימות אינטראקציה של Xanthatin-Keap1 עם עגינה ו-CETSA

<ol><li>Soleymani, F., Paquet, E., Viktor, H., Michalowski, W., Spinello, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-protein+interaction+prediction+with+deep+learning%3A+A+comprehensive+review%5BTitle%5D)+AND+%22Computat+Struct+Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Protein-protein interaction prediction with deep learning: A comprehensive review.</a> Computat Struct Biotechnol J. 20, 5316-5341 (2022).</li>
<li>Du, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+protein-ligand+interactions%3A+mechanisms%2C+models%2C+and+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Insights into protein-ligand interactions: mechanisms, models, and methods.</a> Int J Mol Sci. 17 (2), 144(2016).</li>
<li>Wu, Q., Peng, Z., Zhang, Y., Yang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COACH-D%3A+improved+protein-ligand+binding+sites+prediction+with+refined+ligand-binding+poses+through+molecular+docking%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">COACH-D: improved protein-ligand binding sites prediction with refined ligand-binding poses through molecular docking.</a> Nucleic Acids Res. 46, W438-W442 (2018).</li>
<li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PROBselect%3A+accurate+prediction+of+protein-binding+residues+from+proteins+sequences+via+dynamic+predictor+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinfo%22%5BJournal%5D)">PROBselect: accurate prediction of protein-binding residues from proteins sequences via dynamic predictor selection.</a> Bioinfo. 36, i735-i744 (2020).</li>
<li>Kandel, J., Tayara, H., Chong, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PUResNet%3A+prediction+of+protein-ligand+binding+sites+using+deep+residual+neural+network%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cheminfo%22%5BJournal%5D)">PUResNet: prediction of protein-ligand binding sites using deep residual neural network.</a> J Cheminfo. 13 (1), 65(2021).</li>
<li>Dhakal, A., Mckay, C., Tanner, J. J., Cheng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+intelligence+in+the+prediction+of+protein-ligand+interactions%3A+recent+advances+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Brief+Bioinform%22%5BJournal%5D)">Artificial intelligence in the prediction of protein-ligand interactions: recent advances and future directions.</a> Brief Bioinform. 23 (1), 476(2022).</li>
<li>Hatty, C. R., Banati, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-ligand+and+membrane-ligand+interactions+in+pharmacology%3A+the+case+of+the+translocator+protein+%28TSPO%29%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Res%22%5BJournal%5D)">Protein-ligand and membrane-ligand interactions in pharmacology: the case of the translocator protein (TSPO).</a> Pharmacol Res. 100, 58-63 (2015).</li>
<li>Chaires, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calorimetry+and+thermodynamics+in+drug+design%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">Calorimetry and thermodynamics in drug design.</a> Ann Rev Biophys. 37, 135-151 (2008).</li>
<li>Huang, S. Y., Zou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+and+challenges+in+protein-ligand+docking%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mo+Sci%22%5BJournal%5D)">Advances and challenges in protein-ligand docking.</a> Int J Mo Sci. 11 (8), 3016-3034 (2010).</li>
<li>Li, J., Fu, A., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+scoring+functions+used+for+protein-ligand+interactions+in+molecular+docking%5BTitle%5D)+AND+%22Interdiscip+Sci%22%5BJournal%5D)">An overview of scoring functions used for protein-ligand interactions in molecular docking.</a> Interdiscip Sci. 11 (2), 320-328 (2019).</li>
<li>Crampon, K., Giorkallos, A., Deldossi, M., Baud, S., Steffenel, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Machine-learning+methods+for+ligand-protein+molecular+docking%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today%22%5BJournal%5D)">Machine-learning methods for ligand-protein molecular docking.</a> Drug Discov Today. 27 (1), 151-164 (2022).</li>
<li>Pinzi, L., Rastelli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+docking%3A+Shifting+paradigms+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Molecular docking: Shifting paradigms in drug discovery.</a> Int J Mol Sci. 20 (18), 4331(2019).</li>
<li>Abdolmaleki, A., Ghasemi, F., Ghasemi, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer-aided+drug+design+to+explore+cyclodextrin+therapeutics+and+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol+Drug+Des%22%5BJournal%5D)">Computer-aided drug design to explore cyclodextrin therapeutics and biomedical applications.</a> Chem Biol Drug Des. 89 (2), 257-268 (2017).</li>
<li>Chen, G., Seukep, A. J., Guo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+molecular+docking+for+the+research+and+discovery+of+potential+marine+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Mar+Drugs%22%5BJournal%5D)">Recent advances in molecular docking for the research and discovery of potential marine drugs.</a> Mar Drugs. 18 (11), 545(2020).</li>
<li>Li, T., Guo, R., Zong, Q., Ling, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+molecular+docking+in+elaborating+molecular+mechanisms+and+interactions+of+supramolecular+cyclodextrin%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr+Polym%22%5BJournal%5D)">Application of molecular docking in elaborating molecular mechanisms and interactions of supramolecular cyclodextrin.</a> Carbohydr Polym. 276, 118644(2022).</li>
<li>Martinez Molina, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+drug+target+engagement+in+cells+and+tissues+using+the+cellular+thermal+shift+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay.</a> Science. 341 (6141), 84-87 (2013).</li>
<li>Tu, Y., Tan, L., Tao, H., Li, Y., Liu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CETSA+and+thermal+proteome+profiling+strategies+for+target+identification+and+drug+discovery+of+natural+products%5BTitle%5D)+AND+%22Phytomedicine%22%5BJournal%5D)">CETSA and thermal proteome profiling strategies for target identification and drug discovery of natural products.</a> Phytomedicine. 116, 154862(2023).</li>
<li>Dai, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Horizontal+cell+biology%3A+Monitoring+global+changes+of+protein+interaction+states+with+the+proteome-wide+cellular+thermal+shift+assay+%28CETSA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Horizontal cell biology: Monitoring global changes of protein interaction states with the proteome-wide cellular thermal shift assay (CETSA).</a> Annu Rev Biochem. 88, 383-408 (2019).</li>
<li>Lade, D. M., Nicoletti, R., Mersch, J., Agazie, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+synthesis+of+improved+active-site+SHP2+inhibitors+with+anti-breast+cancer+cell+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Design and synthesis of improved active-site SHP2 inhibitors with anti-breast cancer cell effects.</a> Eur J Med Chem. 247, 115017(2023).</li>
<li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+chemical-structure+TPOR+agonist%2C+TMEA%2C+promotes+megakaryocytes+differentiation+and+thrombopoiesis+via+mTOR+and+ERK+signalings%5BTitle%5D)+AND+%22Phytomedicine%22%5BJournal%5D)">Novel chemical-structure TPOR agonist, TMEA, promotes megakaryocytes differentiation and thrombopoiesis via mTOR and ERK signalings.</a> Phytomedicine. 110, 154637(2023).</li>
<li>Mateus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermal+proteome+profiling+for+interrogating+protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">Thermal proteome profiling for interrogating protein interactions.</a> Mol Syst Biol. 16 (3), 9232(2020).</li>
<li>Sanchez, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+cellular+thermal+shift+assay+to+monitor+target+engagement%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Real-time cellular thermal shift assay to monitor target engagement.</a> ACS Chem Biol. 17 (9), 2471-2482 (2022).</li>
<li>Tolvanen, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+advances+in+CETSA%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Biosci%22%5BJournal%5D)">Current advances in CETSA.</a> Front Mol Biosci. 9, 866764(2022).</li>
<li>Liu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xanthatin+inhibits+STAT3+and+NF-%CE%BAB+signalling+by+covalently+binding+to+JAK+and+IKK+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Xanthatin inhibits STAT3 and NF-κB signalling by covalently binding to JAK and IKK kinases.</a> J Cell Mol Med. 23 (6), 4301-4312 (2019).</li>
<li>Liu, Y., Chen, W., Zheng, F., Yu, H., Wei, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xanthatin+alleviates+LPS-Induced+inflammatory+response+in+RAW264.7+macrophages+by+Inhibiting+NF-%CE%BAB%2C+MAPK+and+STATs+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Xanthatin alleviates LPS-Induced inflammatory response in RAW264.7 macrophages by Inhibiting NF-κB, MAPK and STATs activation.</a> Molecules. 27 (14), 4603(2022).</li>
<li>Dinkova-Kostova, A. T., Kostov, R. V., Canning, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keap1%2C+the+cysteine-based+mammalian+intracellular+sensor+for+electrophiles+and+oxidants%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Keap1, the cysteine-based mammalian intracellular sensor for electrophiles and oxidants.</a> Arch Biochem Biophys. 617, 84-93 (2017).</li>
<li>Tabana, Y., Babu, D., Fahlman, R., Siraki, A. G., Barakat, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+identification+of+small+molecules%3A+An+overview+of+the+current+applications+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Target identification of small molecules: An overview of the current applications in drug discovery.</a> BMC Biotechnol. 23 (1), 44(2023).</li>
<li>Schenone, M., Dančík, V., Wagner, B. K., Clemons, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+identification+and+mechanism+of+action+in+chemical+biology+and+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Target identification and mechanism of action in chemical biology and drug discovery.</a> Nat Chem Biol. 9 (4), 232-240 (2013).</li>
<li>Hughes, J. P., Rees, S., Kalindjian, S. B., Philpott, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+early+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Principles of early drug discovery.</a> Br J Pharmacol. 162 (6), 1239-1249 (2011).</li>
<li>Chakraborty, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+protein+drug+targets+landscape%3A+A+potential+pharmacological+insight+view+for+the+new+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Clin+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 protein drug targets landscape: A potential pharmacological insight view for the new drug development.</a> Expert Rev Clin Pharmacol. 14 (2), 225-238 (2021).</li>
<li>Ziegler, S., Pries, V., Hedberg, C., Waldmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+identification+for+small+bioactive+molecules%3A+Finding+the+needle+in+the+haystack%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Target identification for small bioactive molecules: Finding the needle in the haystack.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 52 (10), 2744-2792 (2013).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+effective+identification+of+drug+targets+at+the+proteome+level+by+pH-dependent+protein+precipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Sci%22%5BJournal%5D)">Highly effective identification of drug targets at the proteome level by pH-dependent protein precipitation.</a> Chem Sci. 13 (42), 12403-12418 (2022).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+thermal+proteome+profiling+approach+to+screen+protein+targets+of+a+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">A simplified thermal proteome profiling approach to screen protein targets of a ligand.</a> Proteomics. 20, 1900372(2020).</li>
<li>Hou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salidroside+intensifies+mitochondrial+function+of+CoCl2-damaged+HT22+cells+by+stimulating+PI3K-AKT-MAPK+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Phytomedicine%22%5BJournal%5D)">Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway.</a> Phytomedicine. 109, 154568(2022).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salidroside%2C+a+phenyl+ethanol+glycoside+from+Rhodiolacrenulata%2C+orchestrates+hypoxic+mitochondrial+dynamics+homeostasis+by+stimulating+Sirt1%2Fp53%2FDrp1+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ethnopharmacol%22%5BJournal%5D)">Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiolacrenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling.</a> J Ethnopharmacol. 293, 115278(2022).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

זיהוי מטרות המחלה וגילוי ופיתוח תרופות קשורים קשר הדוק27. על ידי מיקוד מדויק במטרות ספציפיות, ניתן לפתח תרופות מועמדות לטיפול יעיל יותר במחלות מסוימות תוך מזעור תופעות הלוואי הקשורות לתרופות28,29. המטרות הנפוצות ביותר הן מטרות חלבון30. עם זאת, זיהוי מטרות חלבון מיוחדות מציב אתגר עצום בשל המגוון הרחב של חלבונים בתוך תאים30,31. במאמר זה אימצנו גישה המשלבת עגינה מולקולרית עם CETSA כדי לזהות ולאמת מטרות חלבוניות. התוצאות חשפו אינטראקציה ישירה בין קסנטטין לחלבון Keap1. שילוב של טכנולוגיית מחשב וניסויים ביולוגיים יכול לשמש גם בחקירה של תרופות אחרות ומטרות חלבון כדי לוודא את נוכחותה של אינטראקציה ישירה בין התרופה לבין המטרה. גישה זו, המשלבת חיזוי עם אימות, מפחיתה ביעילות הן את צריכת הזמן והן את העלויות הכלכליות. יתר על כן, המכשירים והחומרים הניסיוניים קלים להשגה, ותהליך התפעול אינו מסובך. לבסוף, דגימות CETSA קלות להכנה ולבדיקה בשיטת הכתם המערבי, המבטיחה את יכולת השחזור של הדגימות.
מניסיוננו, ישנם מספר היבטים קריטיים הדורשים תשומת לב מיוחדת במהלך הליכי ניסוי. ראשית, חיוני לבחור את המבנה הגבישי של החלבון שנפתר על ידי ניתוח קרני רנטגן בעת בחירת מבנה החלבון לפני עגינה מולקולרית. שנית, צפיפות התאים וזמן הקפאה/הפשרה הם גורמים מכריעים בניסויי CETSA. תאים בשלב הגידול הלוגריתמי צריכים להיבחר לניסויי CETSA מכיוון שמצב הצמיחה שלהם יציב ויש לו השפעה מינימלית על תוצאות הניסוי. במהלך הקפאה והפשרה חוזרות ונשנות של תאים, התזמון צריך להיות מבוקר היטב עם חנקן נוזלי המשמש להקפאה עד להיווצרות מוצק לבן, ולאחר מכן הפשרה מיידית בטמפרטורת החדר לפני מחזורי ההקפאה הבאים. לבסוף, יש להשלים את ניסויי הכתם המערבי מיד לאחר הכנת דגימות CETSA כדי למנוע פירוק חלבונים.
עגינה מולקולרית ו- CETSA הן טכניקות מבוססות היטב הממלאות תפקיד מכריע בתחום פיתוח התרופות. עגינה מולקולרית מסייעת בחיזוי אינטראקציות ברמה מולקולרית בין תרכובות לבין מטרותיהן, ומציעה תובנות חשובות לגבי מצבי קישור פוטנציאליים10,11. CETSA, לעומת זאת, מתמקד בהערכת ההשפעה של תרופות על יציבות תרמית של חלבונים ומשמש כלי לאימות אינטראקציות בין תרופותלחלבונים 17. בעוד CETSA היא שיטה פשוטה יחסית לאימות, היא גם דרך תפוקה נמוכה על ידי שימוש בכתם מערבי לחקר שינוי תרמי של קומפלקס חלבון תרופה, וזה לא צריך להיות הטכניקה היחידה להסתמך על. בנוסף, השלבים של CETSA הם מסובכים, וכל שגיאות צעד במהלך המבצע יכול להיות בעל השפעה רבה על התוצאות. יתר על כן, שיטת CETSA אינה יכולה לקבוע את אתר הקישור הספציפי ואת אופן הקישור של התרכובת ליעד החלבוני ואינה יכולה לציין אם הקישור הוא קוולנטי או לא קוולנטי 17,18,23. מעבר לבדיקת שינוי תרמי, סוגים אחרים של בדיקות אנרגטיות, כגון משקעים חלבוניים תלויי pH (pHDPP), יכולים לשמש גם לחקר אינטראקציות ליגנד-חלבון32. יתר על כן, פרופיל פרוטאום תרמי הוא שיטה מבוססת אנרגיה לחשיפת אינטראקציות ליגנד-חלבון, המאפשרת ניתוח בקנה מידה גדול בתפוקה גבוהה של אינטראקציות חלבון-תרופה על ידי שילוב פרוטאומיקה עם CETSA33.
בנוסף, תהודה פלסמונית פני שטח מקומית (LSPR) יכולה לספק ניתוח איכותי וכמותי נוסף34,35. הוא לא רק קובע את קיומן של אינטראקציות בין תרופה למטרה שלה, אלא גם מודד את פרמטרי הזיקה והפרמטרים הקינטיים של אינטראקציות בין-מולקולריות אלה, ומציע הבנה מקיפה יותר.
מעבר לבדיקת שינוי תרמי, משקעים חלבוניים תלויי pH (pHDPP) יכולים לשמש גם לחקר אינטראקציות ליגנד-חלבון32. עגינה מולקולרית היא שיטת סימולציה מבוססת פיזיקו-מכניקה לחיזוי אינטראקציות בין מולקולות קטנות לביומולקולות. שיטה זו שואפת להשיג קשירה על ידי אופטימיזציה של קונפורמציה וכיוון של מולקולות קטנות כדי לייצר את המשלימות הטובה ביותר בינן לבין ביומולקולות. חיזוי מטרה משתמש בטכניקות בינה מלאכותית כדי לחזות את אתרי הקישור בין מולקולות קטנות לביומולקולות. לשתי הגישות יש הבדלים מרכזיים ביישום השיטה ובדיוק החיזוי. יישום השיטה: עגינה מולקולרית משמשת בעיקר לתכנון ואופטימיזציה של תרופות, ומספקת בסיס תיאורטי לגילוי תרופות חדשות. חיזוי מטרות, בעזרת בינה מלאכותית מתקדמת יותר, מיושם לעתים קרובות יותר לסינון בתפוקה גבוהה ולגילוי מהיר של תרכובות עופרת כדי לשפר את יעילות גילוי התרופות. דיוק החיזוי: מכיוון שהעגינה המולקולרית מבוססת על סימולציות פיזיקליות, דיוק החיזוי שלה גבוה יותר, אך גם העלות החישובית גבוהה יחסית. בעוד לחיזוי מטרות יש עלות חישובית נמוכה יותר, דיוק החיזוי תלוי בשפע נתוני האימון ובבחירת המודל.

חלבונים הם מקרומולקולות חשובות ביותר באורגניזמים חיים ויש להם מגוון רחב של פונקציות ייחודיות בתוך התאים, כגון הרכב הממברנה, היווצרות שלד ציטו-שלד, פעילות אנזימים, תחבורה, איתות תאי, ומעורבות במנגנונים תוך-תאיים וחוץ-תאיים 1,2,3. חלבונים מבטאים את תפקידיהם הביולוגיים בעיקר באמצעות אינטראקציות ספציפיות עם מגוון מולקולות, כולל חלבונים אחרים, חומצות גרעין, ליגנדות של מולקולות קטנות ויוני מתכת 1,4. ליגנדות הן תרכובות מולקולריות קטנות שנקשרות באופן ספציפי לחלבונים באורגניזם. האינטראקציה בין חלבונים לליגנדות מתרחשת באתרים ספציפיים על החלבון, הנקראים אתרי הקשירה, הידועים גם בשם כיסי הקישור5. במחקר כימיה תרופתית, ההתמקדות היא בזיהוי חלבוני מפתח הקשורים בבירור למחלות, המשמשים מטרות לתרופות6. לכן, הבנה מעמיקה של אתרי הקישור בין חלבונים לליגנדות היא בעלת חשיבות עליונה בקידום גילוי, תכנון ומחקר של תרופות 7,8.
עגינה מולקולרית היא כלי חישובי נפוץ לחקר קשירת ליגנד חלבון, המשתמש במבנים תלת-ממדיים של חלבונים וליגנדים כדי לחקור את מצבי הקישור והזיקות העיקריים שלהם בעת יצירת קומפלקסים יציבים 9,10,11. היישום של טכנולוגיית עגינה מולקולרית מקורו בשנות השבעים. בהתבסס על עקרון זיווג המנעול והמפתח ותוך שימוש באלגוריתמים של תוכנות עגינה מולקולריות, ניתן לקבוע את האינטראקציה בין תרכובות ומטרות מולקולריות על ידי ניתוח תוצאות העגינה. גישה זו מאפשרת חיזוי של אתרי קישור פעילים הן עבור התרכובת והן עבור מולקולת המטרה. כתוצאה מכך, הוא מאפשר זיהוי של קונפורמציית קישור אופטימלית (הנקראת כאן מודל הקשירה) עבור אינטראקציות ליגנד-קולטן, שהיא חיונית להבנת המכניקה של התקשרויות מולקולריות אלה 12,13,14,15. בעוד עגינה מולקולרית מספקת תחזיות מבוססות מחשב יקרות ערך של אינטראקציות ליגנד-קולטן, חשוב לציין כי מדובר בממצאים ראשוניים. כתוצאה מכך, אימות ניסיוני נוסף חיוני כדי לאשר אינטראקציות אלה.
בדיקת השינוי התרמי התאי (CETSA), שהוצעה לראשונה על ידי צוות המחקר של פאר נורדלונד בשנת 2013, משמשת כשיטה לאימות אינטראקציות חלבון מטרה לתרופה. טכניקה זו בודקת באופן ספציפי את היציבות התרמית של חלבוני מטרה המושרים על ידי קשירת תרופות, ומספקת גישה מעשית לאישור אינטראקציות מולקולריות 16,17,18. גישה זו מבוססת על העיקרון הבסיסי שקשירת ליגנדים יוצרת שינוי תרמי בתוך חלבוני המטרה וישימה למגוון רחב של דגימות ביולוגיות, כולל ליזטים של תאים, תאים חיים שלמים ורקמות19,20. CETSA תומך במעורבות מטרה ישירה של מולקולות קטנות בתאים שלמים על ידי גילוי ייצוב תרמודינמי של חלבונים עקב קשירת ליגנד וקישור התגובה הפנוטיפית שנצפתה לתרכובת המטרה21,22. בין המתודולוגיות השונות הנגזרות מ- CETSA, Western Blot-CETSA (WB-CETSA) נחשבת לגישה קלאסית. לאחר הכנת הדגימה בשיטת CETSA, נעשה שימוש בניתוח כתמים מערביים כדי לזהות שינויים ביציבות התרמית של חלבון המטרה. זה מאפשר קביעה מדויקת של אינטראקציות תרופה-חלבון בתוך מערכות תאיות17,23.
Xanthatin הוא תרכובת ביו-אקטיבית מבודדת מן הצמח Xanthium L. עם תכונות כגון אנטי דלקתיות, אשר שימש ברפואה הסינית המסורתית לטיפול במחלות כמו סינוסיטיס האף ודלקת פרקים24,25. חלבון 1 הקשור ל-ECH דמוי קלך (Keap1) הוא מרכיב של קומפלקס חלבונים רב-יחידות מבוסס Cullin-RING E3 Ubiquitin ligase Multi-subunit ומווסת חשוב של הומאוסטזיס חיזור תוך-תאי, המשפיע על עוצמת ומשך התגובה הדלקתית על ידי ויסות מצב חמצון-חיזור תוך-תאי26. במחקר זה השתמשנו לראשונה בעגינה מולקולרית כדי לחקור את האינטראקציה בין קסנטטין (מולקולה קטנה) וחלבון Keap1, במטרה לחזות את מצב הקישור שלהם. לאחר מכן, השתמשנו בשיטת CETSA כדי לאמת אינטראקציה זו על ידי הערכת ההשפעה של קסנטטין על היציבות התרמית של חלבון Keap1.

<table><tbody><tr><td>0.45 &mu; m ממברנת פלואוריד פוליווינילידן</td><td>Millipore</td><td>PR05509</td><td></td></tr><tr><td>אתנול נטול מים</td><td>כימיקלים Chron</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר</td><td>BioFroxx</td><td>4240GR100</td><td></td></tr><tr><td>תערובות מעכבי פרוטאז בספקטרום רחב</td><td>Boster Biological Technology Co., Ltd</td><td>AR1193</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Boster Biological Technology Co., Ltd</td><td>PYG0040</td><td></td></tr><tr><td>מגיב כימילומינסנציה משופר</td><td>Beyotime Biotechnology Co., Ltd</td><td>P0018S</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH נוגדן</td><td>ProteinTech Group Co., Ltd</td><td>10494-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>ג'ל הדמיה</td><td>מכשיר E-BLOT</td><td>Touch Imager Pro</td><td></td></tr><tr><td>שיפוע PCR מכשיר</td><td>Biometra TADVANCED</td><td>Biometra Tadvanced 96SG</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה הקפאה במהירות גבוהה</td><td>בקמן קולטר</td><td>אלגרה X-30R</td><td></td></tr><tr><td>חזרת מצומד פרוקסידאז נוגדן עזים טהור</td><td>ProteinTech Group Co., Ltd</td><td>SA00001-2</td><td></td></tr><tr><td>איזופרופיל אלכוהול&nbsp;</td><td>כימיקלים Chron</td><td>67-63-0</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן Keap1</td><td>Zen BioScience Co., Ltd</td><td>R26935</td><td></td></tr><tr><td>אמבט מתכת</td><td>Analytik Jena</td><td>TSC</td><td></td></tr><tr><td>מתנול</td><td>כימיקלים</td><td>Chron 67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>Ncmblot מאגר העברה מהירה (20&)</td><td>NCM ביוטק ושות', בע"מ</td><td>WB4600</td><td></td></tr><tr><td>Omni-Easy OneStep PAGE ג'ל הכנה מהירה kie</td><td>Epizyme Biotech Co., Ltd</td><td>PG212</td><td></td></tr><tr><td>פוספט מאגר מלח</td><td>Boster Biological Technology Co., Ltd</td><td>PYG0021</td><td></td></tr><tr><td>סמן חלבון צבע מוכתם</td><td>, Biosharp&nbsp;</td><td>BL741A</td><td></td></tr><tr><td>מערכת אלקטרופורזה לספיגת חלבון</td><td>Bio-Rad</td><td>MiniPROTEAN&Ograve; Tetra Cell</td><td></td></tr><tr><td>RAW264.7 תא</td><td>Beyotime Biotechnology Co., Ltd</td><td>C7505</td><td></td></tr><tr><td>RAW264.7 מדיום ספציפי לתא</td><td>Procell Life Science& טכנולוגיה ושות', בע"מ</td><td>CM-0597</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE מאגר טעינת חלבון</td><td>בוסטר ביולוגי טכנולוגיה ושות', בע"מ</td><td>AR1112-10</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE ריצה אבקת חיץ</td><td>Servicebio</td><td>G2018</td><td></td></tr><tr><td>Tris חוצץ אבקת מלח</td><td>Servicebio</td><td>G0001</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>BioFroxx</td><td>1247ML100</td><td></td></tr><tr><td>אמבט מים</td><td>Memmert</td><td>מטהר מים WNE10</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Millipore</td><td>Milli- IQ 7005</td><td></td></tr><tr><td>Xanthatin</td><td>ChemConst Biotechnology Co., Ltd</td><td>CONST210706</td><td></td></tr></tbody></table>

חיזוי ואימות מטרות חלבונים של תרכובת מולקולות קטנות

Protein Target Prediction and Validation of Small Molecule Compound

חלבונים הם בסיסיים לפיזיולוגיה האנושית, כאשר המטרות שלהם הן קריטיות במחקר ופיתוח תרופות. זיהוי ותיקוף של מטרות חלבון חיוניות הפכו לחלק בלתי נפרד מפיתוח תרופות. עגינה מולקולרית היא כלי חישובי הנמצא בשימוש נרחב כדי לחקור קשירת ליגנד חלבון, במיוחד בהקשר של אינטראקציות מטרה בין תרופות וחלבונים. לצורך אימות ניסיוני של הקשירה וכדי לגשת ישירות לקשירת התרופה ומטרתה, נעשה שימוש בשיטת בדיקת השינוי התרמי התאי (CETSA). מחקר זה נועד לשלב עגינה מולקולרית עם CETSA כדי לחזות ולאמת אינטראקציות בין תרופות ומטרות חלבון חיוניות. באופן ספציפי, חזינו את האינטראקציה בין קסנטטין לחלבון Keap1, כמו גם את מצב הקישור שלו באמצעות ניתוח עגינה מולקולרית, ולאחר מכן אימות של האינטראקציה באמצעות בדיקת CETSA. התוצאות שלנו הראו כי קסנטטין יכול ליצור קשרי מימן עם שאריות חומצות אמינו ספציפיות של חלבון Keap1 ולהפחית את היציבות התרמית של חלבון Keap1, מה שמצביע על כך שקסנטטין יכול לקיים אינטראקציה ישירה עם חלבון Keap1.

ניתוח עגינה מולקולרית ניבא את האינטראקציה בין קסנטטין לחלבון Keap1. איור 2 מדגים היווצרות קשרי מימן בין שאריות קסנטטין וחומצות אמינו Gly-367 ו-Val-606 של חלבון Keap1, עם אורך קשר מימן של 2.17 Å עבור Gly-367 ו-2.13 Å עבור Val-606. בנוסף, ציון העגינה המחושב של -5.69 קק"ל/מול מסמל זיקה טובה בין קסנטטין לחלבון Keap1.
שיטת CETSA הראתה כי קשירת קסנטטין שינתה את היציבות התרמית של חלבון Keap1, ואישרה את האינטראקציה בין קסנטטין לחלבון Keap121. איור 3 מצביע על כך שקסנטטין משנה באופן מדהים את היציבות התרמית של חלבון Keap1 בטווח הטמפרטורות של 48°C עד 57°C, בהשוואה לקבוצת DMSO. כדי להבטיח העמסת דגימות שווה, ראשית, צפיפות החיסון התאית שבה ביצענו את הניסויים הייתה עקבית; שנית, דגימות התאים מקבוצת DMSO ומקבוצת הקסנטטין עורבבו היטב בצלחות תרבית התאים ולאחר מכן חולקו באופן שווה לשני צינורות מיקרוצנטריפוגה, שהבטיחו את הכמות העקבית של דגימות התא, ונפח הסופרנאטנט שנוסף לכל צינור PCR היה 60 μL, ולבסוף, הנפח של כל דגימה שהועלתה בכתם המערבי היה 20 μL, מה שהבטיח העמסה שווה לדגימות מחוממות. פירוק חלבונים בדגימות מסביבות 51 מעלות צלזיוס נובע בעיקר משינויים במבנה החלבון ותגובות כימיות מואצות הנגרמות על ידי טמפרטורות גבוהות. התוצאות לעיל מראות כי קסנטטין יכול להיקשר ישירות לחלבון Keap1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66564/66564fig01.jpg"> איור 1: סדר ההעמסה של כתם מערבי. הטמפרטורה לפי הסדר משמאל לימין הייתה 45 °C (75 °F), 48 °C (75 °F), 51 °C (75 °F), 54 °C (57 °F), 60 °C (60 °F) ו- 63 °C (63 °F).  הנתיב הראשון נוסף עם טוש; שני נתיבים שימשו לכל טמפרטורה; הנתיב הראשון היה קבוצת DMSO, והנתיב השני היה קבוצת קסנטטין. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66564/66564fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66564/66564fig02.jpg"> איור 2: אינטראקציה בין קסנטטין לחלבון Keap1 (PDB: 2FLU). (A) הייצוג הדו-ממדי של קשירת קסנטטין ל-Keap1. (B) הדמיה תלת-ממדית של קסנטטין וחלבון Keap1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66564/66564fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66564/66564fig03.jpg"> איור 3: השפעת קסנטטין על היציבות התרמית של חלבון Keap1. (A) ההשפעות של קסנטטין על היציבות התרמית של Keap1 זוהו על ידי CETSA. (B) הצפיפויות האופטיות של Keap1 נורמלו לאלה שהתקבלו ב-45°C. הנתונים מיוצגים כממוצע ± SD. ניתוח סטטיסטי בוצע על ידי ניתוח חד-כיווני של שונות (ANOVA חד-כיוונית). n = 3. *p &lt; 0.05, **p &lt; 0.01, p &lt; 0.001, p &lt; 0.0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66564/66564fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

הניסוי המשמש כאן מראה שיטה של עגינה מולקולרית בשילוב עם בדיקת שינוי תרמי תאי כדי לחזות ולאמת את האינטראקציה בין מולקולות קטנות למטרות חלבון.

Proteins are fundamental to human physiology, with their targets being crucial in research and drug development. The identification and validation of ...

המחקר שלנו מתמקד במטרות חלבון, חיזוי ותיקוף של תרכובות מולקולריות קטנות. הניסוי המשמש כאן מראה שיטה של עגינה מולקולרית בשילוב עם בדיקת שינוי תרמי דומה כדי לחזות ולאמת את האינטראקציה בין מולקולות קטנות ומטרות חלבון. שלבים אלה של CETSA הם מסובכים וכל שגיאות צעדים במהלך המבצע יכול להיות בעל השפעה רבה על התוצאות.הפרוטוקול שלנו משלב חיזוי עם אימות, ומפחית ביעילות הן את צריכת הזמן והן את העלויות הכלכליות. יתר על כן, קל לבחור את המכשירים והחומרים הניסיוניים. לבסוף, קל להכין את דגימות CETSA בבדיקה, מה שמבטיח את יכולת הייצור של הדגימות.

protein-target-prediction-and-validation-of-small-molecule-compound

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

הנחיות מחשב מבוסס אפיון מבניים ותפקודיים של חלבון באמצעות צינור I-TASSER מתואר. החל מ רצף חלבון השאילתה, מודלים 3D נוצרות באמצעות מערכים השחלה מרובים איטרטיבי סימולציות הרכבה המבני. מסקנות פונקציונלית נמשכים לאחר מכן מבוסס על התאמות לחלבונים עם מבנה ופונקציות ידוע.

פרוטוקול מבנה מחשב מבוסס חלבון חיזוי פונקציה

אנו מתארים כאן שיטה לזיהוי חלבונים קושרי מולקולות קטנים באמצעות תיוג פוטו-אפיניטי. היתרון בטכניקה זו הוא שקישור ותיוג קוולנטי של חלבוני המטרה מתרחש בסביבה התאית החיה, ומסיר את הסיכון לשיבוש מבנה החלבון המקומי ותנאי הקישור עם ליזיס התאים.

זיהוי של חלבונים קושרי מולקולה קטנים בסביבה נייד Native ידי תיוג Live- תא Photoaffinity

מחקר זה נועד להציג אסטרטגיה לזיהוי אינטראקציות תרופתיות פפטיד. האסטרטגיה כוללת ביופאנינג של פפטידים קצרים לזיהוי תרופות המבוססים על מיקרו-איזון של גביש קוורץ (QCM), ואחריו ניתוח ביואינפורמטיקה להערכת כמותיות של המידע המתקבל להכרה בסמים וביאור של אתרי איגוד התרופות בחלבונים.

ביו-panning מבוסס Biosensor ואסטרטגיית ניתוח ביואינפורמטיקה לאימות גלובלי של אינטראקציות עם חלבונים תרופתיים

הפרוטוקול הנוכחי מתאר אסטרטגיה משולבת לחקר המטרות והמנגנונים העיקריים של Fructus Phyllanthi נגד היפרליפידמיה המבוססת על חיזוי פרמקולוגיה של הרשת ואימות מטבולומי.

חיזוי פרמקולוגיה ברשת ותיקוף מטבולומיקה של מנגנון פרוקטוס פילנתי נגד היפרליפידמיה

אנו מתארים מתודולוגיה המבוססת על גיוון רצפים כדי להעריך את העדפות חומצות האמינו של אתרי קישור רב-ספציפיים באינטראקציות חלבון-חלבון (PPIs). באסטרטגיה זו, אלפי ליגנדים פפטידים פוטנציאליים נוצרים ומוקרנים בסיליקו, ובכך מתגברים על כמה מגבלות של שיטות ניסוי זמינות.

חיזוי חישובי של העדפות חומצות אמינו של תחומים קושרי פפטיד רב-ספציפיים המעורבים באינטראקציות חלבון-חלבון

פרוטוקול דו-לשוני זה מספק תהליך חישובי לגילוי תרופות שמעריך אינטראקציות חלבון-ליגנד של קינאזות דמויי פולו 1 עד 3 (PLK1–3) ותכונות ספיגה, הפצה, חילוף חומרים, הפרשה, רעילות ויציבות (ADMET-S) של מולקולות טבעיות שמקורן במסדי נתונים.

תהליך חישובי דו-לשוני לזיהוי מעכבי PLK1 פוטנציאליים בשפת הסימנים והאנגלית האמריקאית

העבודה הנוכחית מתארת פרוטוקול להפעלת אלגוריתם Pathway2Targets, סקריפט R המנבא ומתעדף מטרות טיפוליות על סמך פרופיל מסלולי איתות תוך-תאיים שנוצרו על ידי השוואת דגימות מקרה לעומת ביקורת מניסוי ריצוף RNA בתפזורת.

שימוש ברשימות גנים המתבטאות באופן דיפרנציאלי אנושי לביצוע ניתוח העשרה במורד הזרם ותעדוף יעד

מאמר זה מציג פרוטוקול לבניית מודל פרמקופור קונצנזוס על ידי שילוב תכונות מולקולריות ממספר ליגנדים. שיטה זו ישימה למאמצי גילוי תרופות המכוונים לכל מטרה ביולוגית עם קונפורמציות ידועות הקשורות לליגנד, ומאפשרת זיהוי של תכונות אינטראקציה מרכזיות לסינון וירטואלי ותכנון תרופות רציונלי.

מידול פרמקופור למטרות עם ספריות ליגנד נרחבות: מחקר מקרה על SARS-CoV-2 Mpro

מפוזר לשלוט מעכבות רעילים, הסיכום הזמני hyperalgesia בדיקות הפצע הם הפגינו החולה המיילדות. בדיקות אלו מעכבות להעריך מנגנוני הגירוי של עיבוד הכאב מנוצלים כאן כדי להעריך כאבים אנדוגני בכל נקודות זמן שונות במהלך ההריון ותקופת peripartum לעזור לחשוף את הסיכון של אדם לכאב מתמשך.

פרדיגמה ניסויית עבור חיזוי של הכאבים שלאחר הניתוח (PPOP)

אנו מתארים מודל עכברים של הפרעת פוסט טראומטית (PTSD) החושפת את השינויים המתמשכים בתפקוד נוירואנדוקריניים ותגובה המאוחרת לטווח ארוך, המוגזמת פחד, אופייניים לחולי PTSD. מודל החיה ושיטות שתוארו כאן הם שימושיים עבור correlating סמנים ביולוגיים בגרעיני מוח, שהם מכאניים אך לא ניתן למדוד בחולים, עם סמנים ביולוגיים בתאי דם לבן בפריפריה, שיכול.

סמנים ביולוגיים במודל חיה לחשיפה קושרת עצבית, המטולוגית, והתנהגות של PTSD

למד שיטה לחיזוי ואימות אינטראקציות בין מולקולות קטנות למטרות חלבוניות באמצעות docking מולקולרי ו-TSA. הפרוטוקול משפר שחזוריות ומפחית עלויות בביוכימיה וביולוגיה מבנית.

חיזוי ואימות מטרות חלבונים של תרכובת מולקולות קטנות

גלה סרטונים נוספים